一種快速評(píng)價(jià)化合物對(duì)斑馬魚(yú)肝臟功能損傷作用的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種快速評(píng)價(jià)化合物對(duì)斑馬魚(yú)肝臟功能損傷作用的方法，屬于毒理學(xué) 檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 藥物毒性問(wèn)題是醫(yī)藥行業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵問(wèn)題，藥物性肝損傷是最常見(jiàn)的藥物不良反 應(yīng)。隨著新藥的不斷問(wèn)世，藥物性肝損傷的發(fā)病率也相應(yīng)增加。很多藥物的賦形劑、中草藥 W及保健藥亦有導(dǎo)致肝損傷的可能。藥物引起的肝臟毒性是導(dǎo)致新藥研發(fā)失敗或上市后從 市場(chǎng)撤出的主要原因之一，據(jù)統(tǒng)計(jì)大約有1/3的藥物因?yàn)楦闻K毒性從市場(chǎng)撤出。美國(guó)FDA 批準(zhǔn)上市的藥物中，80%W上的黑框警告藥物屬于嚴(yán)重肝毒性藥物，肝毒性研究位于所有 藥物不良反應(yīng)研究的首位。
[0003] 雖然近年來(lái)對(duì)候選化合物或新藥的肝臟毒性早期篩查越來(lái)越引起人們的重視，但 與之相適應(yīng)的快速動(dòng)物篩選模型、簡(jiǎn)單的分析檢測(cè)技術(shù)和精確的評(píng)價(jià)指標(biāo)仍較匿乏。目前 在臨床前研究中，主要使用大鼠、小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和人肝細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)藥物肝臟毒性。運(yùn) 些檢測(cè)方法具有一定的局限性，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)不能準(zhǔn)確反應(yīng)藥物在體內(nèi)微環(huán)境下的活性。哺乳 動(dòng)物模型雖然具有結(jié)果可靠、綜合全面的優(yōu)點(diǎn)，但是所需的候選物樣品量大，且耗時(shí)、耗資、 耗力，不適合高通量篩選與毒性評(píng)價(jià)研究。
[0004] 近十多年來(lái)，國(guó)外的研究發(fā)現(xiàn)斑馬魚(yú)可用于建立多種人類(lèi)疾病模型并用于藥物毒 性研究。斑馬魚(yú)的優(yōu)勢(shì)在于：（1)斑馬魚(yú)全基因組測(cè)序于2009年完成，與人類(lèi)基因的相似 度達(dá)87%。兩者在基因和蛋白質(zhì)的序列和功能上表現(xiàn)很高的保守性，意味著在斑馬魚(yú)上做 藥物毒性試驗(yàn)所得結(jié)果在多數(shù)情況下也適用于人體。（2)胚胎體外發(fā)育，受精后2地，主要 器官原基已形成，相當(dāng)于28d的人類(lèi)，實(shí)驗(yàn)周期短。（3)胚胎透明，可在顯微鏡下直接觀察胚 胎發(fā)育過(guò)程，全程、完整觀察藥物對(duì)其體內(nèi)器官的毒性作用，避免處死或解剖動(dòng)物。（4)物種 穩(wěn)定，繁殖周期短，飼養(yǎng)方便，費(fèi)用低。斑馬魚(yú)擁有其他動(dòng)物所無(wú)法相比的優(yōu)點(diǎn)，其復(fù)制出的 疾病與人類(lèi)疾病有高度相似性，具有可靠性、可控性、易行性和經(jīng)濟(jì)性等特點(diǎn)。采用斑馬魚(yú) 進(jìn)行藥物肝毒性評(píng)價(jià)不僅可減少受試藥物的用量，克服早期新藥研發(fā)中候選物樣品量不足 導(dǎo)致無(wú)法采用傳統(tǒng)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)藥物的潛在毒性作用進(jìn)行深入評(píng)價(jià)的問(wèn)題，同時(shí)可在短期 內(nèi)完成對(duì)化合物毒性評(píng)價(jià)與毒性機(jī)制的研究工作，明顯縮短研究周期，降低研究成本，有助 于在細(xì)胞和分子水平闡明藥物肝臟毒性作用機(jī)理。 陽(yáng)0化]中國(guó)專利文獻(xiàn)CN(申請(qǐng)?zhí)?01010170675. 2)公開(kāi)了一種用模式生物斑馬魚(yú)篩選肝 損傷藥物的方法，但是該方法利用成年斑馬魚(yú)進(jìn)行篩選，實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)、所需費(fèi)用高、不適合 高通量篩選。
