一種空腸彎曲菌主要外膜蛋白o(hù)mp18的b細(xì)胞抗原表位篩選及功能鑒定方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)檢測或疫苗研究領(lǐng)域，一種空腸彎曲菌主要外膜蛋白OMP18的B細(xì)胞抗原表位篩選及功能鑒定方法是基于空腸彎曲菌主要外膜蛋白OMP18的B細(xì)胞抗原表位篩選來進(jìn)行的并包括如下步驟：(I)采用TMpred和TMHMM軟件、采用ProDom和Pfam軟件、采用BepiPred軟件、采用DNASTAR軟件進(jìn)行分析；(II)采用clustalw軟件進(jìn)行OMP18基因核苷酸序列同源性比較；(III)采用空腸彎曲菌全菌抗體IgG為一抗，基于ELISA技術(shù)對優(yōu)勢線性B細(xì)胞抗原表位進(jìn)行檢測篩選鑒定，發(fā)現(xiàn)三個B細(xì)胞抗原表位都能有效結(jié)合空腸彎曲菌全菌抗體。本發(fā)明建立起了空腸彎曲菌主要外膜蛋白OMP18的B細(xì)胞抗原表位篩選和鑒定方法，能為后續(xù)空腸彎曲菌感染的血清學(xué)方法建立及疫苗研發(fā)提供候選抗原。
【專利說明】—種空腸彎曲菌主要外膜蛋白0MP18的B細(xì)胞抗原表位篩選及功能鑒定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)檢測或疫苗研究領(lǐng)域，特別是一種通過利用生物信息學(xué)技術(shù)了解空腸彎曲菌主要外膜蛋白0MP18的跨膜結(jié)構(gòu)、基因序列保守性、B細(xì)胞抗原表位及其抗原性等特征，并鑒定空腸彎曲菌主要外膜蛋白優(yōu)勢B細(xì)胞抗原表位，能用于空腸彎曲菌感染的檢測診斷，以及為后續(xù)疫苗研究提供實驗依據(jù)的一種空腸彎曲菌主要外膜蛋白0MP18的B細(xì)胞抗原表位篩選及功能鑒定方法。
【背景技術(shù)】
[0002]空腸彎曲菌是引起人類急性腹瀉常見的病原體之一，是全球范圍內(nèi)重要的食源性人獸共患病病原菌，其感染率在世界各地普遍呈上升趨勢，引發(fā)的食品安全和食源性疾病問題也日益突出?？漳c彎曲菌感染可引起人類急性腸炎和格林-巴利綜合癥等，還可感染動物導(dǎo)致牛和綿羊的流產(chǎn)，火雞的肝炎和藍(lán)冠病，雛雞、犢牛、仔豬的腹瀉等多種疾病。人們需要快速準(zhǔn)確地檢測空腸彎曲菌以便及時控制該病的暴發(fā)流行。但由于空腸彎曲菌培養(yǎng)營養(yǎng)要求高，條件特殊，傳統(tǒng)的檢測方法費(fèi)時費(fèi)力，嚴(yán)重制約了人們對于空腸彎曲菌感染的防治。另外，空腸彎曲菌全菌苗及突變株菌苗對空腸彎曲菌提供的保護(hù)性效果有限且不安全，因此人們急需尋求一種新型、安全、有效的空腸彎曲菌亞單位疫苗，這對于預(yù)防空腸彎曲菌感染具有重要的現(xiàn)實意義。
[0003]無論是空腸彎曲菌感染的血清學(xué)檢測，還是保護(hù)性疫苗研究，篩選出特異性的保護(hù)抗原是其前提和基礎(chǔ)?？漳c彎曲菌主要外膜蛋白0MP18是由omplS基因編碼的分子質(zhì)量為ISkD的外膜蛋白，該蛋白在空腸彎曲菌中普遍存在，具有高度保守性、穩(wěn)定性和特異性，是理想的空腸彎曲菌單克隆抗體的篩選抗原和疫苗候選抗原?？乖ㄟ^抗原表位與相應(yīng)的淋巴細(xì)胞表面的抗原受體結(jié)合，從而激活淋巴細(xì)胞，引起免疫應(yīng)答和發(fā)揮免疫效應(yīng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為了解決上述問題，本發(fā)明提供的一種空腸彎曲菌主要外膜蛋白0MP18的B細(xì)胞抗原表位篩選及功能鑒定方法，就是基于對空腸彎曲菌主要外膜蛋白0MP18進(jìn)行結(jié)構(gòu)和分子特征分析，通過篩選出空腸彎曲菌主要外膜蛋白0MP18特異性B細(xì)胞抗原表位并進(jìn)行功能鑒定，對于空腸彎曲菌抗體的特異性檢測和疫苗研發(fā)提供候選抗原。
[0005]本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:
[0006]所述一種空腸彎曲菌主要外膜蛋白0MP18的B細(xì)胞抗原表位篩選及功能鑒定方法是基于空腸彎曲菌主要外膜蛋白0MP18的B細(xì)胞抗原表位篩選來進(jìn)行的，并包括如下步驟:
[0007](I)采用TMpred和TMHMM軟件預(yù)測0MP18蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域、采用ProDom和Pfam軟件預(yù)測蛋白的功能結(jié)構(gòu)域、采用BepiPred軟件預(yù)測0MP18蛋白的線性B細(xì)胞表位、采用DNASTAR軟件對0MP18蛋白中存在的二級結(jié)構(gòu)、親水性和抗原性進(jìn)行分析，結(jié)果表明外膜蛋白0MP18定位于空腸彎曲菌外膜且不存在跨膜結(jié)構(gòu)，存在三個線性B細(xì)胞表位，且具有良好的親水性和抗原性；
