本發(fā)明涉及液體活檢領(lǐng)域，具體地說是一種基于液體活檢的結(jié)直腸癌檢測的試劑盒。

背景技術(shù)：

結(jié)直腸癌(CRC)一種常見的癌癥，其發(fā)病率和死亡率在世界范圍內(nèi)所有癌癥中均位居第三，平均每年有120萬人被診斷為CRC患者。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國CRC的發(fā)病率和死亡率均高于世界平均水平，2011年平均每十萬人口就有平均23名被診斷為CRC患者，且每十萬人中約11名死于CRC。而且近些年我國CRC的發(fā)病率和死亡率呈持續(xù)增長的趨勢。所以，對于CRC的早期篩查以及疾病發(fā)展過程中的檢測就顯得尤為重要。在這一方面，基于循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)檢測的方法具有眾多傳統(tǒng)檢測方法所沒有的優(yōu)勢，包括無創(chuàng)、快捷和適用于早期篩查等。

CTC是指自發(fā)或因診療操作由實(shí)體瘤原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶釋放進(jìn)入外周血循環(huán)的腫瘤細(xì)胞。由于轉(zhuǎn)移是癌癥相關(guān)死亡的主要原因，而CTC作為腫瘤轉(zhuǎn)移的種子，在新的腫瘤生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)、腫瘤預(yù)后判斷及個體化治療等方面都存在很大的應(yīng)用潛力，是國內(nèi)外腫瘤研究的熱點(diǎn)之一。到目前為止，有眾多研究關(guān)注于CRC的CTC富集和檢測，這些研究通常通過比較分析CRC患者中CTC的數(shù)量與患者預(yù)后及生存的關(guān)系，甚至與患者病理分期相關(guān)，主要集中于中晚期CRC患者或直接研究轉(zhuǎn)移性CRC患者，而針對于早期CRC的篩查缺乏研究。

到目前為止，雖然基于EpCAM的CTC捕獲、富集分析平臺仍然被作為一些腫瘤中CTC檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，但研究顯示，該方法對于晚期CRC和非轉(zhuǎn)移性的CRC的檢出率通常很低，而且以EpCAM為生物標(biāo)志物對于發(fā)生EMT的CTC的檢測仍存在很高的假陰性。此外，EpCAM這一廣譜的上皮生物標(biāo)志物不僅不適合用于腫瘤早期的檢測，而且也不具有組織特異性，無法追溯CTC的具體組織來源，而這一點(diǎn)對于后續(xù)的腫瘤治療具有重要意義。因此，發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用一些CRC組織特異性的生物標(biāo)志物進(jìn)行CTC的早期篩查及檢測分析顯得尤為重要。

研究顯示，大約53～78％的CRC患者CTC中表現(xiàn)為角蛋白20陽性(CK20+)，CK20作為角蛋白家族中的一員已被很多研究用作CRC患者CTC檢測的生物標(biāo)志物，不僅是因?yàn)槠漭^高的陽性率，更主要是因?yàn)樗哂辛己玫慕M織特異性，除在胃癌和胰腺癌中有少量表達(dá)外，其在CRC組織中呈現(xiàn)出71-100％的高表達(dá)。因此，基于CK20的CTC的檢測不僅具有較高的陽性檢出率，而且還具有較高的組織特異性定位的能力。此外，尾型同源盒轉(zhuǎn)錄因子2(CDX2)也是一種重要的CRC來源的CTC檢測標(biāo)志物，在CRC的CTC檢測研究中，CDX2的陽性檢測率可以達(dá)到80％多，其在CRC組織中也呈現(xiàn)出76-100％的高表達(dá)。與此同時，CDX2還具有比CK20更高的結(jié)直腸組織特異性，適用于CTC早期檢測中的組織溯源。

據(jù)此，雖然CK20或CDX2對于CRC來源的CTC的檢測率比較高，但是單獨(dú)使用CK20或CDX2作為CTC檢測的標(biāo)志物都會存在一定程度陰性率，造成漏檢。所以，聯(lián)合CK20和CDX2作為CTC早期篩查的生物標(biāo)志物，不僅可以將檢測的靈敏度最大化，而且還可以據(jù)此判定早期篩查樣品中CTC的具體組織來源。

