專利名稱：抑制空腸彎曲桿菌細(xì)菌感染的抗原組合物和方法及該抗原組合物的用途的制作方法
抑制空腸彎曲桿菌細(xì)菌感染的抗原組合物和方法及該抗原
組合物的用途本公開(kāi)內(nèi)容涉及在家禽中和人類(lèi)中降低空腸彎曲桿菌(C. jejuni)細(xì)菌感染的發(fā)生率，且更具體地涉及用于在動(dòng)物中產(chǎn)生針對(duì)空腸彎曲桿菌的免疫應(yīng)答的新穎抗原組合物、疫苗和方法。背景下文包括可用于理解本發(fā)明的信息。它并不承認(rèn)本文所提供的任何信息是現(xiàn)有技術(shù)或與目前描述的或主張的發(fā)明有關(guān)，或被明確地引用或隱含地引用的任何出版物或文獻(xiàn)是現(xiàn)有技術(shù)。彎曲桿菌Campylobacter)細(xì)菌屬是革蘭氏陰性的、螺旋形可運(yùn)動(dòng)病原菌，包括大量與多種動(dòng)物(家畜和野生動(dòng)物)有關(guān)的種，常見(jiàn)于雞、火雞、牛、羊、馬和嚙齒類(lèi)動(dòng)物。 該細(xì)菌可通過(guò)多種傳播途徑感染宿主動(dòng)物，包括通過(guò)食物、水和通過(guò)與其他動(dòng)物相接觸。 普遍的是屠宰場(chǎng)中的肉的污染。人類(lèi)通過(guò)操作或食用家禽產(chǎn)品而頻繁地感染空腸彎曲桿菌。人類(lèi)中的彎曲桿菌感染也超過(guò)了沙門(mén)氏菌感染的數(shù)量(Walker等人，Microbiological reviews, 50 :81-94(1986)) 0空腸彎曲桿菌是分離的與人類(lèi)腹瀉有關(guān)的最常見(jiàn)的彎曲桿菌種。在美國(guó)，空腸彎曲桿菌是每年導(dǎo)致2百萬(wàn)至3百萬(wàn)食物傳染疾病的病例的原因，且所估計(jì)的治療成本和生產(chǎn)力損失每年為80億美元(Buzby，J. C.等人(1997)，J. Infect, Dis. 176增刊2 :S192-197)。由空腸彎曲桿菌導(dǎo)致的腹瀉通常發(fā)病約2_7天，且是自限性的，但幼兒、老年人和免疫受損個(gè)體中的感染常需要抗生素治療。彎曲桿菌可以在人類(lèi)中引起腸道感染，且有時(shí)導(dǎo)致更嚴(yán)重的疾病如腦膜炎、神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥、闌尾炎、尿道感染和自發(fā)流產(chǎn)(Blaser 等人，New Engl, J. Med.，305 :1444-1452 (1981)，Butzler 等人，Clinics in Gastroenterol.，8 :737-765 (1979)，Schwerer 等人，J. Endotox. Res, 2 :395-403 (1995) 和Salloway等人，Infect. Immun. 64 :2945-2949 (1996)?？漳c彎曲桿菌感染還與格林-巴利綜合征(Guillain-Barre syndrome)有關(guān)(Altos, B. Μ. (2001)，Clin. Infect, Dis，32 1201-1206)鑒于與該傳染原有關(guān)的問(wèn)題的嚴(yán)重性，非常需要用于在鳥(niǎo)、家禽和人類(lèi)中抑制和防止空腸彎曲桿菌感染的新穎組合物和方法。本文描述的發(fā)明滿足了該需要。概述本發(fā)明的實(shí)施方案涉及空腸彎曲桿菌抗原，其可用于在動(dòng)物中弓丨起針對(duì)空腸彎曲桿菌的免疫應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中，免疫應(yīng)答是保護(hù)性免疫應(yīng)答，并防止(或明顯降低) 空腸彎曲桿菌在被施用抗原的動(dòng)物中定殖或建立感染的能力。雖然任何年齡的動(dòng)物可受益于抗原性組合物的施用，青年(青少年)、尤其是新生的動(dòng)物常是疫苗接種的目標(biāo)。已將CadF抗原、FlpA抗原和FlaA抗原鑒定為特別有效的抗原。不受任何理論束縛，認(rèn)為至少部分地暴露于空腸彎曲桿菌的表面上的這些抗原在介導(dǎo)空腸彎曲桿菌附著于動(dòng)物細(xì)胞并由此感染動(dòng)物細(xì)胞中具有作用，并可能是介導(dǎo)空腸彎曲桿菌附著于動(dòng)物細(xì)胞并由此感染動(dòng)物細(xì)胞所必需的。向動(dòng)物施用這些抗原(完整的蛋白或其免疫學(xué)有效的部分) 引起動(dòng)物產(chǎn)生針對(duì)這些抗原的抗體。當(dāng)隨后將動(dòng)物暴露于空腸彎曲桿菌時(shí)，抗體與細(xì)菌表面上的這些抗原性蛋白結(jié)合，而防止或阻遏細(xì)菌與細(xì)胞結(jié)合并感染細(xì)胞。雖然CadF、FlpA和FlaA是單獨(dú)地或組合地用于針對(duì)空腸彎曲桿菌感染的特別有效的抗原，還考慮了對(duì)于其常見(jiàn)空腸彎曲桿菌抗體反應(yīng)的其他抗原的使用，所述其他抗原包括以下的空腸彎曲桿菌蛋白/多肽中的一種或多種CmeA、CmeC, CjaA, CjaC, CJJ81176_0126 或 CJJ81176_0126 同源物、CJJ81176_0128 或 CJJ81176_0128 同源物、CJJ81176_0164 或 CJJ81176_0164 同源物、CJJ81176_0164 或 CJJ81176_0164 同源物或 CJJ81176_0164、CJJ81176JJ586 或 CJJ81176_0586 同源物、CJJ81176_1185 或 CJJ81176_1185 同源物、CJJ81176_1295 或 CJJ81176_1295 同源物、CJJ81176_1525 或 CJJ81176_1525 同源物、FlaB、FlgE2、PEB2、PEB3、PorA、MapA 和 SdhB，或這些中任一種的一個(gè)或多個(gè)抗原性片段。在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)lpA基于其與人類(lèi)細(xì)胞和纖連蛋白的結(jié)合，可用于向人類(lèi)細(xì)胞提供抗原、藥劑(pharmaceutical)、藥物(drug)(例如，抗癌藥物)、毒素等。可類(lèi)似地使用空腸彎曲桿菌的其他抗原，例如，以與感興趣的物質(zhì)的嵌合體或融合產(chǎn)物的形式來(lái)使用。本發(fā)明提供了用于防止或治療空腸彎曲桿菌在動(dòng)物中定殖的方法。該方法包括以下的步驟向動(dòng)物提供1) 一種或多種空腸彎曲桿菌多肽；或幻經(jīng)基因工程以含有并表達(dá)編碼一種或多種空腸彎曲桿菌多肽的核酸序列的宿主。本發(fā)明還提供了經(jīng)基因工程化以含有并表達(dá)一種或多種空腸彎曲桿菌多肽的核酸序列的宿主。