專利名稱：快速檢測咖啡因的膠體金檢測試劑盒及其制備工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種膠體金檢測試劑盒及其制備工藝，具體涉及咖啡因檢測試劑盒以及制備工藝。
背景技術(shù)：
咖啡因(Caffeine)，又名三甲基黃嘌呤，是一種黃嘌呤生物堿化合物，一種中樞神經(jīng)興奮劑。適度地使用咖啡因有祛除疲勞、興奮神經(jīng)的作用，臨床上用于治療神經(jīng)衰弱和昏迷復(fù)蘇。在北美，90%的成年人每天都通過飲用含咖啡因的咖啡、茶、軟飲料及能量飲料等形式使用咖啡因，我國的使用量也在逐年增加。但是，大劑量或長期使用咖啡因也會對人體造成損害，特別是其具成癮性，一旦停用會出現(xiàn)精神萎頓、渾身困乏疲軟等各種戒斷癥狀。 雖然成癮性較弱，戒斷癥狀也不十分嚴(yán)重，但由于藥物的耐受性而導(dǎo)致用藥量不斷增加時(shí)， 咖啡因就不僅作用于大腦皮層，還能直接興奮延髓，引起陣發(fā)性驚厥和骨骼震顫，損害肝、 胃、腎等重要內(nèi)臟器官，誘發(fā)呼吸道炎癥、婦女乳腺瘤等疾病，甚至導(dǎo)致吸食者下一代智能低下，肢體畸形。濫用咖啡因通常也有吸食和注射兩種形式，其興奮刺激作用及毒副反應(yīng)、 癥狀、藥物依賴性與苯丙胺相近。目前，我國已經(jīng)把咖啡因列為“精神藥品”管制，非法走私、販賣、運(yùn)輸、制造咖啡因，無論數(shù)量多少，均屬刑事罪行。因此，咖啡因的實(shí)時(shí)、快速、準(zhǔn)確檢測能為公安機(jī)關(guān)監(jiān)控、 管制咖啡因的非法流通起到良好的輔助作用。當(dāng)前，咖啡因提取和檢測的成熟技術(shù)包括有 色譜、色譜/質(zhì)譜聯(lián)用、毛細(xì)管電泳、分光光度和流動(dòng)注射等分析方法，這些方法往往存在有機(jī)溶劑消耗多，分析時(shí)間長，分析成本相對較高等缺點(diǎn)，急需一種簡單、快速、無需使用大型設(shè)備就可以對咖啡因進(jìn)行準(zhǔn)確檢測的方法。國內(nèi)有關(guān)咖啡因快速檢測的專利還未見報(bào)道，少數(shù)國外專利雖有涉及，但僅限普通飲料的非專業(yè)咖啡因檢測，靈敏度、特異性有限，不能用于咖啡因的專業(yè)檢測。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是彌補(bǔ)該領(lǐng)域的空缺，提供一種方便、快速、靈敏度高的咖啡因膠體金檢測試劑盒。本發(fā)明的一方面，提供了一種咖啡因膠體金檢測試劑盒，包括試劑條，試劑條從加樣端開始依次為濾樣紙、免疫膠體金紙片、免疫硝酸纖維素膜和吸水紙，免疫膠體金紙片上包被有膠體金標(biāo)記的抗咖啡因_BSA(牛血清白蛋白)單克隆抗體，硝酸纖維素膜上的檢測區(qū)(T)噴點(diǎn)有咖啡因-載體復(fù)合物、質(zhì)控區(qū)(C)噴點(diǎn)有羊抗鼠免疫球蛋白IgG。較佳的，所述膠體金標(biāo)記的抗咖啡因-BSA單克隆抗體中，膠體金為粒徑39_42nm 的球形顆粒。本發(fā)明的另一方面，提供了這種咖啡因膠體金檢測試劑盒的制備方法，包括以下步驟
