專利名稱：一種利用輪蟲檢測水中全氟辛烷磺酸毒性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種利用輪蟲檢測水中全氟辛烷磺酸毒性的方法，屬于環(huán)境檢測技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
由于具有疏水疏油性等非常獨特的物理化學(xué)性質(zhì)，全氟辛烷磺酸(PFOS)被廣泛的應(yīng)用于エ業(yè)、商業(yè)和個人消費品中，如可用作疏水疏油抗污劑(地毯、紡織、室內(nèi)裝璜、皮革、紙質(zhì)產(chǎn)品等)、阻燃劑(航空航天、消防) 、表面活性劑(滅火泡沫、堿性清潔劑)、光致抗蝕劑(半導(dǎo)體エ業(yè))、電鍍抗霧劑、相紙抗靜電劑、涂料添加劑等，并可作為殺蟲劑、除草剤、潤滑劑、粘合劑和化妝品的成分等。目前，在廢水和污泥、地表水、地下水、海水、海底沉積物和飲用水(自來水)中都檢測到了不同濃度的PFOSt5PFOS除具有抗酸、抗堿、抗氧化劑和抗還原劑的能力，能耐水解、光解、生物降解等作用，還可以通過食物鏈積累，其在生物體內(nèi)的蓄積水平遠高于有機氯農(nóng)藥和ニ噁英等持久性有機污染物。近年來關(guān)于檢測PFOS的生態(tài)毒性的研究主要集中在小鼠等哺乳動物以及斑馬魚、大型蚤等水生生物，現(xiàn)存方法中PFOS處理濃度遠高于自然界中PFOS的存在濃度，很難真實反應(yīng)自然環(huán)境中PFOS的生態(tài)干擾。且實驗周期長，不易觀察對后代的影響，試驗成本較高。輪蟲是廣泛分布于各類水體中的ー類浮游動物。它們以藻類、細菌等為食物，同時又是魚類幼苗和某些無脊椎動物等的良好餌料。輪蟲繁殖快，對藻類食物的同化效率高達20-80 %，在水生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量流動中起重要的樞紐作用。而且，輪蟲與其它枝角類和橈足類等競爭食物，影響水生生物群落的組成。輪蟲的分布廣泛、繁殖迅速、世代時間短，其存活、繁殖和行為等對環(huán)境理化因子的變化敏感，以輪蟲為受試生物進行的毒理實驗過程的標準化等使其成為水生態(tài)毒理學(xué)研究的模式生物之一，并被廣泛用于水環(huán)境的監(jiān)測。1999年，美國環(huán)保局正式把萼花臂尾輪蟲和褶皺臂尾輪蟲分別作為淡水和海水污染的指示動物列入國家測試標準(ASTM，1999)。目前，在輪蟲的水生態(tài)毒理學(xué)研究中主要涉及的是重金屬離子化合物、雌激素、多氯聯(lián)苯、多環(huán)芳烴、及農(nóng)藥類污染物，而PFOS對輪蟲的毒性的未見報道。本發(fā)明提供了一種可以通過輪蟲的生命表變化來判斷PFOS毒性的方法，材料易得、實驗周期短、便于觀察PFOS對后代以及整個種群的影響、測試用量少、成本低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供ー種利用輪蟲檢測水中全氟辛烷磺酸(PFOS)毒性的方法，即通過檢測輪蟲在PFOS存在的情況下其無性生殖策略、有性生殖策略及個體大小的變化來檢測PFOS毒性的目的；此方法用很少的測試液、在較短的時間內(nèi)、以簡單的實驗過程體現(xiàn)了輪蟲的各發(fā)育階段和輪蟲生活史的全過程(如發(fā)育、性成熟、種群增長和生殖)；除此之外，還能估計到子一代輪蟲的生殖能力。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下所述
