抗空腸彎曲桿菌抗體及其用圖
【專利說明】抗空腸彎曲桿菌抗體及其用途 【技術領域】
[0001] 本公開總的涉及抗體，其片段及涉及該蛋白的衍生物和應用。描述的抗體和片段 針對空腸彎曲桿菌（C. jejuni)的鞭毛蛋白。 【【背景技術】】
[0002] 彎曲桿菌屬（Campylobacter)包括細菌的大量的形態(tài)學上多樣的組（螺旋，彎曲 的或桿形狀的），報道有超過35個物種和亞種，其中20種被發(fā)現(xiàn)對人是病原性的，導致腸和 腸外病，或在人中的多樣數(shù)的位點定居。（Man，2011)。
[0003]空腸彎曲桿菌（Campylobacter jejuni)，革蘭氏陰性螺旋細菌，是目前最普遍食 品源的病原體之一，和是人類世界中細菌胃腸炎的主導原因。在北美洲，彎曲菌病數(shù)目勝 過由沙門氏菌屬（Salmonella)，志賀菌屬（Shigella)，利斯特菌屬（Listeria)和大腸埃 希氏菌（E. coli)組合的導致的病的報道的情況（Stern&Robach, 2003 ;Newell等人，2003 ; Blaser, 1997)。盡管僅引起相對弱的腹瀉病，彎曲桿菌屬（Campylobacter)感染與嚴重的 長期并發(fā)癥相關，包括：Guillain-Barr6綜合征（GBS)，自根除脊髓灰質炎；非-麻痹變體 Miller Fisher 綜合征（Humphery 等人? 2007 ;Hariharan 等人? 2004 ;Blaser 等人? 1986); 反應性關節(jié)炎（ReA);及炎性腸疾?。↖BD) (Rautelin等人.2000 ;Gellynck等人.2008)，是 麻痹的主導原因。
[0004] 估計50~80%之間的人彎曲菌病病例可歸因于雞的食用，由此肉雞雞肉被認為 是向人傳播病原體的主要載體（EFSA期刊2011 Germans等人.2011)。家禽，及雞中彎曲桿 菌屬（Campylobacter)水平的控制和減小尤其是可改善家禽產(chǎn)物安全性和減小彎曲桿菌 屬（Campylobacter)-誘導的胃腸炎的發(fā)生率。由此，人中的長期并發(fā)癥可減少，導致在全 世界節(jié)省住院治療和其他關聯(lián)的成本中百億美元（EFSA報道，2011 ;Nyachuba，2010 ;Buzby 等人.1997)。
[0005] 在生產(chǎn)的各階段，包括在家禽繁殖期間（主要干預），在肉生產(chǎn)期間和/或在 肉處理期間應用針對空腸彎曲桿菌（C. jejuni)及其他欠頻繁的株（例如，結腸彎曲 桿菌（C. coli)及紅嘴鷗彎曲桿菌（C. lari))的當前干預策略。最接受的策略是通過 安裝衛(wèi)生學屏障和防蠅紗，使用高質量水，減小處死齡及中止的稀疏來防止彎曲桿菌 屬（Campylobacter spp.)物種免于進入畜群（Newel l&Wagenaar, 2000 ;Wagenaar 等 人，2006, 2008 ;Lin 2009 ;EFSA報道，2011)。但是，雞對空腸彎曲桿菌（C. jejuni)感染 的感受性及其環(huán)境中到處存在負面地沖擊了這些生物安全方法的成功，凸顯對可控制或消 除細菌感染的替代性的方法的需求。已就向雞施用噬菌體作為飼料-添加劑或獸醫(yī)學藥 物報道0. 5~51og1(lCFU/g盲腸彎曲桿菌水平減小（El-Shibiny等人，2009 ;Carrillo等 人，2005 ;Wagenaar 等人，2005)。
[0006] 更有效地，用添加到家禽飲用水的細菌素處理在90%的情況中完全消除病原體或 減少其水平1〇 6倍或更多（Svetoch等人，2010)。其他生物學試劑諸如益生菌（Santini等 人，2010 ;Willis等人，2008)和植物生物活性化合物（Castillo等人，2011 ;Kureckci等 人，2012)也已用作食品或水添加劑及顯示顯著地減少雞糞便中彎曲桿菌負荷。針對空腸 彎曲桿菌（C. jejuni)的益生株諸如乳酸細菌（LAB)的殺細菌效應已歸因于有機酸，細菌素 或細菌素-樣物質的產(chǎn)生（Santini等人，2010;Messaoudi等人，2011)。許多這些方法未 在本領域廣泛采用，因為一些問題，諸如功效，安全性，毒性，生產(chǎn)規(guī)模和純化，及彎曲桿菌 抗性的發(fā)展。
