一種用于研究阿片類藥物外周給藥鎮(zhèn)痛作用機(jī)制的大鼠關(guān)節(jié)疼痛和局部注射動物模型的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種用于研究阿片類藥物外周給藥鎮(zhèn)痛作用機(jī)制的大鼠關(guān)節(jié)疼痛和 局部注射動物模型的構(gòu)建方法，屬于醫(yī)學(xué)動物模型研究領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 四肢關(guān)節(jié)炎癥疼痛是臨床常見癥狀，病因復(fù)雜，幾乎覆蓋全年齡段各類人群，在退 變性骨關(guān)節(jié)疾病高發(fā)的中老年患者群體中發(fā)病率高，可導(dǎo)致嚴(yán)重運(yùn)動功能障礙，是導(dǎo)致老 年致殘、失去自主生活能力的重要原因。目前臨床無特效治療手段，對疼痛嚴(yán)重患者需行人 工關(guān)節(jié)置換手術(shù)治療，費(fèi)用高且損傷大，術(shù)中術(shù)后危及生命的并發(fā)癥多。但是，患者如疼痛 控制良好，則一般不需手術(shù)治療。因此，開發(fā)適合長期應(yīng)用的關(guān)節(jié)疼痛鎮(zhèn)痛方案，是骨關(guān)節(jié) 外科臨床重點研究方向?，F(xiàn)今臨床上主要應(yīng)用的鎮(zhèn)痛方法為口服非醬體類抗炎藥或阿片類 藥物。其中非醬體類抗炎藥長期應(yīng)用后患者不良反應(yīng)發(fā)生率高，包括危及生命的并發(fā)癥如 嚴(yán)重胃腸道潰瘍、屯、血管疾病、凝血功能障礙等?？诜⑵愃幬镫m然相對安全，但患者嚴(yán) 重惡屯、、嘔吐及便秘發(fā)生率高，一般無法耐受。
[0003] 近年臨床研究發(fā)現(xiàn)，嗎啡等阿片類藥物局部注射可能提供良好的關(guān)節(jié)鎮(zhèn)痛作用 (參見文獻(xiàn)：Garcia JB, Barbosa Neto J0, Vasconcelos JW, et al. Analgesic effic曰cy of the intr曰-曰rticul曰r 曰dministr曰tion of high doses of morphine in patients undergoing total knee arthroplasty. Rev Bras Anestesiol. 2010:60(1): 1-12.)，局部注射可減少全身不良反應(yīng)，能夠避免口服或注射非醬體類藥物可能導(dǎo)致的消 化系統(tǒng)和屯、血管系統(tǒng)并發(fā)癥，適合反復(fù)長期應(yīng)用。局部麻醉藥物或激素類藥物外周注射鎮(zhèn) 痛效果亦較好，但與阿片類藥物相比，局部麻醉藥物和激素類藥物存在明顯的軟骨細(xì)胞毒 性及肌肉骨骼干細(xì)胞毒性問題，并不適合反復(fù)或長期應(yīng)用（參見文獻(xiàn):Gungor I，Yilmaz A, Ozturk AM, et 曰1. Bupiv曰c曰ine and levobupiv曰c曰ine induce apoptosis in rat chondrocyte cell cultures at ultra-low doses. Eur J Orthop Surg Traumatol. 2014; 24(3) :291-295.)。阿片類藥物外周注射給藥有效且安全性高（參見文獻(xiàn)： Ficklscherer A, Kreuz PC, Sievers B, et al. Fentanyl is less toxic on adult human mesenchymal stem cells compared to ropivacaine when used intraarticularly. A controlled in vitro study. Connect Tissue Res. 2013;54 (6) :403-407.),但是，經(jīng)關(guān)節(jié)周圍局部注射的阿片類藥物，體內(nèi)發(fā)揮作用機(jī)制不同于口服 或靜脈等全身給藥方式，全身給藥時主要通過激活中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)阿片類受體產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作 用。