專利名稱：：一種側(cè)面組裝的金納米棒標(biāo)記抗體定量檢測(cè)氨芐青霉素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種側(cè)面組裝的金納米棒標(biāo)記抗體定量檢測(cè)氨芐青霉素的方法，屬于免疫檢測(cè)
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：氨芐青霉素是半合成的青霉素，是在青霉素G側(cè)鏈羧基的a位引入氨基，改變了它的極性，使其更容易透過細(xì)菌細(xì)胞膜，擴(kuò)大了抗菌譜，結(jié)構(gòu)為氨芐青霉素耐酸不耐酶，內(nèi)服或肌肉注射均易吸收，對(duì)大多數(shù)革蘭氏陽性菌的效力不如青霉素。特點(diǎn)是對(duì)革蘭氏陰性菌，如大腸埃希菌、變形桿菌、沙門菌等均有較強(qiáng)的作用。同時(shí)它具有耐酸的特征，避免了天然青霉素不宜內(nèi)服的缺點(diǎn)，這就為臨床給藥提供了很大的方便，在臨床上得以廣泛應(yīng)用。主要用于上述敏感菌所致的呼吸道感染、胃腸道感染、尿路感染、軟組織感染、腦膜炎、敗血癥、心內(nèi)膜炎等。氨芐青霉素臨床不良反應(yīng)主要以過敏性皮疹、過敏性休克和胃腸道反應(yīng)為主。氨芐青霉素是治療奶牛和其他食用動(dòng)物疾病的常用藥物之一，殘留在動(dòng)物性食品中的氨芐青霉素類藥物會(huì)對(duì)人體、環(huán)境造成巨大的危害，目前迫切需要開發(fā)快速、廉價(jià)、易于操作的檢測(cè)方法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。當(dāng)今國際上常用的氨芐青霉素殘留檢測(cè)的方法有微生物法、色譜法、免疫分析法等。微生物檢測(cè)的靈敏度不高且時(shí)間消耗長(zhǎng)，而儀器分析方法不僅需要昂貴的儀器設(shè)備，對(duì)操作人員的要求也比較高，需要經(jīng)過復(fù)雜的樣品前處理才能進(jìn)行。國外早已經(jīng)開展了對(duì)氨芐青霉素抗生素免疫分析方法的研究，常用的方法為酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)、放射免疫法(RIA)和熒光免疫測(cè)定法(FIA等)，其中ELISA最為常用，這類方法是將包被原包被酶標(biāo)板，加入藥物及抗藥物抗體，再加入酶標(biāo)二抗，即檢測(cè)抗體，最后加入底物顯色，一定時(shí)間后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)某一特定波長(zhǎng)的吸光度值，根據(jù)已知標(biāo)準(zhǔn)品含量計(jì)算樣品中待測(cè)藥物的濃度，此操作也存在繁瑣，費(fèi)時(shí)的缺點(diǎn)。激光粒度儀(Dynamiclightscattering,DLS)技術(shù)由于可以用來對(duì)膠體、納米顆粒和蛋白質(zhì)進(jìn)行的快速檢測(cè)，通過測(cè)量其尺寸、多分散性以及zeta電位，優(yōu)化其穩(wěn)定性與儲(chǔ)存能力，判斷蛋白質(zhì)是否聚集；篩選最優(yōu)化的結(jié)晶條件；并可對(duì)僅2iiL的樣品進(jìn)行寡聚物研究，僅需幾納克的原料物質(zhì)。對(duì)于金納米棒而言，其組裝的大小可以用激光粒度儀來測(cè)順3定。國內(nèi)目前為止尚未見有利用金納米棒的激光粒度儀的信號(hào)達(dá)到對(duì)體外目標(biāo)物檢測(cè)的報(bào)道，本發(fā)明彌補(bǔ)了這一空白。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種具有高靈敏性、特異性、準(zhǔn)確度、操作方法簡(jiǎn)單并快速的金納米棒標(biāo)記抗體側(cè)面組裝的免疫檢測(cè)方法，用于氨芐青霉素殘留的快速檢測(cè)。