I)用兩步還原法制備平均粒徑為39_42nm的膠體金；2)采用步驟I制得的膠體金標(biāo)記抗咖啡因-BSA單克隆抗體獲得免疫膠體金；3)采用噴金緩沖液稀釋步驟2)的免疫膠體金獲得免疫膠體金溶液，用免疫膠體金溶液噴涂經(jīng)預(yù)處理的玻璃纖維墊片，制得免疫膠體金紙片；4)在硝酸纖維素膜的檢測線和質(zhì)控線上分別噴點(diǎn)咖啡因-載體復(fù)合物及羊抗鼠免疫球蛋白IgG，制得免疫硝酸纖維素膜；5)將濾樣紙、步驟3制備的免疫膠體金紙片、步驟4制備的免疫硝酸纖維素膜、吸水紙依次粘貼在膠板上，切裁制得檢測試劑條；最后將檢測試劑條裝入塑料盒制得檢測試劑盒。步驟I)所述兩步還原法制備平均粒徑為39_42nm的膠體金具體包括下列步驟a)第一次還原氯金酸溶液制備濃度為0. 0004-0. 0005mol/L的HAuCl4水溶液，加熱煮沸20-30分鐘，之后邊攪拌邊加入檸檬酸三鈉水溶液，HAuCl4與檸檬酸三鈉的摩爾比為I : (8-9)，超聲振蕩2-3 分鐘后冷卻至室溫，既制得14 16nm粒徑的膠體金原溶液。b)第二次還原氯金酸溶液將第一步制得的膠體金原溶液放置于4. 0-4. 5°C恒溫冰浴中穩(wěn)定溫度，隨后按膠體金原溶液與HAuCl4水溶液體積比I : (I. 9-2. 0)加入4. 0-4. 5 °C的0. 003-0. 004mol/L HAuCl4水溶液，隨后立即邊攪拌邊滴加4. 0-4. 50C的抗壞血酸與PVP (聚乙烯醇吡咯烷酮) 的混合水溶液，加入的抗壞血酸與本步驟加入的HAuCl4的摩爾比為(25-26) 1，加入的 PVP與本步驟加入的HAuCl4的重量比為I : (2. 0-2. I)，反應(yīng)中保持溫度恒定，攪拌至反應(yīng)完全，溶液呈透明的酒紅色，既制得39-42nm粒徑的膠體金溶液。兩步還原法中，配置各種水溶液均采用雙蒸水。步驟a)中，加入檸檬酸三鈉水溶液的濃度為0. 01-0. 02mol/Lo步驟a)中，超聲震蕩的頻率為20-30KHZ。步驟b)中，抗壞血酸與PVP的混合水溶液的滴加速度為1-2滴/S。步驟b)中，所述抗壞血酸與PVP的混合雙蒸水水溶液中，抗壞血酸的濃度為 0. 017-0. 019mol/L, PVP 的濃度為 0. 137-0. 139g/L。步驟b)中，攪拌反應(yīng)約為50-70分鐘。采用上述方法制得的膠體金清亮透明，粒徑尺寸均一，無凝集顆粒，基本未發(fā)現(xiàn)非球形粒子。步驟2)所述抗咖啡因-BSA單克隆抗體是以咖啡因-BSA復(fù)合物為免疫抗原，利用雜交瘤技術(shù)制得抗咖啡因-BSA單克隆抗體。步驟2)所述膠體金標(biāo)記抗咖啡因-BSA單克隆抗體可采用常規(guī)方法標(biāo)記。具體的，步驟3)免疫膠體金紙片的制備包括下列步驟I.用噴金緩沖液稀釋步驟2)的免疫膠體金，獲得OD54tl值為I. 0 2. 0的免疫膠體金溶液；II.用預(yù)處理液浸泡玻璃纖維紙，干燥后，再用免疫膠體金溶液噴涂玻璃纖維紙， 干燥，制得免疫膠體金紙片。較佳的，步驟I所述噴金緩沖液的組分為8 12v% I. OM Tris液、0. 2 0. 4w/CN 102590521 A 乂％聚乙二醇20000、0. 15 0. 25界八％牛血清白蛋白，0. I 0. 3w/v%脫脂牛奶、0. 