ー種利用輪蟲檢測水中全氟辛烷磺酸(PFOS)毒性的方法，包括步驟如下I)輪蟲的培養(yǎng)用輪蟲培養(yǎng)液對輪蟲進行“克隆”培養(yǎng)，以綠藻培養(yǎng)液培養(yǎng)的、處于指數(shù)增長期的淡水緑藻為餌料，培養(yǎng)時間為六個月以上，實驗前用輪蟲培養(yǎng)液對輪蟲進行兩周以上的預(yù)培養(yǎng)，培養(yǎng)在20±1°C、持續(xù)光照條件下進行；2)急性毒性試驗將全氟辛烷磺酸(PFOS)設(shè)為100. 0、1 0. 0、1.0、0. I和O. 01mg/L 5個濃度梯度，每個梯度設(shè)置4個重復(fù)，另設(shè)I個空白對照，從預(yù)培養(yǎng)的試管中隨機吸取帶非混交卵的輪蟲雌體若干個置于培養(yǎng)皿中進行培養(yǎng)，2h后收集孵化出的輪蟲幼體，將輪蟲幼體放入六孔板中，加入測試液，試驗在20± I°C、無光照的恒溫培養(yǎng)箱中進行，采用機率単位法分別求得其LC50 值；3)測定不同濃度PFOS對輪蟲種群增長率的影響通過種群增長率實驗評價不同濃度PFOS對輪蟲種群增長率的影響，96h后，對每個試管中輪蟲的非混交雌體、混交雌體和不帶卵雌體分別進行計數(shù)，然后全數(shù)返回原培養(yǎng)器皿繼續(xù)培養(yǎng)24h，之后對混交雌體所攜帯的休眠卵及試管底部沉積的休眠卵進行計數(shù)；4)測定不同濃度PFOS對輪蟲生殖策略的影響設(shè)置了不同濃度PF0S，另加I個空白對照(輪蟲培養(yǎng)液)用于生命表實驗，記錄輪蟲產(chǎn)第一枚卵所需的時間；并測量其體長體寬，檢測PFOS對其生長發(fā)育的影響；之后記錄輪蟲的產(chǎn)卵數(shù)、孵化出的幼體數(shù)和母體存活情況，并記錄第二代幼體非混交雌體與混交雌體的比例，由此進行水中全氟辛烷磺酸(PFOS)毒性的測定。本發(fā)明的方法中，所述的輪蟲培養(yǎng)液為MBL培養(yǎng)液。本發(fā)明的方法中，步驟4中所述的PFOS濃度為O. 01,0. I和I. Omg/L。本發(fā)明的方法中，所述輪蟲優(yōu)選為萼花臂尾輪蟲。
具體實施例方式下面將結(jié)合實施例進行詳細說明，以對本發(fā)明方法的目的、特征和優(yōu)點有更深入的了解。以下的實施例具體解釋本發(fā)明，本發(fā)明的范圍不受實施例的限制。實施例I本實施例涉及到利用萼花臂尾輪蟲檢測水中PFOS毒性的方法，包括如下步驟，其中步驟4中所述的PFOS濃度為O. Olmg/L。I.輪蟲的來源和培養(yǎng)首先采集受試萼花臂尾輪蟲，實驗室內(nèi)用輪蟲培養(yǎng)液對其進行“克隆”培養(yǎng)，以綠藻培養(yǎng)液培養(yǎng)的、處于指數(shù)增長期的淡水緑藻(C. pyrenoidosa)為餌料，培養(yǎng)時間為六個月以上，實驗前用改良的輪蟲培養(yǎng)液配方(USEPA，1985)的輪蟲培養(yǎng)液對輪蟲進行兩周以上的預(yù)培養(yǎng)，預(yù)培養(yǎng)時每天投喂密度為I. OXlO6ceIls · ml/1的綠藻，培養(yǎng)在20±1°C、持續(xù)光照條件下(30001x)。2.急性毒性試驗全氟辛烷磺酸(PFOS)購自Sigma-Aldrich,^ (PFOS)設(shè)為 100. 0,10. O、I. 0,0. I和0. 01mg/L 5個濃度梯度，每個梯度設(shè)置4個重復(fù)，另設(shè)I個空白對照(EPA培養(yǎng)基)。