本發(fā)明的技術(shù)方案一種側(cè)面組裝的金納米棒標(biāo)記抗體定量檢測(cè)氨芐青霉素的方法，首先分別將氨芐青霉素抗體及包被原修飾到金納米棒上去，再加氨芐青霉素標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)上清液，氨芐青霉素標(biāo)準(zhǔn)品與包被原競(jìng)爭(zhēng)修飾在金納米棒上的抗體，隨著加入的氨芐青霉素標(biāo)準(zhǔn)品的量的不同，所形成的抗體與包被原的金納米棒的側(cè)面組裝的免疫聚合物的粒徑大小不同，由此用激光粒度儀進(jìn)行檢測(cè)而完成對(duì)含氨芐青霉素待測(cè)樣品的檢測(cè)；步驟為(1)氨芐青霉素抗體及包被原與金納米棒的偶聯(lián)a.抗體與金納米棒偶聯(lián)0.5mL、100iig/mL的氨芐青霉素抗體逐滴加入用0.lmol/L的碳酸鉀預(yù)調(diào)至pH8.5-8.8、0.5mL、2nmol/L金納米棒溶液中，室溫震蕩混勻，37"反應(yīng)lh，反應(yīng)結(jié)束6000rpm離心20min，去除未結(jié)合的抗體，重懸在pH7.4、含0.5%聚乙二醇PEG20000的0.01mol/L的PBS中，制得氨芐青霉素抗體修飾的金納米棒探針；b.包被原與金納米棒偶聯(lián)O.5mL、100iig/mL的氨芐青霉素包被原逐滴加入用0.lmol/L的鹽酸預(yù)調(diào)至pH5、0.5mL、2nmol/L的金納米棒溶液中，室溫震蕩混勻，37°C反應(yīng)lh，反應(yīng)結(jié)束6000rpm離心20min，去除未結(jié)合的包被原，重懸在pH7.4、含0.5%PEG20000的0.01mol/L的PBS中，制得氨芐青霉素包被原修飾的金納米棒探針；(2)金納米棒側(cè)面組裝10iiL修飾氨芐青霉素包被原的金納米棒溶液與10iiL不同濃度的氨芐青霉素標(biāo)準(zhǔn)品加入到1.5mL的離心管中，充分混勻，再加入10i!L修飾氨芐青霉素抗體的金納米棒溶液，漩渦混勻，37t:孵育0.5h后，取20iiL反應(yīng)液稀釋到體積為lmL，加入到塑料檢測(cè)小池中，測(cè)反應(yīng)完的金納米棒側(cè)面組裝的免疫聚合物的粒徑；所用的溶液皆為pH7.4、0.01mol/L的PBS緩沖液；氨芐青霉素標(biāo)準(zhǔn)品濃度C分別為0、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、100ng/mL;(3)激光粒度儀檢測(cè)，繪制金納米棒免疫聚合物的粒徑Size氨芐青霉素濃度C標(biāo)準(zhǔn)曲線SizeC:用英國馬爾文激光粒度儀檢測(cè)(ZetasizerNanoZSsystem)用不同濃度C的氨芐青霉素標(biāo)準(zhǔn)品側(cè)面組裝的金納米棒免疫聚合物的粒徑Size，檢測(cè)溫度為2(TC，檢測(cè)角度為173°，激發(fā)光源波長(zhǎng)633nm，激光功率5mW;繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線SizeC;(4)激光粒度儀定量檢測(cè)10iiL修飾氨芐青霉素包被原的金納米棒溶液與10iiL含氨芐青霉素的樣品加入到1.5mL的離心管中，充分混勻，再加入lOi!L修飾氨芐青霉素抗體的金納米棒溶液，漩渦混勻，37t:孵育0.5h后，取20iiL反應(yīng)液稀釋到體積為lmL，加入到塑料檢測(cè)小池中，測(cè)反應(yīng)完的金納米棒側(cè)面組裝的免疫聚合物的粒徑Size，以聚合物的粒徑Size與標(biāo)準(zhǔn)曲線SizeC對(duì)照、，求出樣品中氨芐青霉素的濃度C。