利用哌嗪修飾的還原性氧化石墨烯修飾工作電極構(gòu)建的用于檢測(cè)dna堿基的生物傳感器的制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于DNA堿基檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用哌嗪修飾的還原性氧化石墨烯修飾電極構(gòu)建的生物傳感器檢測(cè)DNA堿基的新方法。
【背景技術(shù)】
[0002]堿基是核酸分子的主要組成部分，核酸分析在生物化學(xué)和分子生物學(xué)研究中有著極為重要的意義，廣泛應(yīng)用于傳染病、流行病、腫瘤和遺傳性疾病的臨床檢測(cè)、環(huán)境監(jiān)控等方面。電化學(xué)因其操作簡(jiǎn)便、快速、靈敏等特性而受到國(guó)內(nèi)外科研人士的廣泛認(rèn)可，運(yùn)用電化學(xué)的方法進(jìn)行核酸分析更是成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。
[0003]核酸分子中的腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、鳥嘌呤(G)和胞嘧啶(C)在儲(chǔ)存遺傳信息和蛋白質(zhì)的生物合成中扮演著重要角色。在DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中嘌呤與嘧啶的比值介于0.8 -1.0之間，比值異常和癌癥、衰老等一些疾病密切聯(lián)系。此外，一些肉類尤其是牛肉，新鮮的海洋食物和豆科植物中富含嘌呤體。然而，大量的肉類物質(zhì)攝入會(huì)增加痛風(fēng)、高尿血癥等一些疾病的發(fā)病率。依據(jù)Watson-Crick的堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，DNA中嘌呤和嘧啶濃度是相匹配的，由此看來(lái)，簡(jiǎn)單有效測(cè)定DNA樣品中堿基濃度是十分必要的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)缺陷，提供一種利用哌嗪修飾的還原性氧化石墨烯修飾工作電極構(gòu)建的用于檢測(cè)DNA堿基的生物傳感器。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
一種利用哌嗪修飾的還原性氧化石墨烯修飾工作電極構(gòu)建的用于檢測(cè)DNA堿基的生物傳感器，該生物傳感器包括工作電極、輔助電極和參比電極，其中，所述工作電極為哌嗪修飾的還原性氧化石墨稀修飾的玻碳電極，其經(jīng)下述步驟獲得:
1)將殼聚糖溶液和哌嗪修飾的還原性氧化石墨烯溶液等體積混合后，超聲分散0.5-lh，然后靜置1 一 3h獲得復(fù)合材料，再次超聲震蕩、漩渦分散均勻后，滴加到潔凈的玻碳電極表面，晾干成膜；
2)在步驟1)所得玻碳電極的膜表面滴加全氟磺酸溶液，晾干成膜，即得。
[0006]具體的，步驟1)中，所述殼聚糖溶液濃度為0.5wt%，呢嘆修飾的還原性氧化石墨稀溶液濃度為4mg/ml。
[0007]目前為止，有很多用于測(cè)定堿基的方法，如高性能液相色譜法、離子對(duì)高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳法、流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光光譜法等，這些方法均存在費(fèi)時(shí)、成本高、靈敏度低、預(yù)處理過(guò)程復(fù)雜等缺點(diǎn)。電化學(xué)分析方法提供了方便、快捷的方式來(lái)檢測(cè)堿基且價(jià)格低廉，靈敏度高。DNA的氧化性損傷一般發(fā)生在嘌呤堿基上，其中鳥嘌呤因具有最低氧化電位而最容易被氧化。結(jié)合納米材料及一些生物大分子成功構(gòu)建出了生物傳感器，實(shí)現(xiàn)了不同堿基的電化學(xué)氧化過(guò)程;通過(guò)電化學(xué)測(cè)定:不同堿基都有其相對(duì)應(yīng)的氧化電位，不同濃度堿基所檢測(cè)到的電流存在差異，這就是本發(fā)明DNA樣品中堿基測(cè)定的主線。
[0008]哌嗪修飾的還原性氧化石墨烯是一種功能化納米材料，因其具有高的熱導(dǎo)率、良好的機(jī)械強(qiáng)度、高比表面積等優(yōu)點(diǎn)而受到科研人員的關(guān)注。本發(fā)明選取哌嗪修飾的還原性氧化石墨烯為主導(dǎo)材料修飾的電化學(xué)工作電極，從而實(shí)現(xiàn)DNA堿基在電極上的電化學(xué)氧化，達(dá)到堿基測(cè)定的目的。