測試液的配制采用母液稀釋的方法，先用蒸餾水配制I. Og/L的母液，然后用EPA培養(yǎng)基(不含藻食物)稀釋得到不同濃度的PFOS測試液，從預(yù)培養(yǎng)的試管中隨機吸取帶非混交卵的輪蟲雌體若干個置于培養(yǎng)皿中進行培養(yǎng)，2h后收集孵化出的輪蟲幼體，每10個輪蟲幼體放入容積為IOmL的六孔板中，加入5mL測試液，試驗在(20±1)で、無光照的恒溫培養(yǎng)箱中進行，采用機率単位法分別求得其LC50值。3.不同濃度PFOS對輪蟲種群增長率的影響通過種群增長率實驗評價不同濃度PFOS對輪蟲種群增長率的影響，該實驗在六孔板中進行。在每個孔中放入齡長小于2h的輪蟲幼體15個，并添加配制好的各濃度PFOS溶液至10ml，餌料為I. OX 106cells/L的綠藻，PFOS濃度設(shè)置為5組，分別為O. 125,0. 25、
O.5、I. 0、2. Omg/L并設(shè)I個對照組(培養(yǎng)液不含 PF0S);每組均設(shè)4個重復(fù)，實驗在溫度為(20±1)°C的恒溫培養(yǎng)箱中進行。實驗過程中，每12h懸浮沉積于試管底部的藻類食物，每24h更換內(nèi)含I. OX 106cells/L綠藻的測試液，96h后，對每個試管中輪蟲的非混交雌體、混交雌體和不帶卵雌體分別進行計數(shù)，然后全數(shù)返回原培養(yǎng)器皿繼續(xù)培養(yǎng)24h，之后對混交雌體所攜帯的休眠卵及試管底部沉積的休眠卵進行計數(shù)，種群增長率試驗結(jié)果顯示O. 125mg/L的PFOS對輪蟲種群增長率影響差異不顯著，其余四種濃度(O. 25、0. 5、1.0、2.0mg/L)的PFOS對輪蟲種群增長率影響差異顯著。4.不同濃度PFOS對輪蟲生殖策略的影響選用濃度為O. 01mg/L的PFOS用于生命表實驗，生命表實驗在特制的24孔塑料板中進行，每孔中放入一個齡長在2h內(nèi)的幼體，加入ImL的測試液，實驗開始的48h內(nèi)，每隔3h觀察一次，記錄輪蟲產(chǎn)第一枚卵所需的時間；32h時測量其體長體寬，檢測PFOS對其生長發(fā)育的影響；之后每8h觀察一次，記錄輪蟲的產(chǎn)卵數(shù)、孵化出的幼體數(shù)和母體存活情況，并移去幼體至96孔板，記錄第二代幼體非混交雌體與混交雌體的比例；每間隔24h將存活的母體轉(zhuǎn)移到新鮮的測試液中，實驗結(jié)果顯示0. 01mg/L的PFOS處理延長了輪蟲幼體階段歷時，降低了種群中的混交雌體百分率，進而影響下一代種群中雌雄比例，對產(chǎn)卵量無明顯影響。實施例2以濃度為O. lmg/L的PFOS溶液來代替實施例I中的步驟4中O. 01mg/L的PFOS溶液，其他條件同實施例I。實驗表明，0. lmg/L的PFOS處理延長了輪蟲幼體階段歷時、縮短了輪蟲的平均壽命、降低了種群中的混交雌體百分率，進而影響下一代種群中雌雄比例，對產(chǎn)卵量無明顯影響。實施例3以濃度為I. 0mg/L的PFOS溶液來代替實施例I中的步驟4中0. 01mg/L的PFOS溶液，其他條件同實施例I。實驗表明，I. 0mg/L的PFOS處理抑制了輪蟲的生長、延長了輪蟲幼體階段歷時、縮短了輪蟲的平均壽命、降低了種群中的混交雌體百分率，進而影響下ー代種群中雌雄比例，且大大抑制了輪蟲的產(chǎn)卵量。實施例1，2，3實驗結(jié)果如表I所示表I.暴露在不同濃度PFOS下(mg/L)的萼花臂尾輪蟲的幼體期時間(T)、平均壽命(ML)、平均產(chǎn)卵量(EQ)及混交雌體數(shù)/非混交雌體數(shù)的比例(MF/AF)。
權(quán)利要求