本發(fā)明的另外的實(shí)施方案提供了具有來(lái)自空腸彎曲桿菌的至少一種異源多肽的內(nèi)部插入物的經(jīng)修飾的細(xì)菌S-層蛋白。本發(fā)明還提供了用于在動(dòng)物中產(chǎn)生針對(duì)空腸彎曲桿菌的免疫應(yīng)答的抗原性組合物。所述抗原性組合物包括1)選自由空腸彎曲桿菌CadF、FlaA、FlpA和其抗原性片段組成的組的至少一種第一多肽；和2)不同于所述第一多肽的至少一種第二空腸彎曲桿菌多肽。本發(fā)明還提供了用于向受治療者遞送感興趣的物質(zhì)的方法。所述方法包括以下步驟1)向受治療者提供含有空腸彎曲桿菌的纖連蛋白結(jié)合蛋白和感興趣的物質(zhì)的融合產(chǎn)物，其中所述纖連蛋白結(jié)合蛋白和所述感興趣的物質(zhì)彼此關(guān)聯(lián)(associated with one another)；和2、允許所述融合產(chǎn)物在所述受治療者的細(xì)胞或組織中與纖連蛋白結(jié)合。附圖簡(jiǎn)述圖IA和B顯示了 Cj S3B-SPF血清針對(duì)提取自A，同源菌株(S3B)和B，異源菌株 (81-176)的空腸彎曲桿菌外膜蛋白的反應(yīng)性。χ軸的數(shù)字表示血清樣品的標(biāo)識(shí)號(hào)。垂直條柱代表算術(shù)平均值，誤差線代表三個(gè)重復(fù)樣品的標(biāo)準(zhǔn)偏差。水平線代表從采集自未被空腸彎曲桿菌定殖的對(duì)照雞的9種血清中確定的陰性截?cái)嘀?。圖2.數(shù)據(jù)代表如從用Cj S3B-SPF血清探針檢測(cè)的空腸彎曲桿菌同源菌株(S3B) 和異源菌株(81-176)的外膜蛋白(OMP)提取物的免疫印跡中確定的，與母體抗體反應(yīng)的條帶的存在(X =強(qiáng)反應(yīng)性，0 =弱反應(yīng)性)或不存在(空白)，以表格形式呈現(xiàn)。圖3顯示Cj S3B-SPF混合血清含有降低空腸彎曲桿菌S3B的運(yùn)動(dòng)性的抗體但沒(méi)有降低空腸彎曲桿菌81-176的運(yùn)動(dòng)性的抗體。圖A，用空腸彎曲桿菌S;3B菌株進(jìn)行的運(yùn)動(dòng)性測(cè)定；和B，用空腸彎曲桿菌81-176菌株進(jìn)行的運(yùn)動(dòng)性測(cè)定。水平線(白色)表示斑點(diǎn)的直徑(SP，從細(xì)菌區(qū)域的中心到邊緣)。
圖4示出了通過(guò)LC/MALDI/T0F-T0F鑒定的空腸彎曲桿菌81-176外膜蛋白。圖5描繪了通過(guò)納升級(jí)LC/MS/MS (nano-LC/MS/MS)鑒定的預(yù)測(cè)的“最適 (best-fit)，，免疫原性膜相關(guān)空腸彎曲桿菌蛋白。圖6顯示了與雞LMH肝細(xì)胞癌上皮細(xì)胞結(jié)合的空腸彎曲桿菌的數(shù)量。每個(gè)條柱代表與M孔板的每個(gè)孔的LMH細(xì)胞結(jié)合的空腸彎曲桿菌的平均值士標(biāo)準(zhǔn)偏差。星號(hào)(*)表示如利用學(xué)生t-檢驗(yàn)所確定的，空腸彎曲桿菌F38011野生型分離株和同基因突變體之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的差異(P < 0. 05)。圖7顯示了 CadF、PEBl和Cjl279c有利于肉雞的空腸彎曲桿菌定殖?！癗”表示在 10只雞的組中被空腸彎曲桿菌定殖的雞的數(shù)量(檢測(cè)限IO3CFU/克盲腸內(nèi)容物)。條柱表示每組的中值CFU，其是利用組中的所有鳥(niǎo)來(lái)確定的。不存在條柱時(shí)表示空腸彎曲桿菌的數(shù)量低于檢測(cè)限。圖8顯示了 Cjl279c(flpA)編碼粘附素。每個(gè)條柱代表與24-孔板的每個(gè)孔中的LMH細(xì)胞結(jié)合的空腸彎曲桿菌的數(shù)量的平均值士標(biāo)準(zhǔn)偏差。星號(hào)(*)表示如利用學(xué)生 t-檢驗(yàn)所確定的，空腸彎曲桿菌F38011野生型分離株和同基因突變體之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的差異(P < 0. 05)。圖9.空腸彎曲桿菌NCTC 11168菌株中flpA基因的顯著特征和其推斷的氨基酸序列?？漳c彎曲桿菌F38011菌株中的flpA基因是含有總共4個(gè)基因的多順?lè)醋硬倏v子中的第二個(gè)基因。NCTC 11168中的flpA基因是1236個(gè)核苷酸。FlpA推斷的氨基酸序列的檢查顯示在NCTC 11168菌株、RM1221菌株、81-176菌株、81116菌株和F38011菌株(箭頭) 中，在三個(gè)纖連蛋白3型結(jié)構(gòu)域0^3，第40-132位殘基、第135-227位殘基和第220-407位殘基)，和原核膜脂蛋白脂質(zhì)附著位點(diǎn)(箭頭)中幾乎沒(méi)有殘基的差異。“a”=在以上所列的四種空腸彎曲桿菌的序列(SEQ ID NO 50)的一個(gè)或多個(gè)中不同的殘基；“b” =纖連蛋白，II型結(jié)構(gòu)域(SSF4^65，第40至132位殘基，第135至227位殘基，第220至407位殘基)；“c”=原核膜脂蛋白附著位點(diǎn)。圖IOA和B.如通過(guò)用FlpA特異性血清進(jìn)行的免疫印跡分析所判斷的，對(duì)從空腸彎曲桿菌F38011野生型菌株和flpA同基因突變體中制備的空腸彎曲桿菌全細(xì)胞裂解物 (WCL)和外膜蛋白(OMP)提取物中的FlpA的檢測(cè)。WCL和OMP提取物通過(guò)SDS-PAGE (12. 5% 聚丙烯酰胺)和免疫印跡分析來(lái)解析，如“材料和方法”中所描述。圖㈧的左側(cè)的印跡顯示了用FlpA特異性血清探針檢測(cè)的空腸彎曲桿菌WCL的印跡，和圖(B)的右側(cè)的印跡顯示了用FlpA特異性血清探針檢測(cè)的空腸彎曲桿菌OMP的印跡。泳道1，空腸彎曲桿菌F38011 野生型菌株；2，空腸彎曲桿菌f IpA突變體；和3，空腸彎曲桿菌f IpA (f IpA+)補(bǔ)償菌株。突出顯示了 FlpA 46kDa蛋白的位置(箭頭)。左側(cè)指出了分子量標(biāo)準(zhǔn)的位置(單位為kDa)。

圖11. FlpA蛋白含有表面暴露的結(jié)構(gòu)域。利用空腸彎曲桿菌F38011野生型菌株 (圖A-C)和flpA同基因突變體(圖D-F)進(jìn)行了間接的免疫熒光顯微術(shù)，如“材料和方法” 中所描述。利用兔FlpA特異性血清孵育空腸彎曲桿菌(圖A-F)，然后用Cy2軛合的山羊抗兔第二抗體進(jìn)行孵育。通過(guò)用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色來(lái)察看所有細(xì)菌。 利用Nikon Eclipse TE2000倒置落射熒光顯微鏡來(lái)察看樣本。容易地觀察到了用兔α-空腸彎曲桿菌全細(xì)胞血清孵育的空腸彎曲桿菌野生型菌株和flpA突變體(未示出)，而僅有用兔FlpA特異性血清孵育的空腸彎曲桿菌野生型菌株被染色。