公告日為2014年1月15日，公告號為CN102313813B的中國專利中公開了一種通過免疫熒光染色對稀有細(xì)胞進(jìn)行檢測的方法，該方法對白細(xì)胞、稀有細(xì)胞和細(xì)胞核進(jìn)行三色染色，再通過熒光檢測。但是該方法僅能通過一種單抗來特異性識別該稀有細(xì)胞，容易造成漏檢。同時，由于細(xì)胞的異質(zhì)性，每個細(xì)胞表達(dá)的抗原量不一，導(dǎo)致有時熒光強(qiáng)度非常微弱，在熒光顯微鏡下難以分辨。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的主要目的是針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足提供一種基于液體活檢的結(jié)直腸癌檢測的試劑盒，利用該試劑盒可以檢測外周血中CTC的數(shù)量，對該CTC進(jìn)行溯源分析，判斷該CTC是否來源于結(jié)直腸癌，區(qū)分檢出的早期結(jié)直腸癌CTC的類型，同時熒光顯示細(xì)胞膜邊界清晰、檢測結(jié)果靈敏度高。

在本發(fā)明的一方面，本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一種基于液體活檢的結(jié)直腸癌檢測的試劑盒，所述試劑盒包括：用于增強(qiáng)染色效果的染色增強(qiáng)液和帶熒光染色標(biāo)記的特異性抗體；

其中所述特異性抗體包括：CK20抗體、CD45抗體和CDX2抗體；

所述染色增強(qiáng)液包括濃度為0.001～1mg/mL的表面活性劑。

染色增強(qiáng)液的溶劑為緩沖液。

所述染色增強(qiáng)液的溶劑為生物緩沖液。

優(yōu)選的，所述表面活性劑選自TritonX-100、二甲基亞砜、NP-40、十二烷基硫酸鈉(SDS)中的任一種。更優(yōu)選的，所述表面活性劑為Triton X-100或SDS。最優(yōu)選的，所述染色增強(qiáng)液包括濃度為0.01～1mg/mL的SDS，染色增強(qiáng)液的溶劑為常用的生物緩沖液，如PBS緩沖液等。

優(yōu)選的，所述試劑盒中還包括淋巴細(xì)胞分離液和用于去除白細(xì)胞的免疫磁珠。淋巴細(xì)胞分離液和免疫磁珠能夠用于去除紅細(xì)胞和白細(xì)胞的干擾，便于更好的富集CTC。

更優(yōu)選的，所述用于去除白細(xì)胞的免疫磁珠為表面偶聯(lián)有抗體CD45、CD14和CD15的免疫磁珠中的一種或多種，最優(yōu)選包括全部的上述免疫磁珠。

優(yōu)選的，所述特異性CK20抗體、CD45抗體和CDX2抗體的熒光染色標(biāo)記具有各自不同的發(fā)射波長。根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，為了區(qū)分不同的特異性抗體，本發(fā)明應(yīng)當(dāng)采用不同的熒光染色標(biāo)記。標(biāo)記染料可以采用本領(lǐng)域任何常用的熒光染料，只要通過調(diào)節(jié)激發(fā)光波長可區(qū)分即可。由于熒光染色標(biāo)記的發(fā)射波長各自不同，因此通過熒光顯微鏡在不同的濾光片下可以完全區(qū)分開。其中，本發(fā)明優(yōu)選采用的熒光染色標(biāo)記為Alexa Fluor系列分子、花青染料。更優(yōu)選為Alexa594、CY5和Alexa488，其中Alexa594發(fā)射波長為618nm，CY5發(fā)射波長為670nm，Alexa488發(fā)射波長為519nm。帶熒光染色標(biāo)記的CD45抗體優(yōu)選為CD45-Alexa594(紅色)、帶熒光染色標(biāo)記的CK20抗體可以為CK20-Alexa488(綠色)或CK20-CY5(肉眼不可見，顯微鏡掃描賦以紫色)、帶熒光染色標(biāo)記的CDX2抗體為CDX2-CY5(肉眼不可見，顯微鏡掃描賦以紫色)或CDX2-Alexa488(綠色)。