由于關(guān)節(jié)周圍存在大量的外周阿片類受體，局部注射阿片類藥物后，其產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用的 途徑將發(fā)生變化。因此，經(jīng)關(guān)節(jié)周圍局部注射的阿片類藥物，通過何種機(jī)制發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用、 如何決定最佳注射劑量、藥物配伍和應(yīng)用頻次，尚缺少深入有效的基礎(chǔ)研究，尚未建立起專 用的在體動物模型進(jìn)行全面科學(xué)的臨床前研究。
[0004] 單艦醋酸鋼生理鹽水注射液可用于建立大鼠等膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎動物模型，可良 好的模擬臨床骨性關(guān)節(jié)炎癥狀和病理表現(xiàn)(參見文獻(xiàn):Kim JK, Kim ΤΗ, Park SW, et al. Protective effects of human pi曰cent曰 extract on cartilage degradation in experimental osteoarthritis. Biol Pharm Bull. 2010;33(6):1004-10.)。但在造模過 程中因?qū)嶒瀯游镄?，膝關(guān)節(jié)給藥困難，實際應(yīng)用的失敗率較高。本發(fā)明改進(jìn)傳統(tǒng)注射部位， 選擇踩關(guān)節(jié)注射，使注射操作簡便易行，同時保證在動物模型中良好復(fù)制臨床關(guān)節(jié)炎癥的 疼痛癥狀，尚未有相關(guān)報道。此外，本發(fā)明所選擇關(guān)節(jié)周圍鎮(zhèn)痛藥物注射部位給藥方便，重 復(fù)性良好，尚無報道上述實驗技術(shù)在阿片類藥物外周鎮(zhèn)痛作用機(jī)制研究中的應(yīng)用。
[0005] 綜上，建立起真實反應(yīng)臨床上阿片類藥物關(guān)節(jié)周圍注射治療關(guān)節(jié)炎癥疼痛的在體 動物模型，對深入研究阿片類藥物在關(guān)節(jié)炎癥疼痛治療中的作用機(jī)制有重要意義，將加快 研究進(jìn)程，明確阿片類藥物局部應(yīng)用在臨床上發(fā)揮關(guān)節(jié)鎮(zhèn)痛作用的潛在機(jī)制及鎮(zhèn)痛療效。 本發(fā)明制備的關(guān)節(jié)炎癥疼痛模型簡便易行，重復(fù)性及穩(wěn)定性良好，為臨床開發(fā)適合長期應(yīng) 用且無嚴(yán)重不良反應(yīng)的關(guān)節(jié)鎮(zhèn)痛治療方法提供條件。隨著相關(guān)技術(shù)的不斷更新和發(fā)展，研 究者對阿片類藥物局部應(yīng)用的認(rèn)識和理解將愈加深入和透徹，將更好改進(jìn)當(dāng)前用藥方案， 造?；颊吆蜕鐣?br>
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種簡便易行、對技術(shù)設(shè)備要求低而制備成功率高、能夠 真實模擬臨床阿片類藥物局部注射后治療關(guān)節(jié)炎癥疼痛情況的動物模型的構(gòu)建方法。
[0007] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種用于研究阿片類藥物外周給藥鎮(zhèn)痛作用機(jī) 制的大鼠關(guān)節(jié)疼痛和局部注射動物模型的構(gòu)建方法，包括:（1)單艦醋酸鋼踩關(guān)節(jié)注射誘導(dǎo) 實驗動物關(guān)節(jié)炎癥疼痛癥狀;（2)實驗動物關(guān)節(jié)周圍阿片類藥物注射。