所述的氨芐青霉素抗體及包被原修飾的金納米棒是將氨芐青霉素抗體及包被原用靜電作用的方法偶聯(lián)到帶有正電荷的金納米棒的表面；金納米棒是十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)修飾的金納米棒，長(zhǎng)徑比為3。所述的抗體是抗氨芐青霉素的多克隆抗體，經(jīng)硫酸銨沉淀法純化的特異性抗體。所述的氨芐青霉素包被原是將氨芐青霉素與卵清蛋白(OVA)通過戊二醛偶聯(lián)得到的。所述的氨芐青霉素抗體與包被原修飾的金納米棒側(cè)面組裝的免疫聚合物的形成是由于氨芐青霉素抗體與包被原修飾的金納米棒加入氨芐青霉素后，金納米棒側(cè)面的包被原與溶液中游離的氨芐青霉素競(jìng)爭(zhēng)修飾在金納米棒上的抗體，通過抗原與抗體的特異性結(jié)合形成抗原_抗體免疫聚合物。所述的激光粒度儀檢測(cè)是利用氨芐青霉素抗體與包被原修飾的金納米棒側(cè)面組裝所形成的免疫聚合物，通過激光照射，由布朗運(yùn)動(dòng)推算出聚合物的粒徑大小。通常樣品中氨芐青霉素濃度越大，競(jìng)爭(zhēng)抑制修飾在金納米棒上的抗體，則能與修飾在金納米棒表面的包被原反應(yīng)的抗體量越少，則形成的側(cè)面組裝的金納米棒免疫聚合物的尺寸越小。本發(fā)明的有益效果(1)本法檢測(cè)時(shí)樣品前處理簡(jiǎn)單，對(duì)于液體樣品在一定濃度下可以直接用于檢測(cè)。(2)本法操作簡(jiǎn)便快速，只需加待測(cè)樣品孵育后直接進(jìn)行一次測(cè)定，只需一步就可完成。(3)本法用于修飾的金納米棒，尺寸為13X40nm，水相分散性穩(wěn)定性好。具有很高的光散衍射，有利于靈敏檢測(cè)。圖1典型的添加標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)前后激光粒度儀檢測(cè)的粒徑分布圖。圖2激光粒度儀檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1氨芐青霉素抗體及包被原與金納米棒的偶聯(lián)a.抗體與金納米棒偶聯(lián)0.5mL、100iig/mL的氨芐青霉素抗體逐滴加入用0.lmol/L的碳酸鉀預(yù)調(diào)至pH8.5-8.8的0.5mL、2nmol/L金納米棒溶液中，室溫震蕩混勻，37t:反應(yīng)lh，反應(yīng)結(jié)束6000rpm離心20min，去除未結(jié)合的抗體，重懸在pH7.4、0.Olmol/L的PBS中(含0.5%PEG20000)，制得氨節(jié)青霉素抗體修飾的金納米棒探針；b.包被原與金納米棒偶聯(lián)方法與抗體與金納米棒偶聯(lián)類似，O.5mL、100iig/mL的氨芐青霉素包被原逐滴加入用0.lmol/L的鹽酸預(yù)調(diào)至pH5、0.5mL、2nmol/L的金納米棒溶液中，室溫震蕩混勻，37t:反應(yīng)lh，反應(yīng)結(jié)束6000rpm離心20min，去除未結(jié)合的包被原，重懸在pH7.4、0.Olmol/L的PBS(含0.5%PEG20000)中，制得氨芐青霉素包被原修飾的金納米棒探針；實(shí)施例2激光粒度儀檢測(cè)10iiL修飾氨芐青霉素包被原的金納米棒溶液與10iiL不同濃度的氨芐青霉素標(biāo)準(zhǔn)品加入到1.5mL的離心管中，充分混勻，再加入lOiiL修飾氨芐青霉素抗體的金納米棒溶液，漩渦混勻，37t:孵育0.5h后，取20iiL反應(yīng)液稀釋到體積為lmL，加入到塑料檢測(cè)小池中，測(cè)反應(yīng)完的金納米棒側(cè)面組裝的免疫聚合物的粒徑Size,以聚合物的尺寸Size氨芐青霉素濃度C標(biāo)準(zhǔn)曲線SizeC。所用的溶液皆為pH7.4、0.Olmol/L的PBS緩沖液；氨芐青霉素標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為0、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、100ng/mL。