[0006] 中國(guó)專利文獻(xiàn)CN102353663A(申請(qǐng)?zhí)?01110190076. 1)專利公開(kāi)了一種用斑馬魚(yú) 定量評(píng)價(jià)化合物肝毒性的方法，該方法通過(guò)選定斑馬魚(yú)整個(gè)肝臟區(qū)域，計(jì)算肝臟明亮度總 和來(lái)評(píng)價(jià)化合物的肝臟毒性，但是該方法使用普通斑馬魚(yú)幼魚(yú)，體式顯微鏡下觀察肝臟與 其他臟器的界限不是完全清晰可辨，肝臟區(qū)域的選擇誤差較大，導(dǎo)致肝臟明亮度總和的計(jì) 算誤差大，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
[0007] 中國(guó)專利文獻(xiàn)CN104297222A(申請(qǐng)?zhí)?01410548844.訝公開(kāi)了一種斑馬魚(yú)胚胎酒 精肝檢測(cè)模型的構(gòu)建方法，但是該方法未考慮到斑馬魚(yú)幼魚(yú)本身發(fā)育的個(gè)體差異問(wèn)題，導(dǎo) 致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的誤差較大。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種快速評(píng)價(jià)化合物對(duì)斑馬魚(yú)肝臟功能損傷作 用的方法，建立一種具有快速、準(zhǔn)確、高通量特點(diǎn)的化合物肝臟毒性評(píng)價(jià)體系。 陽(yáng)009] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0010] 一種快速評(píng)價(jià)化合物對(duì)斑馬魚(yú)肝臟功能損傷作用的方法，包括如下步驟：
[0011] (1)將受精后2~4天的發(fā)育正常斑馬魚(yú)胚胎移入培養(yǎng)孔中；
[0012] (2)對(duì)培養(yǎng)孔中的斑馬魚(yú)胚胎連續(xù)給藥解育1~3天，記為待測(cè)化合物組；
[0013] (3)觀察斑馬魚(yú)胚胎肝臟，記錄并計(jì)算斑馬魚(yú)胚胎肝臟面積和斑馬魚(yú)胚胎體面積， 按照如下公式計(jì)算肝臟面積指數(shù)：
[0014] 肝臟面積指數(shù)=肝臟面積/體面積X100 % ;
[0015] (4)當(dāng)步驟（3)計(jì)算的待測(cè)化合物組的斑馬魚(yú)胚胎的肝臟面積指數(shù)不在正常斑馬 魚(yú)胚胎的肝臟面積指數(shù)的范圍內(nèi)，且達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性水平（P<〇. 05)，則待測(cè)化合物 具有肝臟毒性；當(dāng)步驟（3)計(jì)算的待測(cè)化合物組的斑馬魚(yú)胚胎的肝臟面積指數(shù)在正常斑馬 魚(yú)胚胎的肝臟面積指數(shù)范圍內(nèi)，則待測(cè)化合物不具有肝臟毒性；
[0016] 所述的正常斑馬魚(yú)胚胎的肝臟面積指數(shù)為：
[0017] 受精后3d的斑馬魚(yú)肝臟面積指數(shù)為0.40~0.68 %，受精后4d的斑馬魚(yú)肝臟面積 指數(shù)為1. 99~2. 66 %，受精后5d的斑馬魚(yú)肝臟面積指數(shù)為3. 07~3. 82 %，受精后6d的斑 馬魚(yú)肝臟面積指數(shù)為3. 93~4. 84%，受精后的7d斑馬魚(yú)肝臟面積指數(shù)為3. 25~4. 39%。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述斑馬魚(yú)胚胎為肝臟特異表達(dá)巧光的斑馬魚(yú)胚胎。肝臟特 異表達(dá)巧光的斑馬魚(yú)胚胎可采用本領(lǐng)域普通市售產(chǎn)品，如國(guó)家斑馬魚(yú)資源中屯、銷(xiāo)售的轉(zhuǎn)基 因斑馬魚(yú)。
