本發(fā)明涉及檢測檢驗
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地涉及一種基于測量熒光強(qiáng)度的分析方法和裝置。
背景技術(shù)：
：有機(jī)磷與氨基甲酸脂類殺蟲劑在農(nóng)業(yè)種植領(lǐng)域運(yùn)用廣泛，占?xì)⑾x劑用量的70％以上。隨著無公害農(nóng)產(chǎn)品的開發(fā)，農(nóng)藥在蔬菜水果中的殘留問題已引起人們的普遍關(guān)注。如何實(shí)現(xiàn)對農(nóng)產(chǎn)品、食品和環(huán)境中農(nóng)藥殘留的快速、準(zhǔn)確、靈敏檢測是控制化學(xué)農(nóng)藥施用的關(guān)鍵之一。目前常用的快速檢測法---酶抑制法，是根據(jù)有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥能抑制乙酰膽堿酯酶的活性之原理，向蔬菜的提取液中加入生化反應(yīng)底物碘化乙酰硫代膽堿和乙酰膽堿酯酶，如果蔬菜不含有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留或殘留量低，酶的活性就不被抑制，實(shí)驗中加入的底物就能被酶水解，水解產(chǎn)物與加入的顯色劑反應(yīng)產(chǎn)生黃色物質(zhì)。如果蔬菜的提取液含有農(nóng)藥并殘留量較高時，酶的活性被抑制，底物就不被水解，當(dāng)加入顯色劑時就不顯色或顏色變化很小。用分光光度計測定吸光值，根據(jù)計算出的抑制率，就可以判斷蔬菜中含有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量的情況。但在實(shí)際應(yīng)用中，還存在諸多問題，如：乙酰膽堿酯酶工作液不能常溫保存，只能放于冰箱，使用中容易失活，影響檢測結(jié)果的可靠性；在測量吸光度時容易受葉綠素等色素的干擾，易產(chǎn)生假陽性，為消除色素干擾，需使用活性炭或硅藻土，操作繁瑣。1990年，Beggs等綜合膠體金和免疫分析技術(shù)，建立了膠體金免疫層析法(GICA)，用于檢測人尿和血清中的HCG(BEGGSM，NOVOTNYM，SAMPEDROS.Aselfperformingchromatographicimmunoassayforthequalitativedeterminationofhumanchorionicgonadotrophin(HCG)inurineandserum[J].ClinChem，1990，36：1084-1085)。由于GICA性質(zhì)穩(wěn)定、可室溫存放、使用方便，此后20多年，GICA在人類醫(yī)學(xué)診斷、獸醫(yī)以及食品安全監(jiān)測等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，但主要 是定性檢測。近來有研究人員試圖用GICA法檢測農(nóng)藥殘留，目的在于為了克服酶抑制法檢測農(nóng)藥殘留的缺陷，由于很難得到針對農(nóng)藥分子的特異性抗體，所以未有明顯進(jìn)展。因此，本領(lǐng)域急需穩(wěn)定性好、靈敏度高、使用方便同時又抗色素干擾且無須針對農(nóng)藥的特異性抗體的免疫層析檢測方法。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種基于熒光淬滅原理的農(nóng)藥殘留檢測方法和裝置。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種檢測待測物存在與否和/或數(shù)量的免疫分析方法，包括步驟：(a)提供一測試片，所述測試片包括：加樣區(qū)、測試區(qū)、質(zhì)控區(qū)、和吸水區(qū)，其中所述的測試區(qū)包含用于捕獲乙酰膽堿酯酶的第一捕獲劑，而所述的質(zhì)控區(qū)包含用于捕獲質(zhì)控物質(zhì)的第二捕獲劑；(b)將可能含有待測物的測試樣本與第一測試液進(jìn)行混合，形成第一混合液，其中第一測試液含有：乙酰膽堿酯酶和任選的質(zhì)控物質(zhì)，其中所述的乙酰膽堿酯酶被吸光物質(zhì)標(biāo)記；而所述的待測物選自下組：有機(jī)磷類農(nóng)藥、氨基甲酸酯類農(nóng)藥、或其組合；(c)將第一混合液滴加于所述測試片的加樣區(qū)，使得所述混合液向所述吸水區(qū)流動，并流經(jīng)所述的測試區(qū)和質(zhì)控區(qū)；和(d)基于所述測試區(qū)的熒光值的變化，并結(jié)合質(zhì)控區(qū)的檢測結(jié)果，獲得所述測試樣本中待測物存在與否和/或數(shù)量的結(jié)果。