實(shí)施例3激光粒度儀定量檢測(cè)用英國馬爾文激光粒度儀檢測(cè)(ZetasizerNanoZSsystem)測(cè)金納米棒的粒徑，本實(shí)驗(yàn)所用檢測(cè)參數(shù)為檢測(cè)溫度為2(TC，檢測(cè)角度為173°，激發(fā)光源波長(zhǎng)633nm，激光功率5mW。金納米棒側(cè)面組裝檢測(cè)的原理氨芐青霉素抗體與包被原修飾到金納米棒側(cè)面上去，再加氨芐青霉素標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)上清液，氨芐青霉素標(biāo)準(zhǔn)品與包被原競(jìng)爭(zhēng)修飾在金納米棒上的抗體，隨著加入的氨芐青霉素標(biāo)準(zhǔn)品的量的不同，所形成的抗體與包被原的金納米棒側(cè)面組裝的免疫聚合物的大小不同，由此用激光粒度儀進(jìn)行檢測(cè)而完成對(duì)氨芐青霉素的檢測(cè)。通過建立金納米棒免疫聚合物的尺寸Size氨芐青霉素濃度C標(biāo)準(zhǔn)曲線SizeC，可對(duì)比求出樣品中氨芐青霉素的濃度。實(shí)施例4實(shí)際樣品測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度C為橫坐標(biāo)，以Size縱坐標(biāo)，數(shù)據(jù)見下表，作圖，見附圖2。表1.激光粒度儀檢測(cè)數(shù)據(jù)ABCDE氨芐青霉素濃度ng/ml0.10.511020Size198.9155.7139.398.2581.88實(shí)際樣品處理取牛奶10mL，于2500r/min離心15min脫脂，70。C熱處理3min酶滅活，取上清液待測(cè)。10iiL修飾氨芐青霉素包被原的金納米棒溶液與10iiL待測(cè)上清液加入到1.5mL的離心管中，充分混勻，再加入lOi!L修飾氨芐青霉素抗體的金納米棒溶液，漩渦混勻，37t:孵育0.5h后，取20iiL反應(yīng)液稀釋到體積為lmL，加入到塑料檢測(cè)小池中，用英國馬爾文激光粒度儀(ZetasizerNanoZSsystem)檢測(cè)反應(yīng)完的金納米棒側(cè)面組裝的免疫聚合物的粒徑大小Size。以SizeC氨芐青霉素濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照，求出樣品中氨芐青霉素的濃度。表2.實(shí)際樣品添加回收<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>權(quán)利要求一種側(cè)面組裝的金納米棒標(biāo)記抗體定量檢測(cè)氨芐青霉素的方法，其特征是首先分別將氨芐青霉素抗體及包被原修飾到金納米棒上去，再加氨芐青霉素標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)上清液，氨芐青霉素標(biāo)準(zhǔn)品與包被原競(jìng)爭(zhēng)修飾在金納米棒上的抗體，隨著加入的氨芐青霉素標(biāo)準(zhǔn)品的量的不同，所形成的抗體與包被原的金納米棒的側(cè)面組裝的免疫聚合物的粒徑大小不同，由此用激光粒度儀進(jìn)行檢測(cè)而完成對(duì)含氨芐青霉素待測(cè)樣品的檢測(cè)；步驟為(1)氨芐青霉素抗體及包被原與金納米棒的偶聯(lián)a.抗體與金納米棒偶聯(lián)0.5mL、100μg/mL的氨芐青霉素抗體逐滴加入用0.1mol/L的碳酸鉀預(yù)調(diào)至pH8.5-8.8、0.5mL、2nmol/L金納米棒溶液中，室溫震蕩混勻，37℃反應(yīng)1h，反應(yīng)結(jié)束6000rpm離心20min，去除未結(jié)合的抗體，重懸在pH7.4、含0.5％聚乙二醇PEG20000的0.01mol/L的PBS中，制得氨芐青霉素抗體修飾的金納米棒探針；b.