所述用于熒光原位雜交的熒光探針可以為用于染色體熒光原位雜交的探針，如CEP8熒光探針。

優(yōu)選的，所述染色增強(qiáng)液中還包括占染色增強(qiáng)液質(zhì)量百分含量0.1～3％的聚乙二醇。聚乙二醇與表面活性劑配合可以進(jìn)一步加強(qiáng)染色液的染色效果。

作為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，將帶熒光染色標(biāo)記的特異性抗體與細(xì)胞進(jìn)行孵育從而進(jìn)行熒光染色的過程可以為液體染色或固體染色。如果進(jìn)行液體染色則先將需要進(jìn)行細(xì)胞染色的細(xì)胞重懸成細(xì)胞懸液，然后依次進(jìn)行染色預(yù)處理、細(xì)胞染色，再將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到載玻片上進(jìn)行細(xì)胞固定、載玻片封片。而如果在載玻片上進(jìn)行固體染色，則先將細(xì)胞在載玻片上進(jìn)行細(xì)胞固定，然后依次進(jìn)行染色預(yù)處理、細(xì)胞染色后，再對載玻片封片。

上述細(xì)胞固定是通過細(xì)胞固定液進(jìn)行的，所述細(xì)胞固定液可以為本領(lǐng)域常用的細(xì)胞固定液，例如多聚甲醛、戊二醛、福爾馬林、乙醇、丙酮中的一種或幾種的組合。

一種利用上述基于液體活檢的結(jié)直腸癌檢測的試劑盒進(jìn)行CTC檢測的方法包括以下步驟：

富集外周血中的目標(biāo)細(xì)胞；

利用染色增強(qiáng)液對目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行增強(qiáng)染色預(yù)處理；

利用帶熒光染色標(biāo)記的特異性抗體對目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行熒光染色；

目標(biāo)細(xì)胞固定；

用熒光探針進(jìn)行熒光原位雜交(FISH)；

DAPI封片及鏡檢。

經(jīng)過增強(qiáng)染色預(yù)處理之后的目標(biāo)細(xì)胞，特異性抗體與目標(biāo)細(xì)胞的結(jié)合更好，熒光染色更明顯，細(xì)胞膜邊界清晰。

作為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，當(dāng)腫瘤細(xì)胞特異性抗原存在于細(xì)胞內(nèi)時，應(yīng)當(dāng)對細(xì)胞膜表面染色并固定目標(biāo)細(xì)胞后，再將細(xì)胞膜破膜并利用帶熒光染色標(biāo)記的特異性抗體對目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)熒光染色。

優(yōu)選的，所述富集外周血中的目標(biāo)細(xì)胞包括以下步驟：

(1)將外周血離心分離血漿和血細(xì)胞，并去除血漿；

(2)向步驟(1)的血細(xì)胞中加入緩沖液和淋巴細(xì)胞分離液離心分層，去除紅細(xì)胞層；

(3)向步驟(2)中加入用于去除白細(xì)胞的免疫磁珠并孵育得到懸濁液；

(4)將步驟(3)中的懸濁液磁分離去除白細(xì)胞以及剩余的紅細(xì)胞，再洗滌后得到富集后的目標(biāo)細(xì)胞。

所述的淋巴細(xì)胞分離液可以為本領(lǐng)域常用的淋巴細(xì)胞分離液，用于根據(jù)密度分離紅細(xì)胞即可，本發(fā)明優(yōu)選的采用Ficoll分離液。

本發(fā)明對目標(biāo)細(xì)胞的富集包括兩次去除紅細(xì)胞，可以對紅細(xì)胞去除更加干凈，而且通過免疫磁珠，可以一次性去除白細(xì)胞和剩余紅細(xì)胞，富集效率更高。經(jīng)過上述富集處理后能夠排除其他細(xì)胞對于熒光染色的干擾，有利于通過熒光顯微鏡進(jìn)行更好的觀察。