在另一優(yōu)選例中，所述的質(zhì)控物質(zhì)是質(zhì)控抗體。在另一優(yōu)選例中，所述的質(zhì)控抗體標(biāo)記有可檢測標(biāo)記物。在另一優(yōu)選例中，所述的可檢測標(biāo)記物包括：膠體金、熒光團(tuán)、發(fā)光團(tuán)、或其組合。在另一優(yōu)選例中，所述膠體金的粒徑為20-40nm。在另一優(yōu)選例中，所述的質(zhì)控抗體被吸光物質(zhì)或淬滅劑所標(biāo)記。在另一優(yōu)選例中，所述的測試區(qū)具有背景熒光、或任選地添加了產(chǎn)生熒光的物質(zhì)。在另一優(yōu)選例中，所述的質(zhì)控區(qū)具有背景熒光、或任選地添加了產(chǎn)生熒光 的物質(zhì)。在另一優(yōu)選例中，所述的測試區(qū)具有背景熒光并且不添加額外的產(chǎn)生熒光的物質(zhì)。在另一優(yōu)選例中，所述的質(zhì)控區(qū)具有背景熒光并且不添加了額外的產(chǎn)生熒光的物質(zhì)。在另一優(yōu)選例中，在步驟(d)中，基于測試區(qū)的熒光值的下降，獲得所述測試樣本中待測物數(shù)量的定量結(jié)果。在另一優(yōu)選例中，在步驟(d)中，基于標(biāo)準(zhǔn)曲線或下列公式I和II，得出所述測試樣本中待測物數(shù)量的定量結(jié)果：C測試＝k×Δ熒光值IΔ熒光值＝Y(jié)測試－Y0II式中，C測試為測試樣本中待測物的濃度；k為常數(shù)(可通過實(shí)驗確定)；Y測試為測試所述測試樣本時獲得測試區(qū)的熒光值；Y0為未添加所述測試樣本或第一混合液時測試區(qū)的空白熒光值。在另一優(yōu)選例中，所述的熒光物質(zhì)選自下組：熒光素、羧基熒光素、2-甲氧基熒光素、4，5-二甲氧基熒光素、羅丹明、藻紅蛋白、量子點(diǎn)和稀土元素離子(如Eu3+)及其螯合物。在另一優(yōu)選例中，所述的待測物選自下組：氯吡硫磷、敵敵畏、涕滅威、或其組合。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種用于檢測待測物存在與否和/或數(shù)量的試劑盒或試劑組合，包括：(i)一測試片，所述測試片包括：加樣區(qū)、測試區(qū)、質(zhì)控區(qū)、和吸水區(qū)，其中所述的測試區(qū)包含用于捕獲乙酰膽堿酯酶的第一捕獲劑，而所述的質(zhì)控區(qū)包含用于捕獲質(zhì)控物質(zhì)的第二捕獲劑；(ii)第一容器，以及位于所述第一容器中的、用于與測試樣本進(jìn)行混合的第一測試試劑，所述第一測試試劑為乙酰膽堿酯酶，其中所述的乙酰膽堿酯酶被吸光物質(zhì)標(biāo)記；(iii)任選的第二容器，以及位于第二容器中的質(zhì)控物質(zhì)；其中，所述的第一容器和第二容器是相互獨(dú)立的或是同一容器；并且，所述的待測物選自下組：有機(jī)磷類農(nóng)藥、氨基甲酸酯類農(nóng)藥、或其組合。在另一優(yōu)選例中，所述的待測物選自下組：氯吡硫磷、敵敵畏、涕滅威、或其組合。在另一優(yōu)選例中，所述的第一測試試劑為溶液形式或固態(tài)形式。在另一優(yōu)選例中，所述的第二測試試劑為溶液形式或固態(tài)形式。在另一優(yōu)選例中，所述的第一容器和第二容器是同一容器，并且所述的第一測試試劑和第二測試試劑為混合的干粉形式。在另一優(yōu)選例中，所述的質(zhì)控物質(zhì)是質(zhì)控抗體。在另一優(yōu)選例中，所述的質(zhì)控抗體標(biāo)記有可檢測標(biāo)記物。在另一優(yōu)選例中，所述的可檢測標(biāo)記物包括：膠體金、熒光團(tuán)、發(fā)光團(tuán)、納米金棒、納米銀或其組合。在另一優(yōu)選例中，所述膠體金的粒徑為20-40nm。在另一優(yōu)選例中，所述的質(zhì)控抗體被吸光物質(zhì)或淬滅劑所標(biāo)記。在另一優(yōu)選例中，所述的測試區(qū)具有背景熒光、或任選地添加了產(chǎn)生熒光的物質(zhì)。在另一優(yōu)選例中，所述的質(zhì)控區(qū)具有背景熒光、或任選地添加了產(chǎn)生熒光的物質(zhì)。在另一優(yōu)選例中，所述的測試區(qū)具有背景熒光并且不添加額外的產(chǎn)生熒光的物質(zhì)。在另一優(yōu)選例中，所述的質(zhì)控區(qū)具有背景熒光并且不添加了額外的產(chǎn)生熒光的物質(zhì)。在另一優(yōu)選例中，所述的熒光物質(zhì)選自下組：熒光素、羧基熒光素、2-甲氧基熒光素、4，5-二甲氧基熒光素、羅丹明、藻紅蛋白、量子點(diǎn)和稀土元素離子(如Eu3+)及其螯合物。