圖12. FlpA促進(jìn)了空腸彎曲桿菌與人類(lèi)上皮細(xì)胞的結(jié)合。用人類(lèi)INT407上皮細(xì)胞和空腸彎曲桿菌F38011野生型菌株、cadF突變體、flpA突變體和flpA(flpA+)補(bǔ)償菌株進(jìn)行體外粘附測(cè)定，如“材料和方法”中所描述。包括作為陰性對(duì)照的空腸彎曲桿菌cadF 突變體，因?yàn)槲墨I(xiàn)中已廣泛記載CadF是粘附素。數(shù)值代表與M孔組織培養(yǎng)盤(pán)的每個(gè)孔的 INT 407細(xì)胞結(jié)合的活細(xì)菌的平均值士標(biāo)準(zhǔn)偏差。星號(hào)(*)表示如通過(guò)學(xué)生t檢驗(yàn)所判斷的，與INT 407細(xì)胞結(jié)合的細(xì)菌的數(shù)量和空腸彎曲桿菌野生型菌株的數(shù)量存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (P < 0. 01)。圖13.利用FlpA特異性血清抑制空腸彎曲桿菌與人類(lèi)INT 407上皮細(xì)胞結(jié)合。在接種INT 407細(xì)胞之前用FlpA特異性血清或出血前(prebleed)血清的指示稀釋液孵育細(xì)菌30分鐘。如“材料和方法”中所描述的進(jìn)行粘附測(cè)定。數(shù)值代表與M孔組織培養(yǎng)盤(pán)的每個(gè)孔的INT 407細(xì)胞結(jié)合的活細(xì)菌的平均值士標(biāo)準(zhǔn)偏差。星號(hào)(*)表示如通過(guò)學(xué)生t 檢驗(yàn)所判斷的，與INT 407細(xì)胞結(jié)合的細(xì)菌的數(shù)量和空腸彎曲桿菌野生型菌株的數(shù)量存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P <0.01)。圖14. FlpA與纖連蛋白的結(jié)合是可飽和的。用FlpA-GST蛋白和CadF-GST蛋白的 2倍連續(xù)稀釋液孵育纖連蛋白包被的孔，并如“材料和方法”中所描述的檢測(cè)所結(jié)合的蛋白。 包括作為陽(yáng)性對(duì)照的空腸彎曲桿菌CadF蛋白。重復(fù)三次檢驗(yàn)樣品，且每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)含有代表性實(shí)驗(yàn)的平均值士標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖15A和B. CadF和FlpA介導(dǎo)與宿主細(xì)胞和而的結(jié)合。A，利用人類(lèi)INT 407上皮細(xì)胞和空腸彎曲桿菌F38011野生型菌株、cadF突變體、flpA突變體和cadF flpA雙突變體進(jìn)行體外粘附測(cè)定，如“材料和方法”中所描述。數(shù)值代表與M孔組織培養(yǎng)盤(pán)的每個(gè)孔的INT 407細(xì)胞結(jié)合的活細(xì)菌的平均值士標(biāo)準(zhǔn)偏差。星號(hào)(*)表示如通過(guò)學(xué)生t檢驗(yàn)所判斷的，與INT 407細(xì)胞結(jié)合的細(xì)菌的數(shù)量和空腸彎曲桿菌野生型菌株的數(shù)量存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P <0.01)。B，利用活細(xì)菌和1 包被的孔進(jìn)行空腸彎曲桿菌- 結(jié)合測(cè)定，如“材料和方法”中所描述。結(jié)果表示為所結(jié)合的細(xì)菌相對(duì)于空腸彎曲桿菌F38011野生型菌株的百分比。圖16A-C.用于本研究的1 和1 片段的圖解A，全長(zhǎng)纖連蛋白0 ) ；B, Fn N-末端結(jié)構(gòu)域(NTD) ；C，明膠結(jié)合結(jié)構(gòu)域(GBD)。NTD和GBD通過(guò)用嗜熱菌蛋白酶消化1 產(chǎn)生。圖17A-C. FlpA蛋白、FlpA結(jié)構(gòu)域和合成的肽的一級(jí)結(jié)構(gòu)A，全長(zhǎng)的FlpA，“S”標(biāo)明了信號(hào)肽，B，三個(gè)FlpAFN3樣重復(fù)序列的GST融合蛋白，C，F(xiàn)lpA結(jié)構(gòu)域2 (FlpA_D2)的氨基酸序列和7個(gè)合成肽P1-P7的氨基酸序列。預(yù)測(cè)β鏈二級(jí)結(jié)構(gòu)的氨基酸序列用<_>和灰色框來(lái)表示。圖18Α和B. A，F(xiàn)lpA和三個(gè)FlpA FN3樣結(jié)構(gòu)域(D1、D2和D3)對(duì)Fn包被的孔的附著。利用用lygWi^n過(guò)夜包被的孔來(lái)進(jìn)行ELISA。將GST融合蛋白(FlpA全長(zhǎng)、FlpA-Dl、 FLpA-D2和FlpA-D； )的連續(xù)稀釋液添加到每孔中。用針對(duì)GST的第一抗體和第二 HR軛合物來(lái)檢測(cè)所結(jié)合的FlpA蛋白的量。如材料和方法中所描述的對(duì)所有樣品重復(fù)三次進(jìn)行操作。 B, Fn對(duì)包被有FlpA和三個(gè)FlpAFN3樣結(jié)構(gòu)域的孔的附著。對(duì)于ELISA實(shí)驗(yàn)，利用FlpA全長(zhǎng)、FlpA-Dl、FlpA-D2、和FlpA_D3過(guò)夜包被孔。將1 的連續(xù)稀釋液添加到每孔。用抗1 的第一抗體和第二 HR軛合物檢測(cè)結(jié)合的FlpA蛋白的量。圖19. 對(duì)于用FlpA肽P1-P5包被的孔的附著。為確定哪種肽與1 結(jié)合，用5種FlpA肽過(guò)夜包被ELISA板。在孔中孵育而，并如先前進(jìn)行檢測(cè)。
