專利名稱：一種評價cd20靶位治療藥物及手段的體外檢測方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術領域，具體涉及一種評價CD20靶位治療藥物及手段的體外檢測方法。
背景技術：
淋巴瘤是一組起源于淋巴結或其他淋巴組織的惡性腫瘤。近年來在我國的發(fā)病率 逐年上升，死亡率約為I. 5/10萬，占所有惡性腫瘤死亡率的第11 13位。淋巴瘤可分為霍奇金淋巴瘤(簡稱HD)和非霍奇金淋巴瘤(簡稱NHL)兩大類，其中NHL是最常見的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，也是發(fā)病率增長最快的惡性腫瘤之一。在NHL患者中，約85% 90%是B細胞淋巴瘤，嚴重危害人類健康，并且以目前的醫(yī)療水平即使用大量的放化療或造血干細胞移植等治療手段依然不能解決這一難題。研究表明，CD20是B淋巴細胞和B淋巴瘤細胞表面專有的膜表面蛋白，表達于早期B細胞和成熟B細胞階段，分化為漿細胞后CD20表達消失。CD20分子在非霍奇金淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤等疾病中的表達量異常增高。超過90%的B細胞淋巴瘤患者的瘤細胞膜上有⑶20分子表達，且表面密度很高。由此可見，⑶20分子是治療非霍奇金淋巴瘤(NHL)理想的靶分子。研制具有新型治療機制且毒副作用較低的抗CD20單克隆抗體就可能專一性地殺傷B淋巴瘤細胞，達到較好的治療效果。在生物治療藥物及手段的開發(fā)過程中，為了便于大量具有生物活性治療藥物及手段的篩選，研究人員需要建立一種快速、高效的檢測手段來準確考察待選治療藥物及手段的生物活性、效果及其穩(wěn)定性。這種方法必須滿足下列幾個條件首先，該方法最好是體夕卜實驗，基于細胞水平，如 ADCC (Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity),Q)C (Complement Dependent Cytotoxicity)、直接效應等,或基于酶促反應；其次,該方法的實驗機理與該藥物及手段在體內(nèi)的作用機理應盡可能一致，通過體外實驗能夠真實的反應該治療藥物及手段在體內(nèi)作用的療效，包括在細胞系的選擇上也應盡量與真實病患情況接近；第三，該方法必須通過方法驗證，滿足方法專屬性、準確性、精密度以及耐用性等方面的要求，如針對同一樣品檢測的重復性、日間差人員操作誤差等結果的RSD應該滿足小于10%，在此基礎上，才能保證生物活性檢測結果的可靠，并用于指導治療藥物及手段篩選工作；最后，在相同的實驗條件下，該方法越簡單、操作步驟越少越好，因為這樣的方法更加靈活，更有利于推廣，并且適用于高通量工作。以基于靶分子⑶20進行生物治療藥物及手段的研發(fā)為例，B淋巴瘤細胞過量表達CD20,以CD20為靶抗原，在體內(nèi)殺傷B淋巴瘤細胞的作用有三，分別是ADCC作用、CDC作用和細胞凋亡，其中最主要機制之一為CDC作用，即通過特異性抗體與細胞膜表面相應抗原結合，形成復合物而激活補體經(jīng)典途徑，所形成的攻膜復合物對靶細胞發(fā)揮裂解效應。根據(jù)實驗設計作用機理一致性原則，研究人員通常利用該治療藥物及手段對高表達CD20細胞的體外殺傷作用來評價其生物活性及效果。常用的高表達CD20的細胞系主要是人B淋巴瘤細胞Daudi。然而到目前為止，從文獻報道來看，該殺傷的細胞學活性方法并未得到公認或標準化，例如細胞系的選擇，細胞鋪板密度，治療藥物及手段作用時間，顯色時間以及顯色方式等都各不相同。更重要的是，在已經(jīng)報道的殺傷活性方法中，也缺乏對檢測體系專屬性、準確性、重復性等方面的相關評價 ，包括對實驗結果的評價方式也存在不同，難以保證檢測結果的穩(wěn)定性與可靠性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術問題是針對以上存在的問題與不足，提供一種在評價CD20靶位治療藥物及手段過程中，對具有生物活性治療藥物及手段進行篩選以及穩(wěn)定性評價的細胞殺傷生物活性檢測方法。該方法能夠滿足方法驗證過程中對專屬性、準確性、精密度包括重復性、日間差、人員操作誤差，以及耐用性等方面的要求，能夠對大量生物活性治療藥物及手段進行快速、準確、高通量的篩選，滿足治療藥物及手段在研發(fā)過程中的需求。為此，本發(fā)明公開了一種評價⑶20靶位治療藥物及手段的體外檢測方法，包括下列步驟
