3偶 聯(lián)的S1P1受體的激動(dòng)劑活性比對與Gail偶聯(lián)的S1P1受體的激動(dòng)劑活性高30倍以上的化合 物。
[0048] (9) S1P1受體激動(dòng)劑的篩選方法，
[0049]該方法包括：
[0050]工序(a)，測定被測化合物對與Gail偶聯(lián)的S1P1受體、與Gai2偶聯(lián)的S1P1受體和與 Ga i 3偶聯(lián)的S1P1受體的激動(dòng)劑活性，以及
[0051]工序(b)，選擇對與Gail偶聯(lián)的S1P1受體的激動(dòng)劑活性低于內(nèi)源性激動(dòng)劑S1P、且 對與Gai2偶聯(lián)的S1P1受體和與Gai3偶聯(lián)的S1P1受體中的至少一者的激動(dòng)劑活性高于內(nèi)源 性激動(dòng)劑S1P的化合物。
[0052]另外，關(guān)于本發(fā)明中的"S1P1受體"，在NCBI數(shù)據(jù)庫上其代表性氨基酸序列作為 NP001391.2注冊，對應(yīng)的mRNA的堿基序列作為NM001400.4注冊。
[0053]此外，關(guān)于"Gail (基因名是GNAI1)"，在NCBI數(shù)據(jù)庫上其代表的氨基酸序列作為 NP_002060.4注冊，對應(yīng)的mRNA的堿基序列作為NM002069.5注冊。
[0054]此外，關(guān)于"Gai2(基因名是GNAI2)"，在NCBI數(shù)據(jù)庫上其代表的氨基酸序列作為 NP_002061.1注冊，對應(yīng)的mRNA的堿基序列作為NM002070.2注冊。
[0055]此外，關(guān)于"Gai3(基因名是GNAI3)"，在NCBI數(shù)據(jù)庫上其代表的氨基酸序列作為 NP_006487.1注冊，對應(yīng)的mRNA的堿基序列作為NM006496.3注冊。
[0056]發(fā)明的效果
[0057]在以往的激動(dòng)劑活性的評價(jià)方法中，不能將S1P1受體激動(dòng)劑的主作用(有效性)和 副作用區(qū)別開來進(jìn)行評價(jià)。在本發(fā)明中，通過分成與S1P1受體偶聯(lián)的Ga蛋白的亞型(Gail、G ai2、Gai3)來檢測對S1P1受體的激動(dòng)劑活性，從而能夠?qū)1P1受體激動(dòng)劑的主作用和副作 用區(qū)別開來進(jìn)行評價(jià)。此外，由此能夠有效地篩選優(yōu)異的S1P1受體激動(dòng)劑。
【具體實(shí)施方式】
[0058]〈評價(jià)S1P1受體激動(dòng)劑的免疫抑制活性的強(qiáng)度的方法〉
[0059] 本發(fā)明提供評價(jià)S1P1受體激動(dòng)劑的免疫抑制活性的強(qiáng)度的方法。在本實(shí)施例中發(fā) 現(xiàn)，S1P1受體激動(dòng)劑的免疫抑制活性的強(qiáng)度與對與Gai2偶聯(lián)的S1P1受體或與Gai3偶聯(lián)的 S1P1受體的激動(dòng)劑活性相關(guān)。因此，本發(fā)明的評價(jià)方法是以S1P1受體激動(dòng)劑對與Gai2偶聯(lián) 的S1P1受體和與Gai3偶聯(lián)的S1P1受體中的至少一者的激動(dòng)劑活性作為指標(biāo)的方法。
[0060] 對于本發(fā)明中的"免疫抑制活性"，例如，可以以循環(huán)淋巴細(xì)胞數(shù)下降作為指標(biāo)進(jìn) 行掌控。對于循環(huán)淋巴細(xì)胞數(shù)，例如，可以通過本實(shí)施例2中記載的方法測定。
[0061] 本發(fā)明中的Gai的亞型特異性的激動(dòng)劑活性的測定可以通過例如，本實(shí)施例1(2) 中記載的方法(非專利文獻(xiàn)7中記載的方法)進(jìn)行。即，使S1P1受體和特定的Ga亞型與Gy 2和 Gi31-起在細(xì)胞中表達(dá)，以由S1P1受體激動(dòng)劑引起的Ga蛋白與邱γ蛋白的分離率作為指標(biāo)， 可以測定激動(dòng)劑活性。
[0062]此外，已知通常如果激動(dòng)劑刺激S1Ρ1受體，則細(xì)胞內(nèi)cAMP量被向減少的方向調(diào)節(jié)。 因此，例如，使用共表達(dá)S1P1受體和特定的Gai亞型的細(xì)胞，以在通過毛喉素等使細(xì)胞內(nèi) cAMP量上升的條件下、由S1P1受體激動(dòng)劑引起的cAMP量的減少作為指標(biāo)，也能夠測定Gai亞 型特異性的激動(dòng)劑活性。