20. FlpA P7 (m47_S166)含有FlpA Fn結(jié)合結(jié)構(gòu)域。如先前進(jìn)行ELISA。用 FlpA肽包被微量滴定板，并用分光光度法確定結(jié)合的1 的量。圖21. Clustalff序列比對(duì)。將FlpA_D2 (第135-2M位氨基酸)的氨基酸序列與來(lái)自1 的FN3結(jié)構(gòu)域的序列相比較。FlpA-D2與FN31最相似，共有22. 9%序列同一性， 15. 7%保守性置換，和21. 7%半保守性置換。圖22A-D. FlpA結(jié)合1 的明膠結(jié)合結(jié)構(gòu)域(GBD)中的位點(diǎn)。進(jìn)行ELISA以確定 FlpA是否結(jié)合1 的NTD或GBD。用i^、GBD、NTD或卵清蛋白(陰性對(duì)照)過(guò)夜包被微量滴定板。將A，F(xiàn)lpA全長(zhǎng)，B, FlpA-Dl, C，F(xiàn)LpA_D2，和D，F(xiàn)lpA_D3的連續(xù)稀釋液添加到孔中并如先前確定所結(jié)合的FlpA蛋白的量。圖23示出了空腸彎曲桿菌對(duì)肉雞的定殖。在孵化的第1天和孵化后第4天將乳酸桿菌通過(guò)口服填喂( IO8CFU)施用于肉雞。在孵化后第14天通過(guò)口服填喂將空腸彎曲桿菌F38011( IO8CFU)施用于接受空腸彎曲桿菌攻擊的小雞。在(A)攻擊后第7天，使一半的雞安樂(lè)死并進(jìn)行剖檢，并在(B)攻擊后第14天，使剩余的雞安樂(lè)死并進(jìn)行剖檢。從每只雞中切取盲腸，稱重，稀釋于等體積的MH肉湯中，并徹底消化。將樣品進(jìn)行連續(xù)稀釋并鋪板于Campy Cefex瓊脂上以用于計(jì)數(shù)。圖24A和B顯示了抗空腸彎曲桿菌血清抗體。如材料和方法中所描述的，在㈧攻擊后第7天和(B)攻擊后第14天通過(guò)ELISA確定肉雞中的抗空腸彎曲桿菌血清抗體的水平。用空腸彎曲桿菌全細(xì)胞裂解物來(lái)包被微量滴定板，并用來(lái)自雞的血清進(jìn)行孵育。χ-軸顯示了雞樣品標(biāo)識(shí)號(hào)和處理組。每個(gè)樣本的抗體水平通過(guò)白色條柱來(lái)表示。空腸彎曲桿菌 (灰色)和乳酸桿菌(黑色)的微生物計(jì)數(shù)顯示為CFU/克盲腸內(nèi)容物。圖25A和B顯示了抗α毒素血清抗體。如材料和方法中所描述的，通過(guò)ELISA確定(A)攻擊后第7天和(B)攻擊后第14天肉雞中的抗產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌(Clostridium perfringens) α毒素血清抗體的水平。X軸顯示了雞樣品標(biāo)識(shí)號(hào)和處理組。每個(gè)樣本的抗體水平通過(guò)白色條柱來(lái)表示?？漳c彎曲桿菌(灰色)和乳酸桿菌(黑色)的微生物計(jì)數(shù)顯示為CFU/克盲腸內(nèi)容物。圖沈顯示了從口服接種空腸彎曲桿菌的肉雞中采集的血清中的抗體的反應(yīng)性。 在用空腸彎曲桿菌81116接種后15天從雞中采集血液。泳道1，空腸彎曲桿菌81116全細(xì)胞裂解物(wcl) ；2，空腸彎曲桿菌81116外膜蛋白(omp)制備物；和3，空腸彎曲桿菌 81116wcl。右圖中顯示的印跡是利用1 50稀釋的雞血清孵育的。箭頭突出顯示了已知的蛋白(62kDa = FlaA,37kDa = CadF)，迄今發(fā)現(xiàn)它們與被檢驗(yàn)的每個(gè)血清(n = 10)相反應(yīng)。實(shí)心點(diǎn)表示其身份將通過(guò)質(zhì)譜法來(lái)確定的蛋白。圖27顯示了對(duì)空腸彎曲桿菌FlaA纖絲蛋白的分析。將來(lái)自沈個(gè)FlaA蛋白的推斷的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)以確定保守區(qū)域。陰影示出的是分別具有高于90%氨基酸同一性和50%氨基酸同一性的殘基/區(qū)域。黑線指示了增高的變異性的區(qū)域(即，非保守的，插入或缺失)。彩圖下指示的30-mer(SEQ ID NO 3)代表了其中30個(gè)殘基中的觀個(gè)為90%以上保守的區(qū)域。相對(duì)于殘基220下游的區(qū)域，191-220區(qū)域代表了用于摻入乳酸桿菌S層蛋白的良好靶標(biāo)。圖觀顯示了瑞士乳桿菌(L.helVetiCus)SlpA蛋白的親水性分布圖。Y-軸顯示的是，對(duì)中心位于X-軸上所列的殘基數(shù)目的19個(gè)殘基窗口所計(jì)算的單位為千卡/摩爾的親水性。圖四顯示了 CadF !^n-BD摻入到瑞士乳桿菌S層蛋白中。A圖是CBB-R250染色的凝膠。B圖是用山羊α -CadF血清探針檢測(cè)的印跡。泳道1，從野生型菌株提取的S層蛋白；2， 具有野生型slpA等位基因的轉(zhuǎn)化體；3和4，在slpA基因的位點(diǎn)1具有CadF Fn-BD (12mer) 的獨(dú)立的轉(zhuǎn)化體。(箭頭)指示了具有CadF Fn-BD的S層。圖30顯示了為將定殖接種乳酸桿菌疫苗菌株的雞與非疫苗接種的雞的空腸彎曲桿菌的數(shù)量相比較而進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。在每個(gè)實(shí)驗(yàn)組中有20只鳥(niǎo)。圖31示出了雞的空腸彎曲桿菌定殖與重組的新月柄桿菌(CaulcAacter crescentus)的競(jìng)爭(zhēng)排他。N =接種后兩周在其盲腸中具有可檢測(cè)數(shù)量的空腸彎曲桿菌的 (10只中的)鳥(niǎo)的數(shù)量。新月柄桿菌CadF/FlaA/PorA是疫苗菌株。圖32示出了抑制雞的定殖并刺激抗CadF肽(第128-143位氨基酸)的特異性抗體反應(yīng)的新月柄桿菌CadF/FlaA2/P0rA疫苗菌株。圖33A-C.來(lái)自8種不同的空腸彎曲桿菌菌株的FlaA序列的比較。詳述本發(fā)明的實(shí)施方案提供了免疫原性的空腸彎曲桿菌抗原，其為免疫原性的并可用來(lái)在施用抗原的動(dòng)物中引起針對(duì)空腸彎曲桿菌的免疫應(yīng)答。感興趣的特定的抗原包括 CadF, FlaA和FlpA，以及如本文所描述的(例如，在表1中)其他抗原。本文所呈現(xiàn)的結(jié)果首次顯示被良好表征的37kDa纖連蛋白結(jié)合蛋白CadF在雞中是免疫原性的。值得注意的是，在空腸彎曲桿菌S;3B菌株和81-176菌株兩者中均檢測(cè)到雞的空腸彎曲桿菌定殖所必需的CadF蛋白(Ziprin，R. L.，等.(1999)，Avian Dis. 43 :586-589)。本文所鑒定和提供的CadF的優(yōu)選的表位包括30-氨基酸序列 HYGAGVKFRLSDSLALRLETRDQINFNHAN(第 127-156 位殘基，SEQ ID NO 1)和其能夠產(chǎn)生所期望的免疫應(yīng)答的片段，例如，序列FRLS (SEQ ID NO 2)。FlpA抗原或其免疫原性的部分還可用于本發(fā)明的方法和組合物中。在一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)lpA的免疫原性部分是FlpA的第141-170位殘基FVQAVTNLPNRIKLIWRPHPDFRVDSYI IE(SEQ ID NO :3)。