[0007] 抗生素諸如氟喹諾酮和大環(huán)內(nèi)酯已批準用于處理家禽和人中的彎曲桿菌屬 (Campylobacter spp.)物種。但是，人和動物健康中它們的延長的使用導致在全世界許 多國家抗性彎曲桿菌株的快速增加，和它們在動物飼料原料中的使用不再建議（Smith等 人，2010 ;Luangtongkum 等人，2009 ;Alfredson 等人，2007 ;Silva 等人，2011)。中鏈脂 肪酸（例如，辛酸）和單酰基甘油是抗生素的替代品，及已用作飼料和水添加劑，以控制 或消除雞中的彎曲桿菌負荷（de los Santos等人，2009 ;Hermans等人，2010，Molatova 等人，2010)。雖然如此，與用化合物處理之后彎曲桿菌屬（Campylobacter)的數(shù)和流 行相關的數(shù)據(jù)不一致和對它們的有效性無法作出清楚的結論（EFSA期刊，2011)。抗生 素治療（包括使用維吉霉素，紅霉素，新霉素或環(huán)丙沙星，以減少或消除家禽中感染的來 源，或治療人感染）是有用的工具。但是，關于動物生產(chǎn)中抗生素處理的廣泛使用的生長 關心是抗性彎曲桿菌屬（Campylobacter)株的發(fā)展，及來自雞的耐抗生素的彎曲桿菌屬 (Campylobacter)可在人中導致耐抗生素的感染。
[0008] 針對大量的感染性疾病的疫苗接種在商業(yè)上的養(yǎng)殖雞中廣泛使用（Clark等 人，2012)。為抵御彎曲桿菌屬（Campylobacter spp.)物種定居的保護的家禽疫苗接種也 已被廣泛地研宄。但是，能在短時間（3~4周）引發(fā)快速和強免疫應答的交叉-反應性 疫苗祀的鑒定以及對新佐劑的需求是待克服的一些挑戰(zhàn)（de Zoete等人，2007;Layton等 人，2011 ;Zeng等人，2010 ;Clark等人，2012)。因而，目前無針對空腸彎曲桿菌（C. jejuni) 的商業(yè)疫苗可利用。
[0009] 競爭性排除（CE)方法，由Nurmi和Rantala (1973)首次描述，基于使用來自健康 雞的腸的定義的或未定義的微生物建立保護性腸菌群，以預防彎曲桿菌占據(jù)其特定生態(tài) 位，尤其盲腸（Zhang等人，2007 ;Chen，2001 ;Stern，2001)。應用CE方法中的困難包括鑒 定CE產(chǎn)物中的復雜物種的標準化的缺乏，以及減少彎曲桿菌感染中有限的及可變的成功 率（Lin, 2009 ;EFSA 期刊 2011)。
[0010] 最近，已推薦雞對彎曲桿菌屬（Campylobacter spp.)物種的感受性或抗性依賴于 宿主的遺傳系統(tǒng)及涉及非-免疫和免疫機理（Kaiser等人，2009)。因此，選擇性繁殖會是 選擇擴展基因遺傳的抗性雞系的方法。在這點上，在4種近交雞系之間觀察到彎曲桿菌屬 (Campylobacter spp.)物種定居中10~100倍數(shù)差異，和遺傳的抗性模式與單常染色體顯 性座位一致（Boyd等人，2005)。但是，抗性雞系的建立而保持肉或卵生產(chǎn)和質量是具有無 法預測的結果的耗時過程。至今，無上述的實驗干預已在領域水平模形化或應用，因此，無 已成功地商業(yè)化。
[0011] 抗體最初在1890年代早期由Behring和Kitasato認識為有效抗微生物劑 (Behring&Kitasato, 1890 ;Casadevall等人，2004)，然后，由于血清治療成為對抗許多感 染性疾病的有效策略。血清或腸分泌中特異性抗體的存在具有相關于兔（Burr等人，1988 ; Pavlovskis 等人，1991 ;Rollwagen 等人，1993)和小鼠（Dolby&Newell 1986 ;Rollwagen 等人，1993)對空腸彎曲桿菌（C. jejuni)定居的抗性。在年輕的雞（小于2~3周齡） 中，針對彎曲桿菌屬（Campylobacter spp.)物種的母源抗體的存在延遲畜群中空腸彎曲桿 菌（C. jejuni)的定居的初現(xiàn)及減小畜群中空腸彎曲桿菌（C. jejuni)的橫向傳播的速度 (Sahin等人，2003)，提示使用抗-彎曲桿菌屬（Campylobacter spp.)