[0019] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（1)中斑馬魚(yú)胚胎為受精3~6天的斑馬魚(yú)胚胎。受 精3天W上，斑馬魚(yú)胚胎肝臟已完成發(fā)育，有利于實(shí)驗(yàn)效果的準(zhǔn)確性。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟似中解育，溫度為26~30。光照解育，每天更換 含待測(cè)化合物的培養(yǎng)液。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的，所述培養(yǎng)液組分如下：
[0022] NaCl5mM，KC1 0. 17mM，CaClz0. 4mM，M拆〇40. 16mM，去離子水配制。
[0023] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（3)還包括觀察前的預(yù)處理步驟、；將需要觀察的斑 馬魚(yú)胚胎用質(zhì)量濃度為0. 3%。的=卡因浸泡40~90s進(jìn)行麻醉，然后用3%甲基纖維素固 定于載玻片上。
[0024] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（3)的觀察為在巧光顯微鏡下觀察。
[00巧]根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（3)的記錄為拍照記錄。
[0026] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（3)的計(jì)算為利用圖像處理軟件計(jì)算。
[0027] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（2)中，待測(cè)化合物組至少做=組平行實(shí)驗(yàn)，每組斑 馬魚(yú)胚胎總數(shù)不低于15枚。進(jìn)一步優(yōu)選的，每組斑馬魚(yú)胚胎總數(shù)為30~50枚。 陽(yáng)0測(cè)原理分析
[0029] 本發(fā)明隨機(jī)選取不同的健康斑馬魚(yú)雌雄親魚(yú)，配對(duì)產(chǎn)卵，收集得到不同發(fā)育階段 的斑馬魚(yú)胚胎，每組30個(gè)，按上述方法利用圖像處理軟件計(jì)算斑馬魚(yú)的肝臟面積、體面積。 根據(jù)如下公式計(jì)算各組斑馬魚(yú)的肝臟面積指數(shù)：
[0030] 肝臟面積指數(shù)=肝臟面積/體面積X100%。 W31] 根據(jù)如下公式計(jì)算各組斑馬魚(yú)肝臟面積和肝臟面積指數(shù)的變異系數(shù) (OV):C-V:=sZXX100%,,變異系數(shù)是衡量各檢測(cè)值變異程度的一個(gè)統(tǒng)計(jì)量，為無(wú)量綱量， 可W消除單位和（或）平均數(shù)不同對(duì)兩個(gè)或多個(gè)檢測(cè)指標(biāo)變異程度比較的影響。變異系數(shù) 越小，測(cè)定結(jié)果的偏差程度越小；反之，變異系數(shù)越大，測(cè)定結(jié)果的偏差程度越大。結(jié)果發(fā)現(xiàn) 各組斑馬魚(yú)肝臟面積指數(shù)的變異系數(shù)均小于肝臟面積的變異系數(shù)，說(shuō)明肝臟面積指數(shù)的檢 測(cè)結(jié)果比肝臟面積的檢測(cè)結(jié)果更穩(wěn)定，離散度更小，精密度更高。結(jié)果如表1所示：
[0032]表1不同發(fā)育階段斑馬魚(yú)的肝臟面積和肝臟面積指數(shù)的變異系數(shù)（％ )
[0034]連續(xù)分批檢測(cè)不同發(fā)育階段（3化f、4化f、5化f、6化f、7化f)的斑馬魚(yú)肝臟面積、 體面積，每批30個(gè)胚胎，連續(xù)檢測(cè)5批，按上述方法中步驟（2) (3)，利用圖像處理軟件計(jì)算 斑馬魚(yú)的肝臟面積、體面積。根據(jù)如下公式計(jì)算各批次斑馬魚(yú)的肝臟面積指數(shù)：肝臟面積指 數(shù)二肝臟面積/體面積X100%。根據(jù)如下公式計(jì)算各批次間斑馬魚(yú)肝臟面積和肝臟面積 指數(shù)的變異系