FlaA抗原或其免疫原性部分還可用于本發(fā)明的組合物和方法中。在一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)laA 的免疫原性部分是 FlaA 的第 278-307 位殘基INAVKDTTGVEASIDANGQLVLTSADGRGI (SEQ ID NO 4)ο定義以下或本說(shuō)明書(shū)中其他處未定義的術(shù)語(yǔ)應(yīng)具有其領(lǐng)域公認(rèn)的含義。本文所提供的化合物(例如，肽和蛋白)中所用的氨基酸可以是遺傳編碼的氨基酸、天然存在的非遺傳編碼的氨基酸、或合成的氨基酸。以上中的任何的L-對(duì)映體和D-對(duì)映體二者可用于化合物中。以下的縮略語(yǔ)可在本文中使用以用于以下遺傳編碼的氨基酸 (和其殘基)丙氨酸(Ala,A)；精氨酸(Arg,R)；天冬酰胺(Asn,N)；天冬氨酸(Asp，D)；半胱氨酸(Cys，C)；甘氨酸(Gly，G)；谷氨酸(Glu，Ε)；谷氨酰胺(Gln，Q)；組氨酸(His，H)； 異亮氨酸(lie，I)；亮氨酸(Leu，L)；賴氨酸(Lys，K)；甲硫氨酸(Met，M)；苯丙氨酸(Wie， F)；脯氨酸(Pro, P)；絲氨酸(Ser, S)；蘇氨酸(Thr，T)；色氨酸(Trp，W)；酪氨酸(Tyr，Y)；和纈氨酸(Val, V)。本發(fā)明提供了編碼如本文所描述的空腸彎曲桿菌抗原的核酸序列(其可以是基因)，以及作為這些序列的變體的核苷酸序列或與這些序列同源的核苷酸序列。所述多核苷酸通常例如在至少約15、20、30、40、50、或100或更多個(gè)連續(xù)核苷酸的區(qū)域內(nèi)與相關(guān)序列具有至少約70%同源性，且可能表現(xiàn)出至少約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或99%同源性。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“同源性和同源物”還用來(lái)指來(lái)自遺傳相關(guān)的但并不相同的生物體(例如，如通過(guò)其菌株編號(hào)來(lái)鑒定的不同的細(xì)菌菌株)的相應(yīng)的多核苷酸或蛋白。這些多核苷酸和多肽可以是相同的，或它們可以，例如，具有序列變異。同源序列或變體序列通常與本文所公開(kāi)的序列有至少(或不超過(guò))約1、2、5、10、 15、20或更多個(gè)突變(其可以是置換、缺失或插入)的不同。關(guān)于計(jì)算同源性，這些突變可跨越以上所述的區(qū)域中的任何一個(gè)來(lái)測(cè)量。同源序列通常以顯著高于背景的水平與原始序列選擇性地雜交。選擇性雜交通常利用中嚴(yán)格度到高嚴(yán)格度的條件(例如，從約50°C到約 60°C下，0. 03M氯化鈉和0. 03M檸檬酸鈉)來(lái)實(shí)現(xiàn)。同源性的水平或程度可基于本領(lǐng)域中的任何方法來(lái)計(jì)算。例如，UWGCG包提供了 BESTFIT程序，其可用來(lái)計(jì)算同源性(Devereux等人，Nucleic Acids Research 12，第 387-395頁(yè)(1984))。PILEUP算法和BLAST算法可用來(lái)計(jì)算同源性或比對(duì)序列，例如，如 Altschul S. F J Mol Evol 36:290-300(1993) ；Altschul, S. F.等人；J Mol Biol 215 403-10(1990)中所描述的。用于進(jìn)行BLAST分析的軟件是可通過(guò)美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心可公開(kāi)獲得的。本發(fā)明還包括可與本文所公開(kāi)的序列互補(bǔ)的核酸序列?；パa(bǔ)序列可以是DNA、RNA 或其雜合體(hybrid)。術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)的”一般指多核苷酸通過(guò)堿基配對(duì)的天然結(jié)合，且可以是完全的或部分的?！翱呻s交的”和“互補(bǔ)的”是用來(lái)指足夠的互補(bǔ)性程度，使得在DNA靶標(biāo)或 RNA靶標(biāo)和多核苷酸之間發(fā)生結(jié)合，例如優(yōu)選足以進(jìn)行預(yù)期作用的穩(wěn)定的結(jié)合。如本領(lǐng)域中的技術(shù)人員所理解地，術(shù)語(yǔ)“嚴(yán)格條件”指允許多核苷酸之間雜交的條件。例如，嚴(yán)格鹽濃度一般將低于約750mM NaCl和75mM檸檬酸鈉，優(yōu)選地低于約500mM NaCl和50mM檸檬酸鈉，且更優(yōu)選地低于約250mM NaCl和25mM檸檬酸鈉。嚴(yán)格溫度條件一般將包括至少約30°C的溫度，更優(yōu)選地為至少約37°C的溫度，且最優(yōu)選地為至少約42°C的溫度。Berger 禾B Kimmel，Methods In Enzymology，卷 152 :Guide To Molecular Cloning Techniques (分子克隆技術(shù)才旨南)，San Diego (1987) :Academic Press，Inc.禾口 Sambrook 等人·，Molecular Cloning (分子克隆)(1989) :A Laboratory Manual (實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))，第 2 片反.，卷 1-卷 3，Cold Spring Harbor Laboratory)。一般，術(shù)語(yǔ)“蛋白”、“多肽”和“肽”指經(jīng)由肽鍵連接的兩個(gè)或多個(gè)單獨(dú)的氨基酸(無(wú)論是否天然存在的)的任何聚合物，“蛋白”、“多肽”和“肽”在本文可互換地使用。相似地， 這些術(shù)語(yǔ)涵蓋蛋白片段、類(lèi)似物、衍生物和變體。術(shù)語(yǔ)蛋白的“片段”或“部分”指包括少于蛋白的所有氨基酸殘基的多肽。蛋白的“結(jié)構(gòu)域”也是片段，且包括賦予活性、功能或結(jié)構(gòu)所通常需要的蛋白的氨基酸殘基。在一些實(shí)施方案中，本文提供的多肽具有相對(duì)于參考氨基酸序列的保守氨基酸置換。本發(fā)明包括如本文所描述的空腸彎曲桿菌蛋白(多肽，肽)， 以及與所公開(kāi)的氨基酸序列具有約至少約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或 99%或更高的序列同一性的氨基酸序列變體。更通常地，所述變體序列相對(duì)于本文所明確