a取對數(shù)生長期表達CD20的細胞，用基礎培養(yǎng)基制成細胞懸液，計數(shù)并計算細胞密度及活率，調(diào)整至合適的活細胞密度為nX IO5個/ml，n=6_10，將細胞懸液等體積加入細胞培養(yǎng)板孔中，同時設立空白對照孔，空白對照孔加入等體積基礎培養(yǎng)基；
b取對照品及待測樣品，用基礎培養(yǎng)基進行系列梯度稀釋，得到系列稀釋濃度的對照品及待測樣品；
c將系列稀釋濃度的對照品及待測樣品依次加入步驟a所述細胞培養(yǎng)板孔中，空白對照孔則加入等體積的基礎培養(yǎng)基，然后將細胞培養(yǎng)板放置于37°C、5% 二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 10-20min ；
d取人血清，用基礎培養(yǎng)基進行稀釋，依次加入步驟c所述細胞培養(yǎng)板孔和空白對照孔中，使人血清的濃度為3%-7%，然后將細胞培養(yǎng)板放置于37°C、5% 二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)45_75min ；
e采用檢測活細胞或死細胞量的檢測體系對細胞培養(yǎng)板進行顯色反應；f顯色反應完成后，測定顯色反應的結果，并根據(jù)測定結果計算待測樣品的細胞殺傷生物活性。本發(fā)明術語“對照品”是指已公知其對表達⑶20的細胞表現(xiàn)出細胞殺傷作用活性的化合物或組合物。在一些實施例中，所述及CD20靶位治療藥物是單克隆抗體、激酶抑制劑、反義寡核苷酸、化合物、中藥提取物或中藥復方提取物中之一或它們的任何組合，其中優(yōu)選為單克隆抗體。在一些實施例中，所述對數(shù)生長期表達⑶20的細胞是人B淋巴瘤細胞Daudi。在一些實施例中，所述基礎培養(yǎng)基是RPMI1640培養(yǎng)基。在一些實施例中，所述系列梯度稀釋是2倍系列梯度稀釋。在一些實施例中，在步驟e中，所述檢測活細胞或死細胞量的檢測體系包括四唑類化合物氧化還原檢測體系、ATP總量檢測體系或LDH釋放量檢測體系等。在一些實施例中，所述四唑類化合物為階1\10^、00(-8，其中優(yōu)選為00(-8。相對于其他四唑類化合物如MTT，MTS而言，CCK-8所形成的還原顯色物質(zhì)可直接溶于水相，無需添加DMSO助溶，因此使用更加方便，檢測靈敏度也較高。
在一些實施例中，所述細胞培養(yǎng)板為96孔細胞培養(yǎng)板，以便于高通量地進行藥物評價。本發(fā)明能夠快速、準確、高效的對針對CD20靶位治療藥物及手段的細胞殺傷生物活性進行檢測。該方法專屬性好、特異性強、準確性高，活性測定范圍達到50%-150% ;精密度高，重復性、日間差以及人員操作誤差RSD均小于10%，并且雙復孔的CV%小于20%，4參數(shù)擬合的擬合常數(shù)R2均大于O. 98。此外，本發(fā)明并不需要十分昂貴的儀器和繁瑣的操作，便于推廣以及高通量操作，完全能夠滿足其在進行具有針對CD20靶位，通過CDC作用殺傷細胞，具有生物活性治療藥物及手段的篩選及其穩(wěn)定性評價的需要。


圖I Rituximab及參考品4參數(shù)擬合圖。圖2 Infliximab 4 參數(shù)擬合圖。
圖3加入1%和5%補體保留正常人血清條件下100%參考品和75%參考品4參數(shù)擬合圖。圖4加入20%和5%補體保留正常人血清條件下100%參考品和75%參考品4參數(shù)擬合圖。
具體實施例方式以下結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發(fā)明方法中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。一、材料和試劑
材料針對0)20靶位單克隆抗體藥物Rituximab(產(chǎn)于Roche，批號B6109)，針對CD20靶位單克隆抗體藥物參考品(嘉和生物藥業(yè)制備)，針對CD20靶位單克隆抗體藥物待測樣品(嘉和生物藥業(yè)制備)，不針對⑶20祀位的單克隆抗體藥物Infliximab (產(chǎn)于強生,批號AM05014)。試劑染色液CCK-8(Dojindo，Cat. No. CK04-20)，RPMI1640 培養(yǎng)基粉末(GIBCO，Cat. No. 31800-022)，鏈霉素 / 青霉素雙抗(GIBCO，Cat. No. 15070-063)，F(xiàn)BS (GIBCO,Cat. No. 10099-141)。溶液配制