物種抗體的被動免疫 治療可為干擾雞中細菌定居的有吸引力的方法。的確，用抗-鞭毛單克隆抗體的被動免疫 已顯示減少小鼠中空腸彎曲桿菌（C. jejuni)定居（Ueki等人.1987)。類似地，使用超免疫 抗-空腸彎曲桿菌（C. jejuni)兔血清或抗-空腸彎曲桿菌（C. jejuni)抗體呈現(xiàn)在雞中減 少空腸彎曲桿菌（C. jejuni)定居中有效（Stern等人，1990)。與此一致的是，其他顯示了 在血中循環(huán)高滴度的彎曲桿菌屬（Campylobacter spp.)物種-特異性IgG的家禽屠宰場 工人罕見患彎曲菌?。–awthraw等人，2000)。盡管觀察到全部這些，用于減少彎曲桿菌屬 (Campylobacter)負荷的作為藥劑的抗體未獲得市場大量注意，由于高生產(chǎn)成本，常規(guī)抗體 對GI道蛋白酶的敏感性，缺乏有效GI道遞送系統(tǒng)，及在彎曲桿菌屬（Campylobacter spp.) 物種之中高抗原性變異，這需要革G向彎曲桿菌屬（Campylobacter)的不同株的多種抗體制 備物。
[0012] 美國專利No. 8, 173, 130 (Salzman等人），美國專利公開 No. 2009/0208506 (Rachamim 等人），及美國專利公開 No. 2010/0239583 (Murthy 等人）描述 了針對來自各種革蘭氏陰性細菌（包括彎曲桿菌屬（Campylobacter))的鞭毛蛋白的單克 隆抗體，其可用于制止細菌感染，以及治療或預防疾病包括炎性腸疾病。這些抗體共享該分 子的常見的缺點，包括加工困難，生產(chǎn)困難和生產(chǎn)成本，及當體內(nèi)使用時的慢組織穿透。此 外，mAb和其片段（例如，scFv和Fab)對GI道蛋白酶非常敏感，這在期望口服施用時是不 利的。
[0013] 兔和小鼠的血清或腸分泌中特異性抗體的存在已相關于對空腸彎曲桿菌 (C. jejuni)消化道定居的抗性。雞中的研宄也提示，活性免疫可減小由空腸彎曲桿菌 (C. jejuni)的腸感染水平，但在雞的早期處死之前獲得足夠的免疫應答的時間窗，以及成 本和可行性使此方法不切實際。
[0014] 在源頭，特別家禽飼養(yǎng)場之內(nèi)控制彎曲桿菌屬（Campylobacter)會減少人暴露于 病原體的風險，和會對食品安全性和公共健康具有顯著沖擊。有利地，更安全食品供應允許 提供商避免昂貴的操作關閉和產(chǎn)品召回。減少環(huán)境暴露，改善生物安全，競爭性排除，疫苗 接種，宿主遺傳學選擇，及抗微生物或抗生素策略（包括噬菌體治療和細菌素治療）是有益 的，但對于減少食品供應中空腸彎曲桿菌（C. jejuni)的改善的策略仍有需求。對由空腸彎 曲桿菌（Campylobacter jejuni)呈現(xiàn)的攻擊的創(chuàng)新的方法會對公眾有益處。
[0015] 因此，本領域對于減少食品供應中空腸彎曲桿菌（C. jejuni)的成本-有效方法仍 有需求；本領域對于具有高親和性、但可克服IgG和它們的變體的缺點的抗體也仍有需求。
[0016]【發(fā)明概述】
[0017] 本發(fā)明總的涉及抗體，其片段及涉及該蛋白的衍生物和應用。描述的抗體和片段 針對空腸彎曲桿菌（c. jejuni)的鞭毛蛋白。
[0018] 分離的或純化的抗體或其片段如在本文描述，以及其修飾，包括多聚體形式，諸如 五聚抗體。顯示抗體或其片段對空腸彎曲桿菌（c. jejuni)鞭毛的親和性特異性。例如當 經(jīng)口施用時，抗體顯示減少雞中空腸彎曲桿菌（C. jejuni)定居水平的功效。公開的抗體展 示與細菌鞭毛的特異性結合。本文所述的抗體和多聚體減少空腸彎曲桿菌（C. jejuni)運 動性。還描述具有有利的生物物理學性質的其他變體。通過特定淘選努力和二硫鍵加工策 略，抗體被描述展示良好熱穩(wěn)定性和蛋白酶耐受性或抗性。也描述超穩(wěn)定化的抗體或其片 段，對主要胃腸（GI)蛋白酶具有更優(yōu)熱穩(wěn)定性和抗性。
[0019]由此，本發(fā)明提供與空腸彎曲桿菌（C. jejuni)鞭毛特異性結合的分離的或純化 的抗體或其片段，其包含
[0020] 互補決定區(qū)（CDR)l，其包含序列 GLTFRNFHMA(SEQ ID N0:1)或 VSTFSINALG(SEQ ID NO:4)；