1.ー種利用輪蟲檢測水中全氟辛烷磺酸(PFOS)毒性的方法，包括步驟如下 1)輪蟲的培養(yǎng) 用輪蟲培養(yǎng)液對輪蟲進行“克隆”培養(yǎng)，以綠藻培養(yǎng)液培養(yǎng)的、處于指數(shù)增長期的淡水緑藻為餌料，培養(yǎng)時間為六個月以上，實驗前用輪蟲培養(yǎng)液對輪蟲進行兩周以上的預(yù)培養(yǎng)，培養(yǎng)在20 ± Iで、持續(xù)光照條件下進行； 2)急性毒性試驗 將全氟辛烷磺酸(PFOS)設(shè)為100. O、10. O、I. 0、0. I和O. 01mg/L 5個濃度梯度，每個梯度設(shè)置4個重復(fù)，另設(shè)I個空白對照，從預(yù)培養(yǎng)的試管中隨機吸取帶非混交卵的輪蟲雌體若干個置于培養(yǎng)皿中進行培養(yǎng)，2h后收集孵化出的輪蟲幼體，將輪蟲幼體放入六孔板中，加入測試液，試驗在20±1°C、無光照的恒溫培養(yǎng)箱中進行，采用機率単位法分別求得其LC50值； 3)測定不同濃度PFOS對輪蟲種群增長率的影響 通過種群增長率實驗評價不同濃度PFOS對輪蟲種群增長率的影響，96h后，對每個試管中輪蟲的非混交雌體、混交雌體和不帶卵雌體分別進行計數(shù)，然后全數(shù)返回原培養(yǎng)器皿繼續(xù)培養(yǎng)24h，之后對混交雌體所攜帯的休眠卵及試管底部沉積的休眠卵進行計數(shù)； 4)測定不同濃度PFOS對輪蟲生殖策略的影響 設(shè)置了不同濃度PF0S，另加I個空白對照(輪蟲培養(yǎng)液)用于生命表實驗，記錄輪蟲產(chǎn)第一枚卵所需的時間；并測量其體長體寬，檢測PFOS對其生長發(fā)育的影響；之后記錄輪蟲的產(chǎn)卵數(shù)、孵化出的幼體數(shù)和母體存活情況，并記錄第二代幼體非混交雌體與混交雌體的比例，由此進行水中全氟辛烷磺酸(PFOS)毒性的測定。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述的輪蟲培養(yǎng)液為MBL培養(yǎng)液。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于步驟4中所述的PFOS濃度為O.01,0. I和1.Omg/し
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述輪蟲為萼花臂尾輪蟲。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用輪蟲檢測水中全氟辛烷磺酸(PFOS)生物毒性的方法，屬于環(huán)境檢測技術(shù)領(lǐng)域。具體是選用輪蟲作為模式生物，此種生物分布廣泛、繁殖迅速、世代時間短，存活、繁殖和行為等對環(huán)境理化因子的變化敏感；通過不同濃度的PFOS水溶液對輪蟲種群密度的改變評價其對生態(tài)系統(tǒng)的影響，然后以其對輪蟲生活史的影響確定PFOS的作用機制。本發(fā)明克服了目前測定水中PFOS生物毒性中周期長、操作復(fù)雜的困難，提供了一個簡便、靈敏、系統(tǒng)的檢測水中PFOS毒性的方法，該方法方便、快速、成本低廉。
文檔編號G01N33/00GK102692478SQ20121017360
公開日2012年9月26日 申請日期2012年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月31日
發(fā)明者孫棟, 張利蘭, 牛軍峰 申請人:北京師范大學(xué)