RPMI1640培養(yǎng)基取IOOOml燒杯，倒入RPMI1640培養(yǎng)基粉末I袋，碳酸氫鈉2. 0g，力口入約900ml超純水，避光磁力攪拌直至溶解，用稀鹽酸調(diào)pH值至7. 00 ±0. 05，將溶液倒入量筒，定容至1000ml，經(jīng)0. 22 μ m濾膜無菌過濾即得，分裝后4°C避光保存。細胞株Daudi細胞株(購于中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫，目錄號TCHuI40)。二、檢測方法步驟
O細胞鋪板取對數(shù)生長期Daudi細胞用RPMI1640基礎培養(yǎng)基制成單細胞懸液。計數(shù)并計算細胞密度及活率，調(diào)整活細胞密度至6. 0-10. OX IO5個/ml，以100 μ I/孔加入96孔細胞培養(yǎng)板中?？瞻讓φ湛讋t以100 μ I/孔加入RPMI1640基礎培養(yǎng)基。2)參考品及待 測樣品稀釋取對照品及待測樣品，根據(jù)標不濃度，用RPMI1640基礎培養(yǎng)基稀釋至合適濃度，在新的96孔細胞培養(yǎng)板中做2倍系列梯度稀釋，得到11個稀釋度。3)加樣取步驟I)中的細胞培養(yǎng)板，將稀釋好的系列稀釋濃度的對照品及待測樣品以50 μ I/孔依次加入鋪好細胞的細胞培養(yǎng)板孔中，空白對照孔則以50 μ I/孔加入基礎培養(yǎng)基，2-3復孔。完成后將細胞培養(yǎng)板放置于37°C、5% 二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10-20min。4)取人血清，用基礎培養(yǎng)基稀釋至合適濃度，然后以50 μ I/孔加入步驟3)中的細胞培養(yǎng)板孔和空白對照孔中，使得人血清的濃度為3%-7%。5)顯色采用CCK-8顯色體系分別于細胞培養(yǎng)板中對照品孔、待測樣品孔、空白對照孔中以20 μ I/孔加入CCK-8，完成后將細胞培養(yǎng)板放置于37°C、5% 二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育3. 5-4. 5h。6)讀數(shù)取出細胞培養(yǎng)板混勻，放入酶標儀，以650nm為參比波長，在450nm下測
定對照品孔、待測樣品孔及空白對照孔的OD45tl.,記錄測定結果。7)結果分析分別用對照品孔和待測樣品孔OD值與加藥濃度的量效關系進行4參數(shù)擬合，確定對照品與待測樣品的EC5tl值，曲線擬合常數(shù)R2，復孔CV%。按照下列公式計算待測樣品的細胞殺傷生物活性
A+· 丨樣 π U* AK UJ_ ,、對照品 EC53 值
_樣品生物活性CO =隱......—
實施例I評價CD20靶位治療藥物及手段的體外檢測方法
以參考品和Rituximab為材料，Rituximab作為對照品，用RPMI1640基礎培養(yǎng)基稀釋至合適濃度，在新的96孔細胞培養(yǎng)板中做2倍系列梯度稀釋，得到11個稀釋度，采用上述檢測方法步驟考察參考品相對Rituximab的生物學活性。結果如圖I所示，Rituximab及參考品4參數(shù)擬合情況良好，曲線擬合常數(shù)R2均滿足> O. 98，不同加藥稀釋濃度下3復孔檢測OD值的CV%均滿足< 20%。通過與RituximabEC5tl值的比較，參考品的細胞殺傷生物活性為95%。實施例2專屬性評價試驗
以Infliximab為材料，用RPMI1640基礎培養(yǎng)基稀釋至合適濃度，在新的96孔細胞培養(yǎng)板中做2倍系列梯度稀釋，得到11個稀釋度，采用上述檢測方法步驟檢測其殺傷活性。結果如圖2，將該方法應用于Infliximab時，盡管不同加藥稀釋濃度下3復孔檢測OD值的CV%均滿足< 20%，但無法對結果進行4參數(shù)擬合，該藥物并不能對高表達CD20的人B淋巴瘤細胞Daudi產(chǎn)生殺傷作用。相對的，圖I中參考品的檢測結果則能夠正常進行4參數(shù)擬合，同時滿足擬合常數(shù)R2 > O. 98，3復孔的CV% < 20%。該實驗結果表明，本發(fā)明所述方法具有特異性。實施例3準確性評價試驗