優(yōu)選的，所述利用染色增強(qiáng)液對目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行增強(qiáng)染色預(yù)處理的處理時間為5～20分鐘。染色增強(qiáng)液加入后表面活性劑的終濃度為0.2μg/mL～1mg/mL。其中，染色增強(qiáng)液優(yōu)選的加入量為1～20μL。當(dāng)染色增強(qiáng)液的加入量越多時，加強(qiáng)熒光的強(qiáng)度越高，但是可能會對細(xì)胞膜造成損傷，加入量過少時加強(qiáng)效果又不是太明顯。

優(yōu)選的，所述利用帶熒光染色標(biāo)記的特異性抗體對目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行熒光染色時，先將帶熒光染色標(biāo)記的特異性抗體按照1:(100～200)的體積比用緩沖液稀釋，再將稀釋后的特異性抗體與目標(biāo)細(xì)胞混合孵育。

優(yōu)選的，所述帶熒光染色標(biāo)記的特異性抗體加入后特異性抗體的終濃度為2～10μg/mL。其中，帶熒光染色標(biāo)記的特異性抗體按照1:200的體積比用緩沖液稀釋。加入的特異性抗體濃度越高，越容易造成非特異性染色，影響熒光的效果。

上述緩沖液可以為一般的生物細(xì)胞緩沖液，例如PBS緩沖液。更優(yōu)選的，PBS緩沖液為0.01M的磷酸鹽緩沖液，其中Na₂HPO₄、NaCl、KH₂PO₄和KCl的濃度分別為8mM、136mM、2mM和2.6mM，pH值為7.2-7.4。

發(fā)明原理

目前，有很多角蛋白家族成員均被應(yīng)用于CTCs的富集及檢測，包括CK8、CK18、CK19等，這些角蛋白實(shí)質(zhì)上表達(dá)于幾乎所有的腫瘤和非腫瘤組織，組織特異性較差，而對比于這些角蛋白家族成員，CK20特異性的表達(dá)于胃腸道的腫瘤及正常組織，因此對于結(jié)直腸癌的組織溯源具有較高的特異性。鑒于此，早在2009年Sze Chuen Cesar Wong等就基于CK20特異性的捕獲結(jié)直腸癌患者外周血中的CTCs，結(jié)果顯示在132名結(jié)直腸癌患者中CTCs檢出率為62％，而在120名其他癌癥患者(乳腺癌、前列腺癌、肝癌和肺癌)中CTCs檢出率為0％，這就足以看出CK20具有較高的組織特異性和組織溯源能力。與此相似，CDX2也是一種特異性表達(dá)于胃腸道的蛋白，其在腸的發(fā)育、分化和腸表型的維持中發(fā)揮著重要的作用。研究表明，基于CDX2的CTCs檢測中，在90名結(jié)直腸癌患者中有73名患者被檢測出含有CTCs，平均的CTCs數(shù)量為21.5?；谏鲜鼋Y(jié)直腸癌特異的腫瘤標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)和研究，聯(lián)合這兩種瘤標(biāo)能夠有效提高CTCs的檢測靈敏度和組織特異性。

選擇多種帶熒光染色標(biāo)記的抗體有利于確認(rèn)目標(biāo)細(xì)胞的具體類型，然而當(dāng)抗體種類多于一種時，目標(biāo)細(xì)胞與抗體的結(jié)合就容易被干擾，導(dǎo)致熒光表達(dá)不佳，影響熒光顯微鏡觀察。而本發(fā)明的染色增強(qiáng)液通過暴露細(xì)胞表面的膜蛋白抗原決定簇，使帶熒光染色標(biāo)記的抗體更容易結(jié)合在細(xì)胞表面的細(xì)胞膜上，從而增強(qiáng)標(biāo)記細(xì)胞膜的熒光強(qiáng)度，并且使細(xì)胞膜邊界清晰。