在本發(fā)明的第三方面，提供了一種定量檢測待測物的熒光測量裝置，所述的裝置包括：(a)一如本發(fā)明第二方面所述的試劑盒或試劑組合；和(b)一用于檢測熒光強(qiáng)度的檢測器。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒還含有使用說明書，所述說明書描述了本發(fā)明第一方面所述的方法。在另一優(yōu)選例中，所述裝置還包括光源和計算機(jī)。所述光源通過光導(dǎo)纖維照射到檢測線處，激發(fā)出的熒光通過光導(dǎo)纖維進(jìn)入檢測器，由計算機(jī)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附圖說明圖1顯示了本發(fā)明方法的基本原理。圖2顯示了氯吡硫磷標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖3顯示了敵敵畏標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖4顯示了涕滅威標(biāo)準(zhǔn)曲線。具體實(shí)施方式本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，首次意外地發(fā)現(xiàn)了一種快速準(zhǔn)確的農(nóng)藥殘留檢測方法。該方法不必使用針對目標(biāo)小分子(即農(nóng)藥)的特異性抗體。與之相反，本發(fā)明方法采用熒光淬滅原理并且使用乙酰膽堿酯酶及其捕獲劑(如抗體)進(jìn)行免疫檢測?；跈z測樣品中農(nóng)藥的存在與否以及數(shù)量，本發(fā)明方法可靈敏地檢測到相應(yīng)熒光變化，從而定性或定量地獲得檢測結(jié)果。在此基礎(chǔ)上，發(fā)明人完成了本發(fā)明。在本發(fā)明方法中，不僅可以通過目測檢測線的顏色來定性判斷是否含有待測物，還可以通過測量其熒光強(qiáng)度的方式來定量檢測待測物，可以直接通過淬滅物質(zhì)對NC膜的自有熒光強(qiáng)度的影響，從而測定待測物的數(shù)量。本發(fā)明方法還對GICA進(jìn)行了技術(shù)改造，使其性能得到大幅提升，由定性變?yōu)槎?，同時繼承了GICA原有的一切優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明大大促進(jìn)了農(nóng)藥殘留檢測方法的開發(fā)及應(yīng)用，不僅靈敏度高，定量準(zhǔn)確，而且操作十分簡便、快捷、且成本低廉。檢測方法本發(fā)明還提供了對所述測試片進(jìn)行定量檢測的方法和裝置，其中可以通過含有光源和檢測器的裝置對對待測物進(jìn)行定量檢測。本發(fā)明檢測方法的基本原理如圖1所示。新的免疫檢測思路與改造后的GICA相結(jié)合用于農(nóng)藥殘留檢測，可以克服酶抑制法的缺陷，使農(nóng)藥殘留檢測更方便、穩(wěn)定、快速、靈敏、準(zhǔn)確。本發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，有機(jī)磷和氨基甲酸酯能使乙酰膽堿酯酶催化中心的絲氨酸殘基中的羥基發(fā)生磷酸化和甲胺?；淖兤浠瘜W(xué)結(jié)構(gòu)，使酶失活。此外，該結(jié)構(gòu)的變化還可有效地導(dǎo)致針對乙酰膽堿酯酶的單克隆抗體與其結(jié)合能力的喪失或下降。基于此，本發(fā)明人用吸光物質(zhì)或淬滅劑標(biāo)記乙酰膽堿酯酶，用其單克隆抗體作為捕獲抗體，構(gòu)建經(jīng)改造的GICA測試片。現(xiàn)結(jié)合圖1進(jìn)一步說明本發(fā)明的基本原理：首先構(gòu)建與GICA基本相似的測試片，不同之處在于，構(gòu)建前先對硝酸纖維素膜(NC)進(jìn)行熒光物質(zhì)標(biāo)記，即圖1中側(cè)流片中部的陰影區(qū)域，該區(qū)域的任意位置熒光強(qiáng)度基本一致，且不隨層析過程而發(fā)生改變。檢測線T固定了5(抗乙酰膽堿酯酶抗體)，質(zhì)控線C固定了2(質(zhì)控抗體)。上圖左側(cè)的試劑杯中含有干化的4(抗2的抗體標(biāo)記熒光淬滅劑)、7(乙酰膽堿酯酶標(biāo)記熒光淬滅劑)混合物，將液體樣本加入其中復(fù)溶干化混合物并反應(yīng)一段時間。