25 0. 35w/v %酪蛋白，和0. 02 0. 08w/v %疊氮化鈉，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至8. 5 ± 0. 05，余量為水。最優(yōu)的，步驟I中噴金緩沖液配方為10v% I. OM Tris液、0. 3￥八％聚乙二醇 20000、0. 2w/v*%牛血清白蛋白，0. 2w/v*%脫脂牛奶、0. 3w/v*%酪蛋白，和0. 05w/v*%疊氮化鈉，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至8. 5±0. 05，余量為水。較佳的，步驟II所述預(yù)處理液的組分包括0. 5 0. 8v*% Tween-20,12 18w/v*% 蔗糖，溶劑為水。最優(yōu)的，步驟II中預(yù)處理液配方為0.7% Tween-20，16w/v%蔗糖，余量為水。較佳的，步驟II中，用預(yù)處理液浸泡玻璃纖維紙時(shí)，每30ml預(yù)處理液浸泡玻璃纖維紙26 Imm X 220mm ;用免疫膠體金溶液噴涂玻璃纖維紙時(shí)，每26 Imm X 220mm玻璃纖維紙上噴涂20ml免疫膠體金溶液，干燥，制得免疫膠體金紙片。本發(fā)明中，Wt %為重量百分比，V%指體積百分比；w/v%指重量體積百分比，Iw/ v%即為IOOml溶液中含lg。所述咖啡因-載體復(fù)合物可以為咖啡因-牛血清白蛋白復(fù)合物，可市購或采用常規(guī)方法將咖啡因與載體復(fù)合制得。上述咖啡因膠體金檢測試劑盒的工作原理，即是利用高度特異的抗體-抗原特異結(jié)合反應(yīng)及免疫膜層析技術(shù)，通過免疫競爭抑制法來定性檢測人尿液中出現(xiàn)的咖啡因。試劑盒內(nèi)的檢測試劑條是實(shí)現(xiàn)咖啡因檢測的關(guān)鍵，在試紙條檢測區(qū)(T線)包被了咖啡因-載體復(fù)合物。在試紙條的另一端固定有抗咖啡因-BSA單克隆抗體-膠體金紙片。 當(dāng)尿液從加樣孔加入，滲透到試劑條的加樣墊上，被檢樣本首先與玻璃纖維膜上的膠體金標(biāo)記的抗咖啡因-BSA單克隆抗體結(jié)合，并通過毛細(xì)作用繼續(xù)層析至試劑條硝酸纖維素膜， 順序通過硝酸纖維素膜上噴點(diǎn)了咖啡因-載體復(fù)合物的檢測區(qū)和噴點(diǎn)了 IgG的質(zhì)控區(qū)。如果尿液中含有咖啡因，它們將與咖啡因-載體復(fù)合物競爭膠體金-抗咖啡因-BSA單克隆抗體上有限的抗原結(jié)合位點(diǎn)，當(dāng)咖啡因濃度達(dá)到產(chǎn)品設(shè)計(jì)的閾值濃度以上時(shí)，它們將占據(jù)抗咖啡因-BSA單克隆抗體上全部的抗原結(jié)合位點(diǎn)，這樣就阻止了抗咖啡因-BSA單克隆抗體-膠體金和檢測區(qū)的咖啡因-復(fù)合物結(jié)合，檢測區(qū)不能捕獲到膠體金顆粒而無紅色色帶出現(xiàn)，檢測結(jié)果呈陽性。如果尿液中沒有咖啡因或咖啡因的濃度低于閾值濃度，則抗咖啡因-BSA單克隆抗體-膠體金隨同尿液運(yùn)行至檢測區(qū)，檢測區(qū)捕獲到膠體金顆粒而呈現(xiàn)紅色色帶，檢測結(jié)果呈陰性。