[0063]此外，如果細(xì)胞變形，則在單層膜上形成的電阻值發(fā)生變化。已知利用該現(xiàn)象，在 膜上以單層培養(yǎng)表達(dá)S1P受體的細(xì)胞，測定由于添加 S1P1受體激動(dòng)劑而產(chǎn)生的電阻值的變 化的方法（Invest Ophthalmol Vis Sci.2005Jun;46(6):1927_33·)?；谠摲椒?，例如，在 膜上培養(yǎng)共表達(dá)S1P1受體和特定的Ga亞型的細(xì)胞，以由于添加 S1P1受體激動(dòng)劑而產(chǎn)生的電 阻值的變化作為指標(biāo)，也能夠測定Gai亞型特異性的激動(dòng)劑活性。
[0064]此外，通常已知使表達(dá)GPCR的細(xì)胞膜、化合物和γ -[35S]GTP在緩沖液中進(jìn)行反 應(yīng)，以結(jié)合在膜上的標(biāo)記體的量作為激動(dòng)劑的活性值進(jìn)行定量的方法（Life Science Volume 74，Issue 4，12December 2003，Pages 489-508)。因此，例如，使用共表達(dá)S1P1 受體 和特定的Gai亞型的細(xì)胞膜，以由于GTP交換反應(yīng)γ _[35S]GTP向膜部分的蓄積作為指標(biāo)，也 能夠測定Gai亞型特異性的激動(dòng)劑活性。
[0065]在本發(fā)明的一種方式中，測定S1P1受體激動(dòng)劑對與Gai2偶聯(lián)的S1P1受體和與Gai3 偶聯(lián)的s 1P1受體的激動(dòng)劑活性，在S1P1受體激動(dòng)劑對與Ga i 2偶聯(lián)的S1P1受體和與Ga i 3偶聯(lián) 的S1P1受體的激動(dòng)劑活性高于對與Ga i 1偶聯(lián)的S1P1受體的激動(dòng)劑活性的情況下，評價(jià)為 S1P1受體激動(dòng)劑能夠發(fā)揮強(qiáng)的免疫抑制活性。
[0066]優(yōu)選對與Gai2偶聯(lián)的S1P1受體和與Gai3偶聯(lián)的S1P1受體的激動(dòng)劑活性，是對與Ga il偶聯(lián)的S1P1受體的激動(dòng)劑活性的10倍以上，更優(yōu)選是20倍以上，進(jìn)一步優(yōu)選是30倍以上。 [0067]此外，在本發(fā)明的另一方式中，測定S1P1受體激動(dòng)劑對與Gai2偶聯(lián)的S1P1受體和 與Gai3偶聯(lián)的S1P1受體的激動(dòng)劑活性，在S1P1受體激動(dòng)劑對與Gai2偶聯(lián)的S1P1受體和與Ga i3偶聯(lián)的S1P1受體中的至少一者的激動(dòng)劑活性高于內(nèi)源性激動(dòng)劑SIP的情況下，評價(jià)為 S1P1受體激動(dòng)劑能夠發(fā)揮強(qiáng)的免疫抑制活性。
[0068] 成為對照的內(nèi)源性激動(dòng)劑S1P的激動(dòng)劑活性可以在測定S1P1受體激動(dòng)劑的激動(dòng)劑 活性時(shí)測定，也可以使用預(yù)先測定的值。例如，在利用本實(shí)施例1(2)中記載的方法(非專利 文獻(xiàn)7中記載的方法)進(jìn)行測定時(shí)，在對與Gai2偶聯(lián)的S1P1受體的激動(dòng)劑活性的EC50值(nM) 為14以下的情況、或者對與Gai3偶聯(lián)的S1P1受體的激動(dòng)劑活性的EC50值(nM)為8以下的情 況下，評價(jià)為S1P1受體激動(dòng)劑能夠發(fā)揮強(qiáng)的免疫抑制活性。
[0069] 〈評價(jià)S1P1受體激動(dòng)劑產(chǎn)生心臟毒性的容易程度的方法〉
[0070] 本發(fā)明提供評價(jià)S1P1受體激動(dòng)劑產(chǎn)生心臟毒性的容易程度的方法。在本實(shí)施例中 發(fā)現(xiàn)，S1P1受體激動(dòng)劑的心臟毒性產(chǎn)生的容易程度與對與Gail偶聯(lián)的S1P1受體的激動(dòng)劑活 性相關(guān)。因此，本發(fā)明的評價(jià)方法以S1P1受體激動(dòng)劑對與Gail偶聯(lián)的S1P1受體的激動(dòng)劑活 性作為指標(biāo)。