本發(fā)明采用帶Alexa594熒光染色標(biāo)記的CD45抗體對白細(xì)胞表面特異性染色，用分別標(biāo)記Alexa488和CY5的CK20抗體和CDX2抗體對捕獲的CTC進(jìn)行特異性染色。通過熒光顯微鏡觀察，調(diào)節(jié)激發(fā)波長為591nm時Alexa594發(fā)射光為618nm紅光；激發(fā)波長為650nm時CY5發(fā)射光為670nm遠(yuǎn)紅光(肉眼不可見，顯微鏡掃描賦以紫色)；激發(fā)波長為499nm時Alexa488發(fā)射光為519nm綠光。所以通過調(diào)節(jié)不同的激發(fā)波長以及曝光時間，可以觀察到不同細(xì)胞上標(biāo)記的不同熒光，進(jìn)而可對目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行區(qū)分：CD45+為白細(xì)胞；CK20+或CDX2+為腫瘤CTC細(xì)胞，其中CK20+/CDX2+可確定目標(biāo)細(xì)胞來源于結(jié)直腸癌的患者。

8號染色體異常存在于多種實(shí)體瘤中，包括前列腺癌、卵巢癌、腎癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌等，利用熒光原位雜交(FISH)的方法檢測細(xì)胞或組織內(nèi)8號染色體異常的情況已被廣泛的用于臨床診斷中，本發(fā)明在基于腫瘤標(biāo)志物活檢的同時，輔以8號染色體著絲粒區(qū)域(CEP8)的FISH檢測驗(yàn)證，在雙瘤標(biāo)檢測增加腫瘤檢測靈敏度的同時進(jìn)一步通過CEP8的檢測保證檢測的特異性。其中，CEP8探針為標(biāo)記有SpectrumOrange的熒光探針，用于挑選全部細(xì)胞中8號染色體數(shù)目異常的細(xì)胞為目標(biāo)細(xì)胞。通過熒光顯微鏡觀察，調(diào)節(jié)激發(fā)光波長為559nm時SpectrumOrange發(fā)射光為588nm橙光，可與上述腫瘤標(biāo)志物和白細(xì)胞標(biāo)志物熒光進(jìn)行同時檢測，通過特異性橙光探針點(diǎn)數(shù)目的檢測確定目標(biāo)細(xì)胞8號染色體的數(shù)目。本發(fā)明在基于腫瘤標(biāo)志物活檢的同時，可以選擇的輔以CEP8的FISH檢測驗(yàn)證，在雙瘤標(biāo)檢測增加CTC檢測靈敏度的同時進(jìn)一步通過CEP8的檢測保證檢測的特異性。

本發(fā)明的基于液體活檢的結(jié)直腸癌檢測的試劑盒，可以有效的富集目標(biāo)細(xì)胞，并且確認(rèn)富集的目標(biāo)細(xì)胞是否來源于結(jié)直腸癌的早期患者。同時，本發(fā)明通過雙瘤標(biāo)檢測增加腫瘤檢測靈敏度并且進(jìn)一步通過CEP8的檢測保證檢測的準(zhǔn)確性。此外，本發(fā)明通過染色增強(qiáng)液加強(qiáng)染色效果，使多種帶熒光染色標(biāo)記的抗體都可以與目標(biāo)細(xì)胞結(jié)合，對目標(biāo)細(xì)胞染色，染色效果更好，熒光更強(qiáng)，而且邊界清晰。這樣可以同時增強(qiáng)血源性細(xì)胞表面特異性熒光染色和腫瘤細(xì)胞特異性標(biāo)志物的熒光染色效果，使得CTC與血源性細(xì)胞更易于區(qū)分，降低檢測的假陽性，提高檢測的特異性。并且，本發(fā)明方法簡單，成本低，具有很強(qiáng)的實(shí)用性。

附圖說明

圖1為DLD-1人結(jié)直腸癌細(xì)胞系的熒光染色檢測Merge圖；

圖2為腫瘤細(xì)胞捕獲后的熒光染色檢測Merge圖。

具體實(shí)施方式

以下通過具體實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明：下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說明書選擇。