(i)若樣本中不含有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥：6(乙酰膽堿酯酶)的結(jié)構(gòu)未改變，可被5正常識別并捕獲，吸取試劑杯中的液體加到樣品墊上，在向前層析的過程中，檢測線處形成復(fù)合物8(5和7形成復(fù)合物)，質(zhì)控線處形成復(fù)合物9(2與4形成復(fù)合物)，NC膜此兩處的熒光淬滅。(ii)若樣本中含有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥：6(乙酰膽堿酯酶)的結(jié)構(gòu)被破壞，5不能正常識別6并捕獲之，吸取試劑杯中的液體加到樣品墊上，在向前層析的過程中，檢測線處不能形成復(fù)合物8，此處NC膜的熒光未淬滅，但質(zhì)控線處仍形成復(fù)合物9，此處NC膜的熒光淬滅。測量檢測線處的熒光強(qiáng)度可確定兩類農(nóng)藥的殘留量，也可肉眼觀察檢測線處顏色的深淺進(jìn)行定性或半定量判斷。農(nóng)藥殘留物目前在蔬菜生產(chǎn)中使用的農(nóng)藥主要有以下幾類：一是有機(jī)磷農(nóng)藥，主要有樂果、敵百蟲、敵敵畏、內(nèi)吸磷、對硫磷、馬拉硫磷等60余種。二是有機(jī)氯農(nóng)藥，主要有林丹、七O五四、毒殺芬、氯丹等。三是氨基甲酸酯類農(nóng)藥，主要有抗蚜威、克百威、西維因、殘殺威、殺螟丹等。四是擬除蟲菊酯類農(nóng)藥，主要有氯氰菊脂(滅百可)、溴氰菊脂(敵殺死)、殺滅菌脂(速滅殺丁)等。本發(fā)明提供的方法用于檢測有機(jī)磷類和氨基甲酸酯類農(nóng)藥。熒光物質(zhì)用于本發(fā)明標(biāo)記的熒光物質(zhì)和淬滅劑應(yīng)配合使用，基本原則是熒光物質(zhì)的激發(fā)與發(fā)射光譜和(或)淬滅劑的吸收光譜部分或完全重疊，最優(yōu)的是完全重疊，如此會有較高的檢測靈敏度。代表性的熒光物質(zhì)包括(但并不限于)：熒光素、羧基熒光素、2-甲氧基熒光素、4，5-二甲氧基熒光素、羅丹明、藻紅蛋白、量子點(diǎn)、稀土元素離子(如Eu3+)及其螯合物等組合，只要所選熒光物質(zhì)的發(fā)射光譜與所選淬滅劑的吸收光譜有重疊即可。如本文所用，術(shù)語“淬滅劑指可衰減熒光物質(zhì)所發(fā)射熒光的物質(zhì)。代表性的淬滅物質(zhì)包括(但并不限于)：膠體金、納米金棒、納米銀等組合，只要所選淬滅物質(zhì)的吸收光譜與所選熒光物質(zhì)的激發(fā)或發(fā)射光譜重疊即可。吸光物質(zhì)(淬滅劑)用于本發(fā)明的吸光物質(zhì)應(yīng)有較寬泛的紫外可見甚至紅外吸收光譜，總的原則是其吸收光譜與測試片自有熒光的激發(fā)或發(fā)射光譜部分或完全重疊。最優(yōu)的是完全重疊，如此會有較高的檢測靈敏度。代表性的吸光物質(zhì)包括(但并不限于)：膠體金、納米金棒、納米銀棒等組合，它們的吸收光譜范圍為300-1000nm不等，只要所選吸光物質(zhì)的吸收光譜與測試片自有熒光激發(fā)或發(fā)射光譜重疊即可。膠體金顆?？捎萌魏纬Ｒ?guī)方法制造，例如總結(jié)于G.Frens,1973Nature PhysicalScience,241:20(1973)中的方法。其他方法描述于美國專利No.5,578,577、5,141,850、4,775,636、4,853,335、4,859,612、5,079,172、5,202,267、5,514,602、5,616,467、5,681,775。如本文所用，術(shù)語“納米金棒”指具有一定縱橫比、且橫軸和縱軸處于5-200納米范圍的金顆粒。一種特別優(yōu)選的吸光物質(zhì)是膠體金，尤其是粒徑為20-40nm的膠體金。捕獲抗體和固相載體本發(fā)明中，所述捕獲抗體為抗乙酰膽堿酯酶的單克隆抗體，固相載體為硝酸纖維素膜。熒光淬滅原理含吸光物質(zhì)標(biāo)記的物質(zhì)被檢測線的捕獲試劑捕獲后，會在檢測線處富集，當(dāng)測試片自有熒光的激發(fā)或發(fā)射光譜與該吸光物質(zhì)的吸收光譜全部或部分重疊時，因共振能量轉(zhuǎn)移，吸光物質(zhì)會對測試片自有熒光產(chǎn)生淬滅作用，即淬滅檢測線的熒光強(qiáng)度。檢測裝置本發(fā)明中，所述檢測可以包括：測試片、檢測器、光源、光導(dǎo)纖維和計算機(jī)。還可以包括一份檢測方法的使用說明。其中測試片的工作原理如上所述，熒光強(qiáng)度的檢測方法可以如下所述(但不僅限于此)，任何可用于檢測熒光強(qiáng)度的方法均可用于本發(fā)明的檢測裝置。熒光強(qiáng)度的檢測光源通過光導(dǎo)纖維照射到檢測線處，激發(fā)出的熒光通過光導(dǎo)纖維進(jìn)入檢測器，所得到的數(shù)據(jù)由計算機(jī)進(jìn)行處理和分析。