[0071 ]本發(fā)明中的"心臟毒性"可以將例如，AV傳導(dǎo)阻滯、心率下降作為指標(biāo)進(jìn)行掌控。AV 傳導(dǎo)阻滯可以通過例如，本實(shí)施例3中記載的方法進(jìn)行測定。此外，本發(fā)明中的Gai的亞型特 異性的激動(dòng)劑活性的測定的方法如上所述。
[0072]在本發(fā)明的一種方式中，測定S1P1受體激動(dòng)劑對與Gai 1偶聯(lián)的S1P1受體的激動(dòng)劑 活性，在S1P1受體激動(dòng)劑對與Gail偶聯(lián)的S1P1受體的激動(dòng)劑活性低于對與Gai2偶聯(lián)的S1P1 受體和與Gai3偶聯(lián)的S1P1受體的激動(dòng)劑活性的情況下，評價(jià)為S1P1受體激動(dòng)劑不易產(chǎn)生心 臟毒性。
[0073]優(yōu)選對與Gail偶聯(lián)的S1P1受體的激動(dòng)劑活性是對與Gai2偶聯(lián)的S1P1受體和與Ga i3偶聯(lián)的S1P1受體的激動(dòng)劑活性的10分之1以下，更優(yōu)選為20分之1以下，進(jìn)一步優(yōu)選為30 分之1以下。
[0074]此外，在本發(fā)明的另一方式中，測定S1P1受體激動(dòng)劑對與Ga i 1偶聯(lián)的S1P1受體的 激動(dòng)劑活性，在S1P1受體激動(dòng)劑對與Gai 1偶聯(lián)的S1P1受體的激動(dòng)劑活性低于內(nèi)源性激動(dòng)劑 S1P的情況下，評價(jià)為S1P1受體激動(dòng)劑不易產(chǎn)生心臟毒性。
[0075]作為對照的內(nèi)源性激動(dòng)劑S1P的激動(dòng)劑活性可以在測定S1P1受體激動(dòng)劑的激動(dòng)劑 活性時(shí)測定，也可以使用預(yù)先測定的值。例如，在利用本實(shí)施例1(2)中記載的方法(非專利 文獻(xiàn)7中記載的方法)進(jìn)行測定時(shí)，在對與Gail偶聯(lián)的S1P1受體的激動(dòng)劑活性的EC50值(nM) 高于261的情況下，評價(jià)為S1P1受體激動(dòng)劑不易產(chǎn)生心臟毒性。
[0076] 〈S1P1受體激動(dòng)劑的篩選方法〉
[0077] 本發(fā)明提供S1P1受體激動(dòng)劑的篩選方法。在本實(shí)施例中，明確了S1P1受體激動(dòng)劑 的免疫抑制活性與對表達(dá)S1P1受體與Gai2或Gai3的組合的細(xì)胞的選擇性相關(guān)，S1P1受體激 動(dòng)劑的心臟毒性與對表達(dá)S1P1受體與Gail的組合的細(xì)胞的選擇性相關(guān)。本發(fā)明的篩選方法 是利用這樣的相關(guān)的方法。
[0078] 對用于篩選的被測化合物無特別限制，例如，可以使用合成低分子化合物文庫、基 因文庫的表達(dá)產(chǎn)物、肽文庫、抗體、細(xì)菌釋放物質(zhì)、細(xì)胞(微生物、植物細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞）的提 取液和培養(yǎng)上清、純化或部分純化多肽、海洋生物、源自植物或動(dòng)物的提取物、噬菌體展示 隨機(jī)肽文庫。此外，檢測Gai的亞型特異性的激動(dòng)劑活性的方法如上所述。
[0079]在本發(fā)明的一種方式中，測定被測化合物對與Gail偶聯(lián)的S1P1受體、與Gai2偶聯(lián) 的S1P1受體和與Gai3偶聯(lián)的S1P1受體的激動(dòng)劑活性，選擇對與Gai2偶聯(lián)的S1P1受體和與Ga i 3偶聯(lián)的S1P1受體的激動(dòng)劑活性高于對與Ga i 1偶聯(lián)的S1P1受體的激動(dòng)劑活性的化合物。 [0080]優(yōu)選選擇對與Gai2偶聯(lián)的S1P1受體和與Gai3偶聯(lián)的S1P1受體的激動(dòng)劑活性高于 對與Gail偶聯(lián)的S1P1受體的激動(dòng)劑活性10倍以上的化合物，更優(yōu)選選擇高20倍以上的化合 物，進(jìn)一步優(yōu)選選擇高30倍以上的化合物。
[0081 ]此外，在本發(fā)明另一方式中，測定被測化合物對與Gail偶聯(lián)的S1P1受體、與Gai2偶 聯(lián)的S1P1受體和與Gai3偶聯(lián)的S1P1受體的激動(dòng)劑活性，選擇對與Gail偶聯(lián)的S1P1受體的激 動(dòng)劑活性低于