1公開(kāi)的氨基酸序列具有1個(gè)和5個(gè)之間的(例如，1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)或5個(gè))保守氨基酸置換?？乖云?或表位，抗原決定簇等)包括能夠引起所期望的免疫應(yīng)答的多肽的任何部分。對(duì)由雞母體抗體識(shí)別的空腸彎曲桿菌蛋白的鑒定本發(fā)明的普通方面涉及通過(guò)在動(dòng)物中促進(jìn)針對(duì)空腸彎曲桿菌的免疫應(yīng)答而用于減少定殖于動(dòng)物的空腸彎曲桿菌的數(shù)量的方法和組合物。在一些實(shí)施方案中，動(dòng)物是鳥(niǎo)諸如雞。這直接解決了由通過(guò)家禽暴露于空腸彎曲桿菌導(dǎo)致的人類(lèi)感染，因?yàn)轭A(yù)期空腸彎曲桿菌暴露的雞的數(shù)量的減少導(dǎo)致人類(lèi)對(duì)于空腸彎曲桿菌的較少的暴露。該問(wèn)題通過(guò)首先查看雞母體抗體來(lái)解決。在雞中，針對(duì)空腸彎曲桿菌的抗體的水平在雞的生命周期中明顯變化。在小雞孵化時(shí)，針對(duì)空腸彎曲桿菌的母體抗體處于高水平。這些由母體轉(zhuǎn)移到小雞的母體抗體在小雞中保持高水平，持續(xù)3-4天，此時(shí)它們逐漸降低直至在約2-3周齡時(shí)變?yōu)椴豢蓹z測(cè)。重要地是，空腸彎曲桿菌對(duì)小雞的定殖與這些母體抗體的降低同步。母體抗體保護(hù)小雞不受空腸彎曲桿菌感染的機(jī)制不清楚。它們可干擾細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性，通過(guò)凝集作用促進(jìn)清除、阻遏離子/營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸、通過(guò)補(bǔ)體介導(dǎo)的殺傷降低生存力，和/或阻遏細(xì)菌粘附分子和宿主目的受體之間的相互作用。Stem，NJ. (1990)， Avian Dis. 34 :595-601)。在小雞被空腸彎曲桿菌定殖之后，開(kāi)始產(chǎn)生針對(duì)該細(xì)菌的抗體。這些抗體可能不足以清除現(xiàn)存的定殖，但小雞自身的抗體產(chǎn)生開(kāi)始后，可觀察到空腸彎曲桿菌生物體的數(shù)量的減少。Shoaf-Sweeney, K. D.等人· (2008), Appl. Environ, Microbiol. 74(22)6867-75 本文鑒定并描述了認(rèn)為對(duì)疫苗的設(shè)計(jì)和制備有用的由雞母體抗體所識(shí)別的抗原性蛋白。實(shí)施例1中描述的研究鑒定了由母體抗體所識(shí)別的空腸彎曲桿菌膜相關(guān)蛋白，因?yàn)閺哪鸽u傳遞至小雞的抗體部分地保護(hù)小雞免于彎曲桿菌定殖。對(duì)鑒定的蛋白進(jìn)行進(jìn)一步表征以評(píng)價(jià)它們作為空腸彎曲桿菌疫苗候選者的效力。在來(lái)自空腸彎曲桿菌81-176的OMP 提取物中鑒定了總共60種蛋白，較少蛋白(即， 20種)被鑒定與Cj SiBB-SPF血清中的抗體反應(yīng)。所鑒定的蛋白包括03(^、01^4、0116(、(^34、(^3(、(1181176_01洸、(1181176_0128、 CJJ81176_0164、CJJ811760_586CJJ81176_1185、CJJ81176_1295、CJJ81176_1525、FlaA, FlaB, FlgE2、FlpA、PEB2、PEB3、PorA, MapA 和 SdhB (參見(jiàn)表 1)。Cj S;3B-SPF血清含有與空腸彎曲桿菌S;3B和81-176中的鞭毛鉤蛋白(FlgE2) 和鞭毛FlaA纖絲蛋白(filament protein)和FlaB纖絲蛋白反應(yīng)的抗體。FlgE2具有 89. 4kDa的分子量且是空腸彎曲桿菌的運(yùn)動(dòng)、鞭毛組裝和蛋白分泌所需的(Hendrixson， D. R.，和 V. J. DiRita (2003)，Mol. Microbiol. 50 :687-702 ；Konkel，Μ. E.等人(2004)， J. Bacteriol. 186 =3296-3303) 0雖然這些蛋白的預(yù)測(cè)分子量為約59kDa，已顯示根據(jù)修飾的水平不同，糖基化使蛋白質(zhì)量改變高達(dá)10% (Thibault, P.等人0001)，J.Biol. Chem. 276 :34862-34870)。如通過(guò)利用抗空腸彎曲桿菌纖毛蛋白特異性血清進(jìn)行的免疫印跡分析所判斷，觀察到了 65kDa和63kDa之間的條帶?？赡艿厥?，該條帶代表了 FlaA蛋白或FlaB蛋白的糖基化形式，而具有小于60kDa表觀分子量的蛋白代表了降解產(chǎn)物。Cj S3B-SPF血清含有針對(duì)空腸彎曲桿菌菌株特異性蛋白以及空腸彎曲桿菌菌株中共有的蛋白進(jìn)行反應(yīng)的抗體。例如，40kDa的免疫反應(yīng)性蛋白，CmeA(第9條帶)，在空腸彎曲桿菌S;3B和81-176菌株的OMP提取物中被全部Cj S3B-SPF血清所識(shí)別，而MkDa蛋白，假定為CmeC，在空腸彎曲桿菌S;3B菌株的OMP提取物中被首次識(shí)別。共同地，CmeA蛋白、CmeB蛋白和CmeC蛋白構(gòu)成了參與對(duì)寬范圍的抗微生物劑和膽汁鹽的抗性的抗性結(jié)節(jié)分化(resistance-nodulat ion-division, RND)夕卜挺 (Lin, J.，L，0. Michel,禾口 Q.Zhang· (2002), Antimicrob. Agents Chemother. 46 :2124-2131 ；Lin, J.等人(2003), Infect, lmmun. ,71 :4250-4259)。CmeB是內(nèi)膜外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，而CmeA位于周質(zhì)空間，CmeC形成外膜通道。CmeABC廣泛分布于空腸彎曲桿菌分離株中(Lin，J.，L. 0. Michel，和Q. Zhang. (2002)，Antimicrob. Agents Chemother. 46 :2124-2131)，對(duì)于來(lái)自 4 種空腸彎曲桿菌菌株 (NCTC11168、RM1221、81116和81-176)的每個(gè)蛋白的推斷的氨基酸的比較顯示了每個(gè)蛋白的序列在這些菌株中是高度保守的(> 98%相似性)。鑒定了參與氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)的兩個(gè)外膜底物結(jié)合蛋白，CjaA(第12條帶)和CjaC(第 13條帶)。