[0008] 其中，步驟（1)中，采用雄性大鼠，體重質(zhì)量200 ±20克，麻醉，取單艦醋酸鋼生理鹽 水溶液，在實驗組和對照組大鼠后足墊部向踩關(guān)節(jié)方向注射，劑量為60化/只，即可制備大 鼠關(guān)節(jié)疼痛模型。
[0009] 所述單艦醋酸鋼生理鹽水溶液中，單艦醋酸鋼濃度為60mg/mL，每1ml生理鹽水溶 液中含單艦醋酸鋼60mg，經(jīng)足后墊行踩關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射，用于誘導(dǎo)大鼠關(guān)節(jié)疼痛癥狀。
[0010] 所述雄性大鼠為雄性Wistar大鼠或Sprague-Dawley大鼠。
[0011] 步驟(2)中，實驗組關(guān)節(jié)周圍注射的藥物為鹽酸嗎啡注射液巧mg/kg)，或鹽酸曲馬 多注射液，或其它注射用阿片類藥物注射液，對照組關(guān)節(jié)周圍注射安慰劑為與實驗組等體 積生理鹽水。
[001引注射部位為大鼠膝關(guān)節(jié)后外側(cè)，用惜小頭下方約5mm處，局部解剖位置在腔，脾骨 間隙中，深度應(yīng)達(dá)肌筋膜層。
[0013] 對如上注射了阿片類藥物的動物疼痛癥狀行為學(xué)、血清學(xué)及分子生物學(xué)相關(guān)指標(biāo) 進(jìn)行檢測。
[0014] 在動物模型制備成功后4小時，完成行為學(xué)評估和痛闊測量后，對實驗組和對照組 動物作靜脈采血后處死，對動物血清學(xué)相關(guān)炎癥指標(biāo)進(jìn)行鑒定。
[0015] 行為學(xué)評估內(nèi)容：單艦醋酸鋼生理鹽水溶液注射后24小時，定性觀察大鼠是否出 現(xiàn)Ξ足販行和踩關(guān)節(jié)紅腫癥狀，確定關(guān)節(jié)炎癥疼痛模型造模成功。確定造模成功后，行實驗 組鹽酸嗎啡注射液和對照組生理鹽水注射。注射后4小時開始，定量記錄大鼠30分鐘內(nèi)祿咬 右后足次數(shù)并行統(tǒng)計分析。
[0016] 痛闊測量:單艦醋酸鋼生理鹽水溶液注射后，W及阿片類藥物與生理鹽水注射后， 分別W福射熱燈照射測量痛闊。測試中于室溫下將大鼠置于熱福射儀專用容器內(nèi)，靜置15 分鐘后，W強(qiáng)光照射踩關(guān)節(jié)模擬熱損傷，W大鼠的縮爪反射潛伏期為觀察指標(biāo)，W左右兩側(cè) 踩關(guān)節(jié)的潛伏期差值為痛敏分?jǐn)?shù)，每間隔10分鐘測定一次，取3次測定平均值作為測定結(jié) 果，評估實驗組和對照組動物測量結(jié)果是否存在統(tǒng)計學(xué)差異。
[0017] 生物化學(xué)檢測項目包括但不僅限于血清炎癥因子白介素1-UIL-1)和腫瘤壞死因 子-a(TNF-a)，亦可進(jìn)行基因及蛋白表達(dá)水平檢測。選擇的疼痛相關(guān)炎癥因子在關(guān)節(jié)炎癥疼 痛的病理過程中濃度增加，阿片類藥物產(chǎn)生良好鎮(zhèn)痛作用同時可伴隨炎癥因子檢測值的下 降。
[0018] 采用本發(fā)明的方法，通過在大鼠踩關(guān)節(jié)注射單艦醋酸鋼生理鹽水溶液誘導(dǎo)關(guān)節(jié)疼 痛后，進(jìn)行關(guān)節(jié)周圍阿片類藥物嗎啡局部注射發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用，建立了一種用于研究阿片類 藥物外周給藥鎮(zhèn)痛作用機(jī)制的大鼠關(guān)節(jié)疼痛和局部注射動物模型，有效模擬了臨床上外周 局部應(yīng)用阿片類藥物后產(chǎn)生關(guān)節(jié)疼痛鎮(zhèn)痛療效的真實情況，發(fā)現(xiàn)采用本發(fā)明方法獲得的動 物模型符合臨床實際且穩(wěn)定性高，從而為進(jìn)一步了解阿片類藥物關(guān)節(jié)周圍局部注射對關(guān)節(jié) 炎癥疼痛的鎮(zhèn)痛機(jī)制，W及探究和改進(jìn)臨床用藥方案提供了動物模型。同時，該方法操作簡 易，技術(shù)設(shè)備要求低，成功率高。
【附圖說明】
[0019] 圖1為動物模型構(gòu)建和鎮(zhèn)