所述光導(dǎo)纖維可以是Y型的，分別連接于光源、檢測線和檢測器。本發(fā)明中，光源用于提供某一發(fā)射波長的光線，從而激發(fā)熒光物質(zhì)發(fā)出熒光?？蛇x用任何可以提供合適波長的光源，包括(但不限于)：LED、氙燈、鹵鎢燈、激光等。一種優(yōu)選的光源是激光光源，激光光源可用本領(lǐng)域常規(guī)的方法和設(shè)備(如激 光器)產(chǎn)生。代表性的激光器包括(但并不限于)：半導(dǎo)體激光器、氦氖激光器、氬離子激光器、還包括波長可選的激光器、多波長激光器和雙波長激光器等。激光器產(chǎn)生的激光波長與激光介質(zhì)有關(guān)，常見的激光波長見下表1：表1常見的激光波長激光種類波長(納米)氬氟激光(紫外光)193氪氟激光(紫外光)248氙氯激光(紫外光)308氮激光(紫外光)337氬激光(藍(lán)光)488氬激光(綠光)514氦氖激光(綠光)543氦氖激光(紅光)633羅丹明6G染料(可調(diào)光)570-650紅寶石(CrAlO3)(紅光)694釹-釔鋁石榴石(近紅外光)1064本發(fā)明中的檢測器可以是(但不限于)光電倍增管、CCD或光電池等。在描述本發(fā)明之前，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明不限于所述的具體方法和實(shí)驗條件，因為這類方法和條件可以變動。還應(yīng)當(dāng)理解本文所用的術(shù)語其目的僅在于描述具體實(shí)施方案，并且不意圖是限制性的，本發(fā)明的范圍將僅由所附的權(quán)利要求書限制。除非另外定義，否則本文中所用的全部技術(shù)與科學(xué)術(shù)語均具有如本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。如本文所用，在提到具體列舉的數(shù)值中使用時，術(shù)語“約”意指該值可以從列舉的值變動不多于1％。例如，如本文所用，表述“約100”包括99和101和之間的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。雖然在本發(fā)明的實(shí)施或測試中可以使用與本發(fā)明中所述相似或等價的任何方法和材料，本文在此處例舉優(yōu)選的方法和材料。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于：(1)本發(fā)明方法克服了酶抑制法檢測農(nóng)藥殘留的缺陷，不必使用針對目標(biāo)小分子(即農(nóng)藥)的特異性抗體。(2)本發(fā)明方法采用熒光淬滅原理并且使用乙酰膽堿酯酶及其捕獲劑(如抗體)進(jìn)行免疫檢測，由定性變?yōu)槎俊?3)本發(fā)明大大促進(jìn)了農(nóng)藥殘留檢測方法的開發(fā)及應(yīng)用，不僅靈敏度高，定量準(zhǔn)確，而且操作十分簡便、快捷、且成本低廉。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步陳述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明詳細(xì)條件的實(shí)驗方法，通常按照常規(guī)條件中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。以下實(shí)施例中所用的實(shí)驗材料和試劑如無特別說明均可從市售渠道獲得。測試片應(yīng)注意，測試片的具體構(gòu)造可以變化，這取決于意圖用測試片來進(jìn)行的具體測試。在實(shí)施例之外制造測試片的變動方法，也落于本發(fā)明范圍之中。如圖1所示，測試片可包括背襯片，其長度與測試片相同。加樣區(qū)位于測試片的一端，樣品墊位于加樣區(qū)，可通過粘合劑粘貼于加樣區(qū)。吸收區(qū)位于測試片的另一端，在加樣區(qū)的遠(yuǎn)端，吸水墊片位于吸收區(qū)。結(jié)合區(qū)位于加樣區(qū)和吸收區(qū)之間，在加樣區(qū)的近端和吸收區(qū)的遠(yuǎn)端，結(jié)合墊片位于結(jié)合區(qū)。測試區(qū)(也稱檢測線T)位于結(jié)合區(qū)和吸收區(qū)之間，通常測試區(qū)設(shè)置在膜片上，通過所述膜片連接結(jié)合墊和吸水墊。優(yōu)選地，所述膜片上還設(shè)置有對照區(qū)(也稱質(zhì)控線C)，對照區(qū)位于測試區(qū)和吸收區(qū)之間，也可以位于測試區(qū)和結(jié)合區(qū)之間，并與測試區(qū)之間有適當(dāng)?shù)目臻g。