[0008](II)采用Clustalw軟件進(jìn)行0MP18基因核苷酸序列同源性比較，該基因序列僅保守存在于不同空腸彎曲菌菌株中，且序列高度同源，相似度達(dá)99% ；
[0009](III)采用空腸彎曲菌全菌抗體IgG為一抗，基于ELISA技術(shù)對優(yōu)勢線性B細(xì)胞抗原表位進(jìn)行檢測篩選鑒定，發(fā)現(xiàn)三個B細(xì)胞抗原表位都能有效結(jié)合空腸彎曲菌全菌抗體；
[0010]通過上述三個步驟，建立起空腸彎曲菌主要外膜蛋白0MP18的B細(xì)胞抗原表位篩選和鑒定方法，能為后續(xù)空腸彎曲菌感染的血清學(xué)方法建立及疫苗研發(fā)提供候選抗原。
[0011]本發(fā)明的有益效果是:
[0012]通過上述步驟及結(jié)果表明:所述一種空腸彎曲菌主要外膜蛋白0MP18的B細(xì)胞抗原表位篩選及功能鑒定方法高效實用，作為一種新方法可操作性強(qiáng)，能完善后續(xù)空腸彎曲菌感染的血清學(xué)方法提供實驗依據(jù)，能為疫苗的研發(fā)提供候選抗原，具有新穎性及實用價值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]下面結(jié)合本發(fā)明的圖形進(jìn)一步說明:
[0014]圖1是所述空腸彎曲菌主要外膜蛋白0MP18跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果示意圖；
[0015]圖2是所述空腸彎曲菌主要外膜蛋白0MP18的B細(xì)胞線性表位預(yù)測結(jié)果示意圖；
[0016]圖3是所述空腸彎曲菌主要外膜蛋白0MP18親水性、抗原性預(yù)測結(jié)果示意圖；
[0017]圖4是所述空腸彎曲菌0MP18基因核苷酸序列同源性比較示意圖；
[0018]圖5是所述空腸彎曲菌主要外膜蛋白0MP18的B細(xì)胞線性抗原表位ELISA篩選鑒定結(jié)果示意圖。
【具體實施方式】 [0019]如圖1是所述空腸彎曲菌主要外膜蛋白0MP18跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果示意圖，使用 TM pred(PredictionofTransmembraneRegionsandOrientation, www.ch.embnet.0rg/software/TMPRED-f orm.html)和 TMHMM2.0(http://cbs.dtu.dk/serves/TMHMM-2.0/)預(yù)測蛋白中存在的跨膜結(jié)構(gòu)域，使用 ProDom(http://prodes.toulouse.1nra.fr/prodom/doc/blast-form.html)和 Pfam (http://plat0.wustl.edu/hmmsearch.shtml)予頁測目的蛋白中存在的功能結(jié)構(gòu)域。結(jié)果表明空腸彎曲菌主要外膜蛋白0MP18中不存在跨膜結(jié)構(gòu)，整個蛋白定位于菌體表面。
[0020]如圖2是所述空腸彎曲菌主要外膜蛋白0MP18的B細(xì)胞線性表位預(yù)測結(jié)果示意圖，通過 http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/ 對 0MP18 蛋白中可能存在的線性 B細(xì)胞表位進(jìn)行預(yù)測。表明空腸彎曲菌主要外膜蛋白0MP18中存在三個線性B細(xì)胞表位。
[0021]如圖3是所述空腸彎曲菌主要外膜蛋白0MP18親水性、抗原性預(yù)測結(jié)果示意圖，采用DNASTAR/protean軟件對空腸彎曲菌主要外膜蛋白0MP18中存在的二級結(jié)構(gòu)、親水性和抗原性進(jìn)行分析。表明三個線性B細(xì)胞表位具有良好的親水性和抗原性。
[0022]如圖4是所述空腸彎曲菌0MP18基因核苷酸序列同源性比較示意圖，采用http://www.ch.embnet.0rg/software/BottomBLAST.html ? (EMBnet-CH/SIB)(Switzerland)數(shù)據(jù)庫對空腸彎曲菌0MP18基因編碼的蛋白序列進(jìn)行比對,參數(shù)選擇:Protein database,Non redundant, Blosum62。篩選出與其相似性較高的氨基酸序列在http://www.eb1.ac.uk/clustalw/進(jìn)行同源性分析。該基因序列僅保守存在于不同空腸彎曲菌菌株中?？漳c彎曲菌 00-2425,3488, NCTCl1168, S3, IA3902, ICDCCJ07001, M1，81116，81-176，doylei269.97株中均存在ompl8基因，且序列高度同源，相似度達(dá)99%。