包被原與金納米棒偶聯(lián)0.5mL、100μg/mL的氨芐青霉素包被原逐滴加入用0.1mol/L的鹽酸預(yù)調(diào)至pH5、0.5mL、2nmol/L的金納米棒溶液中，室溫震蕩混勻，37℃反應(yīng)1h，反應(yīng)結(jié)束6000rpm離心20min，去除未結(jié)合的包被原，重懸在pH7.4、含0.5％PEG20000的0.01mol/L的PBS中，制得氨芐青霉素包被原修飾的金納米棒探針；(2)金納米棒側(cè)面組裝10μL修飾氨芐青霉素包被原的金納米棒溶液與10μL不同濃度的氨芐青霉素標(biāo)準(zhǔn)品加入到1.5mL的離心管中，充分混勻，再加入10μL修飾氨芐青霉素抗體的金納米棒溶液，漩渦混勻，37℃孵育0.5h后，取20μL反應(yīng)液稀釋到體積為1mL，加入到塑料檢測(cè)小池中，測(cè)反應(yīng)完的金納米棒側(cè)面組裝的免疫聚合物的粒徑；所用的溶液皆為pH7.4、0.01mol/L的PBS緩沖液；氨芐青霉素標(biāo)準(zhǔn)品濃度C分別為0、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、100ng/mL；(3)激光粒度儀檢測(cè)，繪制金納米棒免疫聚合物的粒徑Size～氨芐青霉素濃度C標(biāo)準(zhǔn)曲線Size～C用英國馬爾文激光粒度儀檢測(cè)用不同濃度C的氨芐青霉素標(biāo)準(zhǔn)品側(cè)面組裝的金納米棒免疫聚合物的粒徑Size，檢測(cè)溫度為20℃，檢測(cè)角度為173°，激發(fā)光源波長(zhǎng)633nm，激光功率5mW；繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線Size～C；(4)激光粒度儀定量檢測(cè)10μL修飾氨芐青霉素包被原的金納米棒溶液與10μL含氨芐青霉素的樣品加入到1.5mL的離心管中，充分混勻，再加入10μL修飾氨芐青霉素抗體的金納米棒溶液，漩渦混勻，37℃孵育0.5h后，取20μL反應(yīng)液稀釋到體積為1mL，加入到塑料檢測(cè)小池中，測(cè)反應(yīng)完的金納米棒側(cè)面組裝的免疫聚合物的粒徑Size，以聚合物的粒徑Size與標(biāo)準(zhǔn)曲線Size～C對(duì)照，求出樣品中氨芐青霉素的濃度C。全文摘要一種側(cè)面組裝的金納米棒標(biāo)記抗體定量檢測(cè)氨芐青霉素的方法，屬于免疫檢測(cè)
技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明將氨芐青霉素抗體及包被原修飾到金納米棒的側(cè)面上去，再加氨芐青霉素標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)上清液，氨芐青霉素標(biāo)準(zhǔn)品與包被原競(jìng)爭(zhēng)修飾在金納米棒側(cè)面上的抗體，隨著加入的氨芐青霉素標(biāo)準(zhǔn)品的量的不同，所形成的抗體與包被原的金納米棒側(cè)面組裝的免疫聚合物的粒徑大小不同，由此用激光粒度儀進(jìn)行檢測(cè)而完成對(duì)含氨芐青霉素待測(cè)樣品的檢測(cè)。本法不需復(fù)雜的樣品前處理；操作簡(jiǎn)便，只需加待測(cè)樣品孵育后直接用儀器測(cè)定，一步就可完成；用于標(biāo)記金納米棒約為13×40nm，水溶性高，分散性穩(wěn)定性好。文檔編號(hào)G01N33/53GK101699286SQ20091003579公開日2010年4月28日申請(qǐng)日期2009年10月16日優(yōu)先權(quán)日2009年10月16日發(fā)明者彭池方,徐麗廣,朱穎越,胥傳來,陳偉,馬偉申請(qǐng)人:江南大學(xué)