測試片制造方法，優(yōu)選地，分別將樣品墊片、結(jié)合墊片、膜片、吸水墊片通過粘合劑粘貼于背襯板上，即得所述測試片。背襯片可以用任何穩(wěn)定的、無孔的材料制成，其強(qiáng)度應(yīng)足以支承材料和粘于其的測試片。因為許多測定用水作為擴(kuò)散介質(zhì)，因此背襯片較佳地是基本上不透水的。在一個優(yōu)選例中，背襯片是用聚合物膜制成的，更佳地是用聚氯乙 烯膜制成的(如PVC膠板)。樣品墊片可用任何吸收性材料制成?？墒褂玫牟牧侠影ǎ豪w維素、硝酸纖維素、乙酸纖維素、玻璃纖維、尼龍、聚電解質(zhì)離子交換膜、丙烯共聚物/尼龍、和聚醚砜。結(jié)合墊片或膜片可以用任何材料制成，只要該材料有足夠孔隙度從而允許在表面和內(nèi)部發(fā)生流體的毛細(xì)管作用。結(jié)合墊片或膜片應(yīng)有足夠的孔隙度，從而允許涂有抗體或抗原的顆粒移動。結(jié)合墊片或膜片還可被含待檢測分析物的樣品中所用的液體潤濕(例如，對于水性液體具有親水性，對于有機(jī)溶劑具有疏水性)。通過例如在美國專利No.4,340,482或No.4,618,533中所述的方法(這些方法描述了將疏水表面轉(zhuǎn)變成親水表面)，可以改變其疏水性從而使其具有親水性以便用于水性液體?？捎糜谥圃旖Y(jié)合墊片或膜片的材料例子包括：聚脂膜、纖維素、硝酸纖維素、乙酸纖維素、玻璃纖維、尼龍、聚電解質(zhì)離子交換膜、丙烯共聚物/尼龍、和聚醚砜(polyethersulfone)。在一個優(yōu)選例中，結(jié)合墊片是用聚脂膜制成的，膜片是用硝酸纖維素制成的。吸收墊片可以用任何能吸收作為樣品和緩沖液的液體的材料制成。吸收墊片的吸收能力應(yīng)足夠大，以便吸收添加至測試片的液體。適用于吸收墊片的材料的例子包括纖維素和玻璃纖維。測試片中硝酸纖維素膜(NC)熒光在另一優(yōu)選例中，所述的測試區(qū)具有背景熒光、或任選地添加了產(chǎn)生熒光的物質(zhì)。在另一優(yōu)選例中，所述的質(zhì)控區(qū)具有背景熒光、或任選地添加了產(chǎn)生熒光的物質(zhì)。在另一優(yōu)選例中，所述的測試區(qū)具有背景熒光并且不添加額外的產(chǎn)生熒光的物質(zhì)。在另一優(yōu)選例中，所述的質(zhì)控區(qū)具有背景熒光并且不添加了額外的產(chǎn)生熒光的物質(zhì)。試劑和設(shè)備：針對乙酰膽堿酯酶的單克隆抗體，自制；乙酰膽堿酯酶，市售品30nm的膠體金，市售品；硝酸纖維素膜(NC)，市售品；圖1中的質(zhì)控抗體(Ab)和抗質(zhì)控抗體(Anti-Ab)的抗體均為自制；小牛血清白蛋白(BSA)，市售品；檢測器：USB4000-FL(美國海洋光學(xué)公司)；光源：532nm激光光源。實(shí)施例1：生菜中氯吡硫磷(有機(jī)磷類)殘留的檢測1、納米金標(biāo)記乙酰膽堿酯酶及抗質(zhì)控抗體的抗體1.1膠體金-抗體保存液四硼酸鈉0.1g小牛血清白蛋白(BSA)0.25gNaN30.025g加水溶解后用6NHCl調(diào)pH至7.4，補(bǔ)水至250ml，用0.45μm濾膜過濾后，4-8℃保存。1.2工作液Na2HPO4·12H2O6.1gNaCl8.5gPVP405.0g硼酸2.1gPEG1.0g10％BSA50mlNaN30.2g加水溶解后用6NHCL調(diào)pH至7.0-7.5，補(bǔ)水至1000ml，用0.45μm濾膜過濾后，4-8℃保存。1.3納米金標(biāo)記乙酰膽堿酯酶(Gold-Ache)1.3.1取20-30nm顆粒膠體金液20ml，在磁力攪拌下緩慢加入已Ache1.0ml(0.6mg/ml)，在室溫下攪拌30min；1.3.2加10％的BSA0.8ml(終濃度0.4％)，室溫攪拌5min；1.3.3加10％的PEG0.4ml(終濃度0.2％)，室溫攪拌5min；1.3.412000-15000r/min離心60-40min，小心吸離心上清，沉淀溶于0.5ml 保存液中，得到Gold-Ache，光密度(O.D)約為100O.D，其中Ache的濃度為1mg/ml，置4℃保存?zhèn)溆茫?.4納米金標(biāo)記抗質(zhì)控抗體的抗體(Gold-anti-Ab)同1.3操作，得到光密度(O.D)約為100O.D的Gold-anti-Ab。1.5分別將上述Gold-Ache和Gold-anti-Ab用工作液稀釋至光密度為5O.D，分別取10μL加入酶標(biāo)板同一微孔中混勻，減壓干燥后密封保存，得干化的熒光淬滅劑。2、抗Ache單克隆抗體及質(zhì)控抗體的固定2.1配制pH7.4的磷酸鹽緩沖液，分別稀釋Ache單克隆抗體和質(zhì)控抗體至0.5mg/ml的濃度；2.2按圖1構(gòu)建熒光標(biāo)記的測試片；2.3用劃膜儀分別將Ache單克隆抗體和質(zhì)控抗體溶液劃于圖1測試片中的T線和C線位置，37℃烘干過夜。