淋巴細(xì)胞分離液來自GE healthcare公司的Ficoll-Paque PLUS。

CD45免疫磁珠來自Thermo Fisher Scientific的 CD45。

Alexa 594、Alexa 488和CY5熒光染料來自Thermo Fisher Scientific。

CEP8探針來自雅培公司的CEP 8SpectrumOrange DNA Probe Kit。

實(shí)施例1富集外周血中的目標(biāo)細(xì)胞

(1)將外周血離心以去除血漿蛋白：將8.5mL外周血在水平離心機(jī)中800g，常溫離心7min，棄去上清。

(2)向步驟(1)的血漿中加入5～6mL的PBS緩沖液和3mL的淋巴細(xì)胞分離液，在離心機(jī)中450g，常溫離心7min。離心后分為三層，紅色的底層為紅細(xì)胞層，略帶白色的中間層主要為白細(xì)胞和CTC等，黃色的上層為血漿，吸取紅細(xì)胞層以上的全部液體，去除底部的紅細(xì)胞層。

(3)向步驟(2)中逐滴加入200mL表面偶聯(lián)有CD45抗體的免疫磁珠，在水平搖床上孵育得到懸濁液，水平搖床轉(zhuǎn)速設(shè)置在120～150rpm，傾斜20～30°，常溫，水平搖動20min。

(4)將步驟(3)中的懸濁液用大磁力架吸附2min。小心的吸取上層和中層液體，去除白細(xì)胞以及剩余的紅細(xì)胞，用PBS緩沖液洗滌并重懸后得到富集后的目標(biāo)細(xì)胞。

實(shí)施例2對富集后的目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行熒光染色

(1)增強(qiáng)染色預(yù)處理：向約50μL的富集后的目標(biāo)細(xì)胞中加入2μL染色增強(qiáng)液，常溫靜置10min。所述染色增強(qiáng)液為SDS或Triton X-100的PBS緩沖液溶液，SDS濃度為0.1mg/mL。

(2)細(xì)胞表面染色：將CD45-Alexa 5941μL用199μL的PBS緩沖液稀釋后，加入到步驟(1)預(yù)處理完成后的細(xì)胞懸液中，再避光孵育20min。孵育后加PBS緩沖液清洗細(xì)胞液體，950g離心4min，去上清至100μL。

(3)細(xì)胞固定：將步驟(2)中的細(xì)胞轉(zhuǎn)移涂抹到載玻片上，然后加入固定液多聚甲醛，固定10min，PBS洗滌玻片2次，每次5min。

(4)細(xì)胞破膜：細(xì)胞固定后在載玻片上細(xì)胞區(qū)域滴加細(xì)胞破膜液200μL，孵育10min后加PBS緩沖液清洗玻片2次，每次5min。所述細(xì)胞破膜液為Triton X-100的PBS緩沖液溶液，Triton X-100濃度為0.5％。

(5)細(xì)胞胞內(nèi)標(biāo)志物染色：將CK20-Alexa 488和CDX2-CY5各1μL用198μL的PBS緩沖液稀釋后，加入到上述玻片上細(xì)胞區(qū)域，再避光孵育20min，然后加PBS緩沖液清洗玻片2次，每次5min。

(6)熒光原位雜交：向載玻片上滴加10μL的CEP8熒光探針，蓋上蓋玻片，四周加封片膠封片。在76℃下預(yù)雜交10min，然后在37℃下雜交4h。

(7)DAPI封片及鏡檢：撕去封片膠，用PBS緩沖液清洗2次(5min/次)，并脫去蓋玻片，在自然干燥后加入10μL封片劑封片并蓋上蓋玻片(其中封片劑的含量為DAPI：甘油＝1:9)，最后用Nikon DS-U3熒光顯微鏡觀察，鏡檢條件為：激發(fā)光波長為591nm時Alexa594發(fā)射光為618nm紅光，曝光時間100ms；激發(fā)光波長為650nm時CY5發(fā)射光為670nm遠(yuǎn)紅光(肉眼不可見，顯微鏡掃描賦以紫色)，曝光時間100ms；激發(fā)光波長為499nm時Alexa488發(fā)射光為519nm綠光，曝光時間100ms；激發(fā)光波長為345nm時DAPI發(fā)射光為455nm藍(lán)光，曝光時間10～20ms；激發(fā)光波長為559nm時SpectrumOrange發(fā)射光為588nm橙光，曝光時間100ms，結(jié)果顯示，正常人外周血分離的白細(xì)胞絕大多數(shù)呈現(xiàn)CD45陽性染色，瘤標(biāo)陰性染色，F(xiàn)ISH結(jié)果為CEP8二倍體，沒有瘤標(biāo)陽性或CEP8數(shù)目異常的細(xì)胞。