已將CjaA表征為假定的ATP結(jié)合盒型半胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中的胞質(zhì)外溶質(zhì)受體 (Muller，A.等人· (2005)，Mol. Microbiol. 57 :143-155)，同時(shí)已顯示 CjaC 是組氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)所需的(Garvis, S. G.，G. J. Puzon, ^P M. E. Konkel (1996)，Infect lmmun. 64 :3537-3543)。 可能地是，氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)蛋白可作為良好的疫苗組分來(lái)發(fā)揮作用，因?yàn)榭漳c彎曲桿菌是非糖分解性的并依賴于外源的氨基酸以用于能量產(chǎn)生。發(fā)現(xiàn)Cj SiBB-SPF血清含有針對(duì)空腸彎曲桿菌S;3B菌株中的CjaA蛋白和CjaC蛋白反應(yīng)，但不針對(duì)81-176菌株中的CjaA蛋白和 CjaC 蛋白反應(yīng)的抗體。Pawelec 等人((2000)，F(xiàn)EMS Microbiol. Lett. 185 :43-49)表明了空腸彎曲桿菌分離株中的CjaA和cjaC 二者中的遺傳差異，發(fā)現(xiàn)在核苷酸水平上具有多達(dá)16%的變異。CjaA和CjaC的相關(guān)抗原性表面彼此是交叉反應(yīng)性的。因此，氨基酸序列中小變異可能是導(dǎo)致對(duì)空腸彎曲桿菌81-176菌株中的CjaA和CjaC的抗體反應(yīng)降低或不存在的原因。實(shí)施例1中呈現(xiàn)的結(jié)果首次顯示了被充分表征的37kDa纖連蛋白結(jié)合蛋白 CadF在雞中是免疫原性的。值得注意的是，雞的空腸彎曲桿菌定殖所必需的CadF蛋白(Ziprin, R. L.，等人(1999)，Avian Dis. 43 :586-589)在空腸彎曲桿菌 S3B 菌株和 81-176菌株兩者中被檢測(cè)。本文鑒定和提供的CadF的優(yōu)選的表位包括30-氨基酸序列 HYGAGVKFRLSDSLALRLETRDQINFNHAN(第 127-156 位殘基，SEQ ID NO 1)和其能夠產(chǎn)生期望的免疫應(yīng)答的片段。該序列的這種片段或部分包括，例如，能夠產(chǎn)生期望的免疫應(yīng)答的包括至少3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)、10個(gè)、11個(gè)、12個(gè)、13個(gè)、14個(gè)、15個(gè)、16個(gè)、17 個(gè)、18個(gè)、19個(gè)、20個(gè)、21個(gè)、22個(gè)、23個(gè)、M個(gè)、25個(gè)J6個(gè)、27個(gè)、觀個(gè)或四個(gè)連續(xù)氨基酸的片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，片段包括至少4個(gè)連續(xù)氨基酸，例如，序列FRLS(SEQ ID NO 2)。與CadF表位結(jié)合的抗體的一個(gè)期望的免疫應(yīng)答是抑制CadF與纖連蛋白結(jié)合。另一個(gè)期望的免疫應(yīng)答是充分抑制雞的彎曲桿菌定殖，其可通過(guò)抑制CadF與纖連蛋白的結(jié)合來(lái)產(chǎn)生。還發(fā)現(xiàn)一些空腸彎曲桿菌OMP是免疫原性的。這些蛋白包括PEB3、MapA和 CJJ81176_0586。PEB3 的功能是未知的(Pei, Z. H.，等人(1991)，J. Biol. Chem. 266 16363-16369)。MapA是已用作區(qū)分空腸彎曲桿菌和大腸彎曲桿菌(C. coli) 二者(Stucki， U.等人· (1995), J. Clin. Microbiol. 33 =855-859)以及檢測(cè)和診斷患有空腸彎曲桿菌感染的個(gè)體(Campbell, L. K.等人(2006), Mod. Pathol. 19 1042-1046)的鑒定工具的外膜脂蛋白。CJJ81176_0586基于其氨基酸序列已被鑒定為假想的外膜蛋白。表1總結(jié)了本發(fā)明的不同實(shí)施方案中所用的空腸彎曲桿菌抗原。表1.空腸彎曲桿菌抗原和對(duì)應(yīng)的Genbank登錄號(hào)的列表NCTCl116881-17權(quán)利要求
1.一種在動(dòng)物中預(yù)防或治療空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)定殖的方法，所述方法包括以下步驟向所述動(dòng)物提供一種或多種空腸彎曲桿菌多肽；或經(jīng)基因工程化以含有并表達(dá)編碼一種或多種空腸彎曲桿菌多肽的核酸序列的宿主。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述一種或多種空腸彎曲桿菌多肽選自由以下組成的組CadF、FlpA、FlaA、CmeA、CmeC, CjaA, CjaC, CJJ81176_0126、CJJ81176_0128、 CJJ81176_0164、CJJ81176_0586、CJJ81176_1185、CJJ81176_1295、CJJ81176_1525、FlaB, FlgE2、PEB2、PEB3、PorA, MapA, SdhB 和其抗原片段。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述一種或多種空腸彎曲桿菌多肽選自由CadF、 FlpA, FlaA和其抗原片段組成的組。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述一種或多種抗原片段選自由如SEQID NO=U SEQ ID NO 2, SEQ ID N0:3、SEQ ID NO :4中列出的多肽序列組成的組。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述動(dòng)物是鳥(niǎo)。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述鳥(niǎo)是雞。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述宿主是細(xì)菌宿主細(xì)胞或病毒。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述宿主是減毒的。