[0009]和現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果:
本發(fā)明是以納米材料呢嘆修飾的還原性氧化石墨稀(rGO-NH)為基體修飾工作電極構(gòu)建了一種新型的納米生物傳感器，實(shí)現(xiàn)了脫氧核糖核酸堿基的電化學(xué)檢測(cè)。其中，工作電極的構(gòu)建是通過(guò)哌嗪修飾的還原性氧化石墨烯與殼聚糖(CHI)特定條件下自組裝修飾并用全氟磺酸(Naf1n)修飾加以牢固而獲得。本發(fā)明成功構(gòu)建出了穩(wěn)定且高效的新型生物傳感器，結(jié)合堿基的電化學(xué)氧化過(guò)程可以實(shí)現(xiàn)對(duì)脫氧核糖核酸堿基進(jìn)行單獨(dú)或同時(shí)檢測(cè)，并且具有較寬的線性檢測(cè)范圍、較低的檢測(cè)限、較高的靈敏度、且干擾反應(yīng)少、反應(yīng)條件溫和，還能夠?qū)崿F(xiàn)實(shí)際樣品中堿基的檢測(cè)。
【附圖說(shuō)明】
[0010]圖1為實(shí)施例1中哌嗪修飾的還原性氧化石墨烯修飾的玻碳電極的構(gòu)建示意圖；
圖2為固定鳥嘌呤(G)濃度25μΜ，胸腺嘧啶(T)濃度250μΜ，腺嘌呤(A)濃度從0 — 400μΜ的差分脈沖伏安測(cè)定結(jié)果；
圖3為固定腺嘌呤(Α)濃度20μΜ，胸腺嘧啶(Τ)濃度200μΜ，鳥嘌呤(G)濃度從0 — 200μΜ的差分脈沖測(cè)定結(jié)果；
圖4為固定腺嘌呤(Α)濃度25μΜ，鳥嘌呤(G)濃度25μΜ，胸腺嘧啶(Τ)濃度從0 — 2000μΜ的差分脈沖測(cè)定結(jié)果；
圖5為小牛胸腺DNA和鯡魚精子DNA的測(cè)定結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0011]以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步地詳細(xì)介紹，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此。
[0012]下述實(shí)施例中，殼聚糖購(gòu)自生工生物(上海)股份有限公司。哌嗪修飾的還原性氧化石墨烯購(gòu)自南京先豐納米材料科技有限公司(rGO-NH)。全氟磺酸溶液(Naf1n溶液)，也稱作全氟磺酸原液，購(gòu)自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司。
[0013]0.5%殼聚糖溶液的配制:稱取50mg殼聚糖粉末加入到10ml含1￥%醋酸的雙蒸水溶液中，攪拌至完全溶解，用微量大濃度氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)其pH至5?6，分裝備用。
[0014 ] 4m g /m 1呢嘆修飾的還原性氧化石墨稀溶液的配制:稱取4m g呢嘆修飾的還原性氧化石墨烯超聲分散于lml雙蒸水中，可采用超聲與漩渦震蕩混合進(jìn)行，以保證其充分分散。
[0015]玻碳電極的清潔處理:分別使用粒徑為lμm、0.3μm、0.05μm的三氧化二鋁對(duì)玻碳電極表面進(jìn)行打磨，打磨至呈鏡面，依次在75V%Z醇溶液、雙蒸水中進(jìn)行震蕩清洗，取出。利用電化學(xué)工作站三電極體系(輔助電極為鉑電極，參比電極為Ag/AgCl電極，工作電極為玻碳電極)觀察其循環(huán)伏安曲線。具體為:將初步清洗過(guò)的玻碳電極置于含100mM、pH 7.0的PBS緩沖液(即磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉)中，連接三電極，打開CHI 650C電化學(xué)工作站，選取循環(huán)伏安法(設(shè)定參數(shù):電壓范圍為-ο.1V?1.8V，掃描速度為50mV/s，四個(gè)循環(huán))開始循環(huán)伏安掃描，觀察其循環(huán)伏安圖譜，若無(wú)雜峰說(shuō)明清洗干凈，取出，雙蒸水沖洗后放入干燥皿中備用。
[0016]實(shí)施例1
如圖1所示，一種利用哌嗪修飾的還原性氧化石墨烯修飾工作電極構(gòu)建的用于檢測(cè)DNA堿基的生物傳感器，該生物傳感器包括工作電極、輔助電極(鉑電極)和參比電極(Ag/AgCl電極)，其中，所述工作電極為呢嘆修飾的還原性氧化石墨稀修飾的玻碳電極，其經(jīng)下述步驟獲得:
1)將0.5%殼聚糖溶液和4mg/ml哌嗪修飾的還原性氧化石墨烯溶液等體積(5yL)混合后，超聲分散約0