以參考品(同實施例I)為材料，用RPMI1640基礎培養(yǎng)基將其稀釋成效價水平分別為50%、75%、100%、125%、150%的待測樣品，3名實驗人員(Analystl、2、3)各自獨立的采用上述檢測方法步驟對這5個待測樣品進行細胞殺傷生物活性檢測。結果如表1，對效價水平分別為50%、75%、100%、125%、150%的5個待測樣品，3名不
同實驗人員利用本發(fā)明方法對這些樣品的檢測結果均滿足參考品的4參數(shù)擬合曲線的擬合常數(shù)R2 > O. 98，3復孔的CV%均滿足< 20%，并且不同人員對不同效價水平的實測值相對于理論值的平均偏差均滿足< 10%。這說明在檢測針對CD20靶位生物治療藥物及手段的細胞殺傷生物活性時，本發(fā)明方法對活性范圍在50%-150%內(nèi)待測樣品，能夠達到準確性要求。
表I.針對CD2i)靶位單克隆抗體藥物細胞殺傷生物活性檢測準確性評價結果匯總表
權利要求
1.一種評價CD20靶位治療藥物及手段的體外檢測方法，包括下列步驟 a取對數(shù)生長期表達CD20的細胞，用基礎培養(yǎng)基制成細胞懸液，計數(shù)并計算細胞密度及活率，調(diào)整活細胞密度為ηX IO5個/ml，將細胞懸液等體積加入細胞培養(yǎng)板孔中，同時設立空白對照孔，空白對照孔加入等體積基礎培養(yǎng)基； b取對照品及待測樣品，用基礎培養(yǎng)基進行系列梯度稀釋，得到系列稀釋濃度的對照品及待測樣品； c將系列稀釋濃度的對照品及待測樣品依次加入步驟a所述細胞培養(yǎng)板孔中，空白對照孔則加入等體積的基礎培養(yǎng)基，然后將細胞培養(yǎng)板放置于37°C、5% 二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 10-20min ； d取人血清，用基礎培養(yǎng)基進行稀釋，依次加入步驟c所述細胞培養(yǎng)板孔和空白對照孔中，使人血清的濃度為3%-7%，然后將細胞培養(yǎng)板放置于37°C、5% 二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)45_75min ； e采用檢測活細胞或死細胞量的檢測體系對細胞培養(yǎng)板進行顯色反應；f顯色反應完成后，測定顯色反應的結果，并根據(jù)測定結果計算待測樣品的細胞殺傷生物活性。
2.如權利要求I所述的體外檢測方法，其特征在于所述CD20靶位治療藥物是單克隆抗體、激酶抑制劑、反義寡核苷酸、化合物、中藥提取物或中藥復方提取物中之一或它們的任何組合。
3.如權利要求I所述的體外檢測方法，其特征在于所述n=6-10。
4.如權利要求I所述的體外檢測方法，其特征在于所述對數(shù)生長期表達CD20的細胞是人B淋巴瘤細胞Daudi。
5.如權利要求I所述的體外檢測方法，其特征在于所述基礎培養(yǎng)基是RPMI1640基礎培養(yǎng)基。
6.如權利要求I所述的體外檢測方法，其特征在于所述系列梯度稀釋是2倍系列梯度稀釋。
7.如權利要求I所述的體外檢測方法，其特征在于所述人血清是補體保留正常人血清。
8.如權利要求I所述的體外檢測方法，其特征在于在步驟e中，所述檢測活細胞或死細胞量的檢測體系包括四唑類化合物氧化還原檢測體系、ATP總量檢測體系或LDH釋放量檢測體系等。
9.如權利要求8所述的體外檢測方法，其特征在于所述四唑類化合物為MTT、MTS或CCK-8。
10.如權利要求I所述的體外檢測方法，其特征在于所述細胞培養(yǎng)板為96孔細胞培養(yǎng)板。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術領域，具體涉及一種評價CD20靶位治療藥物及手段的體外檢測方法。本發(fā)明公開的體外檢測方法，能夠快速、準確、高效的對CD20靶位治療藥物及手段的細胞殺傷生物活性進行檢測，該方法專屬性好、特異性強、準確性高，活性測定范圍達到50%-150%；精密度高，重復性、日間差以及人員操作誤差RSD均小于10%，并且三復孔的CV%小于20%，4參數(shù)擬合的擬合常數(shù)R2均大于0.98。此外，本發(fā)明并不需要十分昂貴的儀器和繁瑣的操作，便于推廣以及高通量操作，完全能夠滿足其在進行具有針對CD20靶位、抑制腫瘤細胞生長活性的治療藥物及手段的篩選及其穩(wěn)定性評價的需要。
文檔編號G01N33/15GK102967692SQ201210535899
公開日2013年3月13日 申請日期2012年12月13日 優(yōu)先權日2012年12月13日
發(fā)明者王安, 王少雄, 呂品, 劉培培, 陳香 申請人:嘉和生物藥業(yè)有限公司