3、標(biāo)準(zhǔn)曲線制備3.1用pH7.4的磷酸鹽緩沖液配制氯吡硫磷系列標(biāo)準(zhǔn)溶液(濃度見表2)；3.2分別取表2中6種濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液各100μL，加入干化的熒光淬滅劑，使其復(fù)溶，得6只檢測液；3.3取6只測試片，水平放置，分別在各樣品墊上加檢測液60μl；3.410min后，分別測定各測試片上檢測線處及檢測線與質(zhì)控線中間處575nm的熒光強(qiáng)度(F1、F2)，計算F2/F1的值，數(shù)據(jù)見表2，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。表2：氯吡硫磷標(biāo)準(zhǔn)系列濃度與相應(yīng)熒光強(qiáng)度比值標(biāo)準(zhǔn)系列濃度(mg/kg)熒光強(qiáng)度(F1)熒光強(qiáng)度(F2)F2/F102108076690.36380.052091387250.41720.12030497460.480.220930121040.57830.520984151510.722121548192880.8951以濃度C為橫坐標(biāo)、F2/F1為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖2。對應(yīng)的曲線方程為：F2/F1＝(A1-A2)/[1+(X/X0)P]+A2，其中：A1＝0.3601，A2＝1.4052，X0＝11.8661，p＝0.87094、生菜中氯吡硫磷殘留的檢測試驗4.1選取有代表性的生菜樣品1kg，反復(fù)沖洗浸泡，陰干，使其表面沒有水分。4.2用48％的毒死蜱乳油對水稀釋4000倍，均勻噴灑于洗凈的生菜表面，隔夜陰干；4.3將噴灑了農(nóng)藥的生菜葉剪成1cm左右碎片，取樣品1g，放入燒杯中，加入5mlpH7.4PBS緩沖液，振蕩1-2min，倒出提取液，靜置1-2min，待用。4.4取4.3的提取液100μl，加入干化的熒光淬滅劑，使其復(fù)溶，得檢測液；取60μL檢測液加于測試片的樣品墊，10min后，分別測定測試片上檢測線處及檢測線與質(zhì)控線中間處575nm的熒光強(qiáng)度(F1、F2)，計算F2/F1的值，將F2/F1帶入曲線方程中算的生菜樣品中的氯吡硫磷濃度為0.13mg/kg；4.5重復(fù)“4.1-4.4”試驗，但4.2中的稀釋倍數(shù)為2000倍，最終測得氯吡硫磷濃度為0.22mg/kg；4.6重復(fù)“4.1-4.4”試驗，但4.2中的稀釋倍數(shù)為1000倍，最終測得氯吡硫磷濃度為0.52mg/kg；用高效液相色譜法(HPLC)檢測以上3份提取液中的氯吡硫磷，結(jié)果分別為0.15、0.26、0.49mg/kg，本發(fā)明方法與HPLC法的檢測結(jié)果符合度較高。實(shí)施例2：菠菜中敵敵畏(有機(jī)磷類)殘留的檢測“納米金標(biāo)記乙酰膽堿酯酶與抗質(zhì)控抗體的抗體”及“抗Ache單克隆抗體及質(zhì)控抗體的固定”同實(shí)施例1。1、標(biāo)準(zhǔn)曲線制備1.1用pH7.4的磷酸鹽緩沖液配制敵敵畏系列標(biāo)準(zhǔn)溶液(濃度見表3)；1.2分別取表3中6種濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液各100μL，加入干化的熒光淬滅劑，使其復(fù)溶，得6只檢測液；1.3取6只測試片，水平放置，分別在各樣品墊上加檢測液60μl；1.410min后，分別測定各測試片上檢測線處及檢測線與質(zhì)控線中間處575nm的熒光強(qiáng)度(F1、F2)，計算F2/F1的值，數(shù)據(jù)見表3，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3。表3：敵敵畏標(biāo)準(zhǔn)系列濃度與相應(yīng)熒光強(qiáng)度比值標(biāo)準(zhǔn)系列濃度(mg/kg)熒光強(qiáng)度(F1)熒光強(qiáng)度(F2)F2/F1022080128840.58350.120913133170.63680.221304149110.69990.421930160420.7315122984178540.7768221048175940.8359以濃度C為橫坐標(biāo)、F2/F1為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖3。