實(shí)施例3DLD-1人結(jié)直腸癌細(xì)胞系的熒光染色檢測

將DLD-1人結(jié)直腸癌細(xì)胞(來源中國科學(xué)院細(xì)胞庫購買)，酶解消化后取10⁵個細(xì)胞，大約50μL，按照實(shí)施例2的步驟進(jìn)行細(xì)胞的熒光染色和熒光顯微鏡鏡檢。鏡檢條件為：激發(fā)光波長為591nm時Alexa594發(fā)射光為618nm紅光，曝光時間100ms；激發(fā)光波長為650nm時CY5發(fā)射光為670nm遠(yuǎn)紅光(肉眼不可見，顯微鏡掃描賦以紫色)，曝光時間100ms；激發(fā)光波長為499nm時Alexa488發(fā)射光為519nm綠光，曝光時間100ms；激發(fā)光波長為345nm時DAPI發(fā)射光為455nm藍(lán)光，曝光時間10～20ms，結(jié)果如圖1所示。

結(jié)果顯示，DLD-1人結(jié)直腸癌細(xì)胞在358nm激發(fā)光下顯示藍(lán)光為細(xì)胞核，說明存在細(xì)胞；在499nm激發(fā)光下顯示綠色說明CK20呈陽性；在650nm激發(fā)光下顯示紫色說明CDX2呈陽性；而在591nm激發(fā)光下不顯示紅色，說明CD45呈陰性，說明所選結(jié)直腸癌細(xì)胞系瘤標(biāo)陽性表達(dá)，且可通過CD45進(jìn)行負(fù)向篩選。

實(shí)施例4腫瘤細(xì)胞捕獲效率檢測

采集健康志愿者8.5ml血樣，加入50個DLD-1人結(jié)直腸癌細(xì)胞。然后按照實(shí)施例1的步驟進(jìn)行腫瘤細(xì)胞富集，再按照實(shí)施例2的步驟進(jìn)行腫瘤細(xì)胞的熒光染色和熒光顯微鏡鏡檢。鏡檢條件為：激發(fā)光波長為591nm時Alexa594發(fā)射光為618nm紅光，曝光時間100ms；激發(fā)光波長為650nm時CY5發(fā)射光為670nm遠(yuǎn)紅光(肉眼不可見，顯微鏡掃描賦以紫色)，曝光時間100ms；激發(fā)光波長為499nm時Alexa488發(fā)射光為519nm綠光，曝光時間100ms；激發(fā)光波長為345nm時DAPI發(fā)射光為455nm藍(lán)光，曝光時間10～20ms；激發(fā)光波長為559nm時SpectrumOrange發(fā)射光為588nm橙光，曝光時間100ms，結(jié)果如圖2所示。

結(jié)果表明，腫瘤細(xì)胞(CK20+或CDX2+)捕獲數(shù)目48個，捕獲率96％。CK20陽性(CK20+)細(xì)胞數(shù)目46個，陽性率92％；CDX2陽性(CDX2+)細(xì)胞數(shù)目38個，陽性率76％；瘤標(biāo)雙陽性腫瘤細(xì)胞數(shù)目(CK20+/CDX2+)36個，陽性率72％；CEP8非二倍體(CEP8≠2)腫瘤細(xì)胞數(shù)目5個，非二倍體率10％。

從上述結(jié)果可以看出，利用本發(fā)明的試劑盒進(jìn)行基于液體活檢的CTC檢測相對于現(xiàn)有的單瘤標(biāo)檢測而言，捕獲血液中的腫瘤細(xì)胞靈敏度可以達(dá)到96％。并且可以根據(jù)CEP8的檢測，增加檢測的特異性，滿足不同的檢測目的。

以上所述的實(shí)施例只是本發(fā)明的一種較佳的方案，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明實(shí)施例原理以及權(quán)利要求的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也視為本發(fā)明實(shí)施例的保護(hù)范圍。