[0023]如圖5是所述空腸彎曲菌主要外膜蛋白0MP18的B細(xì)胞線性抗原表位ELISA篩選鑒定結(jié)果示意圖，由相應(yīng)生物技術(shù)公司合成0MP18線性B細(xì)胞表位多肽，并采用HPLC技術(shù)對合成多肽進(jìn)行純度分析。將合成的各表位多肽稀釋至10ug/ml包被96孔板，以兔抗空腸彎曲菌全菌抗體IgG為一抗(Pierce公司)，HRP標(biāo)記羊抗兔IgG抗體為二抗(Abeam公司)，對各表位多肽與全菌抗體的結(jié)合反應(yīng)力進(jìn)行檢測分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)三個表位抗原都能有效結(jié)合空腸彎曲菌全 菌抗體，其中抗原表位多肽3對抗體親和力最強(qiáng)，為優(yōu)勢線性B細(xì)胞抗原表位。
[0024]所述一種空腸彎曲菌主要外膜蛋白0MP18的B細(xì)胞抗原表位篩選及功能鑒定方法是基于空腸彎曲菌主要外膜蛋白0MP18的B細(xì)胞抗原表位篩選來進(jìn)行的，并包括如下步驟:
[0025](I)采用TMpred和TMHMM軟件預(yù)測0MP18蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域、采用ProDom和Pfam軟件預(yù)測蛋白的功能結(jié)構(gòu)域、采用BepiPred軟件預(yù)測0MP18蛋白的線性B細(xì)胞表位、采用DNASTAR軟件對0MP18蛋白中存在的二級結(jié)構(gòu)、親水性和抗原性進(jìn)行分析，結(jié)果表明外膜蛋白0MP18定位于空腸彎曲菌外膜且不存在跨膜結(jié)構(gòu)，存在三個線性B細(xì)胞表位，且具有良好的親水性和抗原性。
[0026]使用 TMpred (Prediction of Transmembrane Regions and Orientation, www.ch.embnet.0rg/sof iware/TMPRED-form.html)和 TMHMM2.0 (http://cbs.dtu.dk/serves/TMHMM-2.0/)預(yù)測蛋白中可存在的跨膜結(jié)構(gòu)域，使用ProDom(http://prodes.toulouse.1nra.fr/prodom/doc/blast-form.html)和 Pfam(http://plat0.wustl.edu/hmmsearch.shtml)預(yù)測目的蛋白中存在的功能結(jié)構(gòu)域。通過http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/對0MP18蛋白中可能存在的線性B細(xì)胞表位進(jìn)行預(yù)測。采用DNASTAR/protean軟件對目的蛋白中存在的二級結(jié)構(gòu)、親水性和抗原性進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，空腸彎曲菌主要外膜蛋白0MP18中不存在跨膜結(jié)構(gòu)，整個蛋白定位于菌體表面。蛋白功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測發(fā)現(xiàn)0MP18蛋白中存在OmpA結(jié)構(gòu)域，與病原菌的粘附能力密切相關(guān)。二級結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，0MP18蛋白中存在3個線性B細(xì)胞表位，且具有良好的親水性和抗原性。
[0027](II)采用Clustalw軟件進(jìn)行0MP18基因核苷酸序列同源性比較，該基因序列僅保守存在于不同空腸彎曲菌菌株中，且序列高度同源，相似度達(dá)99% ；
[0028]用http://www.ch.embnet.0rg/software/BottomBLAST.html ? (EMBnet-CH/SIB) (Switzer land)數(shù)據(jù)庫對空腸彎曲菌ompl8基因編碼的蛋白序列進(jìn)行比對,參數(shù)選擇:Protein database,Non redundant,Blosum62。篩選出與其相似性較高的氨基酸序列在http://www.eb1.ac.uk/clustalw/進(jìn)行同源性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該基因序列僅保守存在于不同空腸彎曲菌菌株中?？漳c彎曲菌 00-2425，3488，NCTC11168，S3，IA3902，ICDCCJ07001，M1，81116，81-176，doylei269.97株中均存在ompl8基因，且序列高度同源，相似度達(dá)99%;