2、菠菜中敵敵畏殘留的檢測試驗2.1選取菠菜樣品，反復(fù)沖洗浸泡，陰干，使其表面沒有水分。在洗凈的菠菜表面均勻噴灑敵百蟲溶液，隔夜陰干；2.2用80％乳油對水分別稀釋4000倍，均勻噴灑于洗凈的菠菜表面，隔夜陰干；2.3將噴灑了農(nóng)藥的菠菜葉剪成1cm左右碎片，取樣品1g，放入燒杯中，加入5mlpH7.4PBS緩沖液，振蕩1-2min，倒出提取液，靜置1-2min，待用。2.4取2.3的提取液100μl，加入干化的熒光淬滅劑，使其復(fù)溶，得檢測液；取60μL檢測液，加于測試片的樣品墊，10min后，分別測定測試片上檢測線處及檢測線與質(zhì)控線中間處575nm的熒光強(qiáng)度(F1、F2)，計算F2/F1的值，將F2/F1帶入曲線方程中算得菠菜樣品中的敵敵畏濃度為0.15mg/kg；2.5重復(fù)“2.1-2.4”試驗，但2.2中的稀釋倍數(shù)為2000倍，最終測得敵敵畏濃度為0.35mg/kg；2.6重復(fù)“2.1-2.4”試驗，但2.2中的稀釋倍數(shù)為1000倍，最終測得敵敵畏濃度為0.74mg/kg；用高效液相色譜法(HPLC)檢測以上3份提取液中的敵敵畏，結(jié)果分別為0.12、0.29、0.69mg/kg，本發(fā)明方法與HPLC法的檢測結(jié)果符合度較高。對應(yīng)的曲線方程為：F2/F1＝(A1-A2)/[1+(X/X0)P]+A2，其中：A1＝0.5817，A2＝0.9198，X0＝0.5594，p＝0.7969實(shí)施例3：土壤中涕滅威(氨基甲酸酯類)殘留的檢測“納米金標(biāo)記乙酰膽堿酯酶與抗質(zhì)控抗體的抗體”及“抗Ache單克隆抗體及質(zhì)控抗體的固定”同實(shí)施例1。1、標(biāo)準(zhǔn)曲線制備1.1用pH7.4的磷酸鹽緩沖液配制涕滅威系列標(biāo)準(zhǔn)溶液(濃度見表4)；1.2分別取表4中6種濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液各100μL，加入干化的熒光淬滅劑，使其復(fù)溶，得6只檢測液；1.3取6只測試片，水平放置，分別在各樣品墊上加檢測液60μl；1.410min后，分別測定各測試片上檢測線處及檢測線與質(zhì)控線中間處575nm的熒光強(qiáng)度(F1、F2)，計算F2/F1的值，數(shù)據(jù)見表4，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖4。表4：涕滅威標(biāo)準(zhǔn)系列濃度與相應(yīng)熒光強(qiáng)度比值標(biāo)準(zhǔn)系列濃度(mg/kg)熒光強(qiáng)度(F1)熒光強(qiáng)度(F2)F2/F101008764680.64120.11010874690.73890.21030483050.8060.41003086240.8598110984101180.92122998996530.9664以濃度C為橫坐標(biāo)、F2/F1為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖4。對應(yīng)的曲線方程為：F2/F1＝(A1-A2)/[1+(X/X0)P]+A2，其中：A1＝0.6405，A2＝1.0112，X0＝0.2715，p＝0.94672、土壤中涕滅威殘留的檢測試驗2.1取已確認(rèn)無涕滅威的土壤樣品1kg，加入15％的涕滅威顆粒劑5mg后充分拌勻；2.2稱取上述土壤10g，加pH7.4的磷酸鹽緩沖液100μL，振蕩1-2min，靜置1-2min；2.3取2.2的上清液液100μl，加入干化的熒光淬滅劑，使其復(fù)溶，得檢測液；取60μL檢測液加于測試片的樣品墊，10min后，分別測定測試片上檢測線處及檢測線與質(zhì)控線中間處575nm的熒光強(qiáng)度(F1、F2)，計算F2/F1的值，將F2/F1帶入曲線方程中算得涕滅威土壤樣品中的濃度為0.065mg/kg；2.4重復(fù)“2.1-2.3”試驗，但2.1中涕滅威的加入量為10mg，最終測得濃度為0.156mg/kg；2.5重復(fù)“2.1-2.3”試驗，但2.1中涕滅威的加入量為20mg，最終測得濃度為0.289mg/kg；用高效液相色譜法(HPLC)檢測以上3份提取液中的敵敵畏，結(jié)果分別為0.071、0.171、0.296mg/kg，本發(fā)明方法與HPLC法的檢測結(jié)果符合度非常高。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3