9.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述細(xì)菌宿主細(xì)胞是乳酸桿菌(LactcAacillus)。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中將所述編碼一種或多種空腸彎曲桿菌多肽的核酸序列插入到所述乳酸桿菌的S-層蛋白中。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述提供的步驟包括在所述動(dòng)物的飲用水中提供所述一種或多種空腸彎曲桿菌多肽；或所述經(jīng)基因工程化以含有并表達(dá)編碼一種或多種空腸彎曲桿菌多肽的核酸序列的宿主。
12.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述提供的步驟包括提供作為氣溶膠的所述一種或多種空腸彎曲桿菌多肽；或所述經(jīng)基因工程化以含有并表達(dá)編碼一種或多種空腸彎曲桿菌多肽的核酸序列的宿主細(xì)胞。
13.一種宿主，所述宿主經(jīng)基因工程化以含有并表達(dá)編碼一種或多種空腸彎曲桿菌多肽的核酸序列。
14.如權(quán)利要求13所述的宿主，其中所述一種或多種空腸彎曲桿菌多肽選自由以下組成的組CadF、FlpA, FlaA, CmeA, CmeC, CjaA, CjaC, CJJ81176_0126、CJJ81176_0128、 CJJ81176_0164、CJJ81176_0586、CJJ81176_1185、CJJ81176_1295、CJJ81176_1525、FlaB, FlgE2、PEB2、PEB3、PorA, MapA, SdhB 和其抗原片段。
15.如權(quán)利要求14所述的宿主，其中所述一種或多種空腸彎曲桿菌多肽選自由CadF、 FlpA, FlaA和其抗原片段組成的組。
16.如權(quán)利要求15所述的宿主，其中所述一種或多種抗原片段選自由如SEQID NO=U SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4中列出的多肽序列組成的組。
17.如權(quán)利要求13所述的宿主，其中所述宿主是細(xì)菌宿主細(xì)胞或病毒。
18.如權(quán)利要求13所述的宿主，其中所述宿主是減毒的。
19.如權(quán)利要求17所述的宿主，其中所述細(xì)菌宿主細(xì)胞是乳酸桿菌。
20.如權(quán)利要求19所述的宿主，其中將所述編碼一種或多種空腸彎曲桿菌多肽的核酸序列插入到所述乳酸桿菌的S-層蛋白中。
21.—種經(jīng)修飾的細(xì)菌S-層蛋白，所述經(jīng)修飾的細(xì)菌S-層蛋白具有來(lái)自空腸彎曲桿菌細(xì)菌的至少一種異源多肽的內(nèi)部插入物。
22.如權(quán)利要求21所述的經(jīng)修飾的細(xì)菌S-層蛋白，其中所述至少一種異源多肽選自由以下組成的組CadF、CmeA, CmeC, CjaA, CjaC, CJJ81176_0126、CJJ81176_0128、 CJJ81176_0164、CJJ81176_0586、CJJ81176_1185、CJJ81176_1295、CJJ81176_1525、FlaA, FlaB, FlpA、FlgE2、PEB2、PEB3、PorA, MapA, SdhB 和一種或多種其抗原片段。
23.如權(quán)利要求21所述的經(jīng)修飾的細(xì)菌S-層蛋白，其中所述經(jīng)修飾的細(xì)菌S-層蛋白來(lái)自選自乳酸桿菌屬(Lactobacillus)和柄桿菌屬(CaulcAacter)的細(xì)菌屬。
24.一種用于在動(dòng)物中產(chǎn)生針對(duì)空腸彎曲桿菌的免疫應(yīng)答的抗原組合物，所述抗原組合物包括，至少一種第一多肽，所述第一多肽選自由空腸彎曲桿菌CadF、FlaA, FlpA和其抗原片段組成的組；和至少一種第二空腸彎曲桿菌多肽，所述第二空腸彎曲桿菌多肽不同于所述第一多肽。
25.如權(quán)利要求M所述的抗原組合物，其中所述第二空腸彎曲桿菌多肽選自由以下組成的組CadF、FlaA、FlpA、CmeA、CmeC, CjaA, CjaC、CJJ81176_0126、CJJ81176_0128、 CJJ81176_0164、CJJ81176_0586、CJJ81176_1185、CJJ81176_1295、CJJ81176_1525、FlaB, FlgE2、PEB2、PEB3、PorA, MapA, SdhB 和其抗原片段。
26.如權(quán)利要求M所述的抗原組合物，其中所述抗原組合物包括如SEQID NO=USEQ ID NO :2、SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4中列出的一種或多種多肽序列。
27.如權(quán)利要求M所述的抗原組合物，所述抗原組合物還包括佐劑。
28.如權(quán)利要求M所述的抗原組合物，其中所述抗原組合物為向鳥(niǎo)施用而配制。
29.如權(quán)利要求M所述的抗原組合物，其中所述抗原組合物為口服施用而配制。
30.如權(quán)利要求M所述的抗原組合物，其中所述抗原組合物為向雞口服施用而配制。
31.如權(quán)利要求M所述的抗原組合物，其中所述第一多肽和所述第二空腸彎曲桿菌多肽是重組的或合成的，并抑制所述動(dòng)物的空腸彎曲桿菌定殖。
32.一種用于向受治療者遞送感興趣的物質(zhì)的方法，所述方法包括以下的步驟向所述受治療者提供含有空腸彎曲桿菌的纖連蛋白結(jié)合蛋白和感興趣的物質(zhì)的融合產(chǎn)物，其中所述纖連蛋白結(jié)合蛋白和所述感興趣的物質(zhì)彼此關(guān)聯(lián)；和允許所述融合產(chǎn)物在所述受治療者的細(xì)胞或組織中結(jié)合纖連蛋白。
33.如權(quán)利要求32所述的方法，其中所述纖連蛋白結(jié)合蛋白是FlpA。
34.如權(quán)利要求32所述的方法，其中所述感興趣的物質(zhì)是一種或多種人類(lèi)傳染物的多肽抗原。
全文摘要
用于在家禽中和人類(lèi)中以及其他動(dòng)物中降低空腸彎曲桿菌(C.jejuni)細(xì)菌感染的發(fā)生率的方法和組合物，所述組合物被配制為包括空腸彎曲桿菌抗原，且尤其是CadF、FlpA和FkA?？乖梢远嚯牡男问絹?lái)提供或通過(guò)產(chǎn)生所述抗原的宿主來(lái)提供。空腸彎曲桿菌的纖連蛋白結(jié)合蛋白也可用來(lái)向人類(lèi)和其他動(dòng)物遞送感興趣的物質(zhì)。
文檔編號(hào)A61P43/00GK102497875SQ201080041149
公開(kāi)日2012年6月13日 申請(qǐng)日期2010年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月16日
發(fā)明者查理·拉爾森, 泰瑞·唐, 詹森·尼爾-麥金尼, 邁克爾·康克爾 申請(qǐng)人:華盛頓州立大學(xué)研究基金會(huì)