[0021] CDR2,其包含序列 ISWSRDRQ(SEQ ID N0:2)或 IGSDGTV(SEQ ID N0:5);以及
[0022] CDR3，其包含序列 AARTASASGDWYKGSYQY (SEQ ID NO: 3)或 NAAGKRIGSDGSIWFAVASFGS(SEQ ID N0:6)〇
[0023] 上述分離的或純化的抗體或其片段可包含序列GLTFRNFHMA(SEQ ID N0:1)的 CDR1，序列 ISWSRDRQ(SEQ ID N0:2)的CDR2,及序列 AARTASASGDWYKGSYQY(SEQ ID N0:3)的 CDR3。更特別是，分離的或純化的抗體或其片段可包含以下序列：
[0024] QVX1LX2ESGGGLVQAGGSRRLSCATSGLTFRNFHMAWFRQVAGKEREVVX 3AISffSRDRQYYPDPVKGR FTX4TRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAARTASASGDWYKGSYQYWGQGTQVTVSS(SEQ ID N0:7),
[0025] 其中Xi=K或Q ;X2=E或V ;X3=A或C ;X4= I或C ;或基本上與之相同的序列。 在特定的非限制性例中，分離的或純化的抗體或其片段可包含以下序列：
[0026] QVKLEESGGGLVQAGGSRRLSCATSGLTFRNFHMAWFRQVAGKEREVVAAISWSRDRQYYPDPVKGRFT ITRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAARTASASGDWYKGSYQYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:8)；
[0027] QVQLVESGGGLVQAGGSRRLSCATSGLTFRNFHMAWFRQVAGKEREVVAAISWSRDRQYYPDPVKGRFT ITRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAARTASASGDWYKGSYQYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:9)；
[0028] QVKLEESGGGLVQAGGSRRLSCATSGLTFRNFHMAWFRQVAGKEREVVCAISWSRDRQYYPDPVKGRFT CTRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAARTASASGDWYKGSYQYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:10)；
[0029] QVQLVESGGGLVQAGGSRRLSCATSGLTFRNFHMAWFRQVAGKEREVVCAISWSRDRQYYPDPVKGRFT CTRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAARTASASGDWYKGSYQYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:11)；
[0030] 或基本上與之相同的序列。
[0031] 或者，分離的或純化的抗體或其片段可包含序列VSTFSINALG(SEQ ID N0:4)的 CDR1，序列 IGSDGTV(SEQ ID N0:5)的CDR2,及序列NAAGKRIGSDGSIWFAVASFGS(SEQ ID N0:6) 的CDR3。更特別是，分離的或純化的抗體或其片段可包含以下序列：
[0032]qvx1lx2esggglvqaggslrvsctasvstfsinalgwyrqapgkarelvx 3aigsdgtvyytdsvkgrf tx4srdnakntvslqmsslkpedtavyycnaagkrigsdgsiwfavasfgswgqgtqvtvss(seqID NO:12),
[0033] 其中Xl=K或Q ;X2=E或V ;X3=A或C ;X4= I或C ;或基本上與之相同的序列。 在特定的非限制性例中，分離的或純化的抗體或其片段