[0029](III)采用空腸彎曲菌全菌抗體IgG為一抗，基于ELISA技術(shù)對優(yōu)勢線性B細(xì)胞抗原表位進(jìn)行檢測篩選鑒定，發(fā)現(xiàn)三個B細(xì)胞抗原表位都能有效結(jié)合空腸彎曲菌全菌抗體。
[0030]B細(xì)胞線性表位鑒定的具體實施中，包被:在微孔條上包被100 μ g/ml濃度的蛋白抗原100ul，4°C過夜。封閉:倒去包被液，加入200ul封閉液，37°C溫育2小時。洗滌:小心揭掉封板膜，用洗板機(jī)洗滌5遍，最后一次盡量扣干。加樣:分別在相應(yīng)孔中加入一抗，對一抗進(jìn)行2倍稀釋作了 6個梯度，從400-12.5 μ g/ml (40ug/ml效果最好)，加一副孔，輕輕震蕩混勻。溫育:用封板膜封板后，置37°C溫育I小時洗滌:小心揭掉封板膜，用洗板機(jī)洗滌5遍，最后一次盡量扣干。加酶:每孔加入二抗(I: 3000稀釋)100ul，空白孔除外，輕輕震蕩混勻。溫育:操作同上。洗滌:操作同上。顯色:每孔加入顯色劑lOOul，輕輕震蕩混勻，37°C避光顯色30分鐘。測定:每孔加終止液50ul，輕輕震蕩混勻，10分鐘內(nèi)測定結(jié)果，設(shè)定酶標(biāo)儀波長于450nm處(用雙波長450nm/630nm檢測)。
[0031]0MP18蛋白結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示該蛋白定位于細(xì)菌外表面，存在三個明顯的B細(xì)胞線性表位，且具有顯著的抗原性?；贓LISA技術(shù)，采用空腸彎曲菌全菌抗體對預(yù)測表位進(jìn)行鑒定發(fā)現(xiàn)三個表位多肽都能與全菌抗體有效結(jié)合，但結(jié)合力存在差異，這說明本發(fā)明所使用的結(jié)構(gòu)分析技術(shù)可靠，在表位預(yù)測方面準(zhǔn)確率很高，能為后續(xù)空腸彎曲菌感染的血清學(xué)方法建立及疫苗研發(fā)提供候選抗原。
【權(quán)利要求】
1.一種空腸彎曲菌主要外膜蛋白0MP18的B細(xì)胞抗原表位篩選及功能鑒定方法，其特征在于:所述一種空腸彎曲菌主要外膜蛋白0MP18的B細(xì)胞抗原表位篩選及功能鑒定方法是基于空腸彎曲菌主要外膜蛋白0MP18的B細(xì)胞抗原表位篩選來進(jìn)行的，并包括如下步驟: (I)采用TMpred和TMHMM軟件預(yù)測0MP18蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域、采用ProDom和Pfam軟件預(yù)測蛋白的功能結(jié)構(gòu)域、采用BepiPred軟件預(yù)測0MP18蛋白的線性B細(xì)胞表位、采用DNASTAR軟件對0MP18蛋白中存在的二級結(jié)構(gòu)、親水性和抗原性進(jìn)行分析，結(jié)果表明外膜蛋白0MP18定位于空腸彎曲菌外膜且不存在跨膜結(jié)構(gòu)，存在三個線性B細(xì)胞表位，且具有良好的親水性和抗原性； (II)采用clustalw軟件進(jìn)行0MP18基因核苷酸序列同源性比較，該基因序列僅保守存在于不同空腸彎曲菌菌株中，且序列高度同源，相似度達(dá)99% ； (III)采用空腸彎曲菌全菌抗體IgG為一抗，基于ELISA技術(shù)對優(yōu)勢線性B細(xì)胞抗原表位進(jìn)行檢測篩選鑒定，發(fā)現(xiàn)三個B細(xì)胞抗原表位都能有效結(jié)合空腸彎曲菌全菌抗體； 通過上述三個步驟，建立起空腸彎曲菌主要外膜蛋白0MP18的B細(xì)胞抗原表位篩選和鑒定方法，能為后續(xù)空腸彎曲菌感染的血清學(xué)方法建立及疫苗研發(fā)提供候選抗原。
【文檔編號】G01N33/68GK103941018SQ201410131891
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年3月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月27日
【發(fā)明者】樓宏強(qiáng), 單小云, 宋春涵, 胡野, 盛秀勝, 王嵐 申請人:金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院