在試紙條上的質(zhì)控區(qū)(C線)包被有羊抗鼠IgG，以指示試劑盒反應(yīng)系統(tǒng)工作是否正常。質(zhì)控線的出現(xiàn)與咖啡因的存在無關(guān)。質(zhì)控區(qū)色帶的出現(xiàn)表明①樣品加入量充足② 樣品在紙條上運(yùn)行正常。本發(fā)明試劑盒的使用方法為I.將試劑盒放置在水平臺面上。2.用加樣吸管吸取尿樣，然后滴3滴(約120ul)尿樣到試劑盒的加樣孔中。每檢測一份不同的樣品注意要使用不同的吸管。3.觀察結(jié)果在滴加樣品后3-8分鐘判讀結(jié)果。檢測結(jié)果的判斷方法陰性在結(jié)果觀察窗口內(nèi)出現(xiàn)兩條色帶，即檢測線(T線)和質(zhì)控線(C線)位置各
6出現(xiàn)一條紅色線條，表示樣品中無咖啡因存在。陽性只在結(jié)果觀察窗口的質(zhì)控線(C線)位置出現(xiàn)一條紅色線條，檢測線(T線) 未出現(xiàn)任何線條，表示樣品中有咖啡因存在。無效質(zhì)控線(C線)不出現(xiàn)。任何情況下，C線均應(yīng)形成，表示加樣和操作正確。 C線未出現(xiàn)表明測試結(jié)果是不確定的，應(yīng)重做。本發(fā)明的有益效果(I)本發(fā)明在制備膠體金檢測試劑盒時(shí)，采用了兩步還原法制備膠體金分子，使得到的膠體金分子呈大小均一的約40nm球形顆粒，比之已公開的技術(shù)，雖然增加了一個(gè)操作步驟，但由于膠體金顆粒大小適中、整體均一，使其與單克隆抗體的結(jié)合效率更高、效果更穩(wěn)定，這保證了標(biāo)記步驟的可控性、降低了試劑盒的批間差異。(2)免疫膠體金紙片制備步驟中，通過采用合理配方的預(yù)處理液對玻璃纖維膜進(jìn)行預(yù)處理并選配合適的噴金緩沖液，可保證免疫膠體金釋放完全的基礎(chǔ)上，有效減慢檢測時(shí)免疫膠體金的釋放層析，有利于抗原抗體充分反應(yīng)結(jié)合，有效的提高了反應(yīng)的靈敏度，同樣的閾值下，還可降低免疫膠體金的用量，節(jié)約成本。(3)本發(fā)明制備的咖啡因檢測試劑盒具有靈敏度高；操作簡單；檢測結(jié)果肉眼可見，無需特殊實(shí)驗(yàn)儀器和專業(yè)技術(shù)人員；檢測快速，5-8分鐘內(nèi)可顯示檢測結(jié)果；而且檢測結(jié)果費(fèi)用低廉，儲存和運(yùn)輸方便等優(yōu)點(diǎn)。


圖I :膠體金透射電鏡2 :咖啡因膠體金檢測試劑盒試劑條示意圖I :濾樣紙2 :免疫膠體金紙3 :免疫硝酸纖維素膜4 :吸水紙5 :檢測線(T線)6 :質(zhì)控線(C線)
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例I咖啡因膠體金檢測試劑盒的制備試劑來源羊抗鼠IgG多克隆抗體、咖啡因-牛血清白蛋白復(fù)合物(KET-BSA):購自美國美迪生物技術(shù)有限公司(MAXMED LABORATORIES INC.)咖啡因小分子購自中國藥品生物制品檢定所。硝酸纖維素薄膜、玻璃纖維紙購自德國賽多利斯公司(SART0RIUS)制備步驟(I)膠體金的制備用檸檬酸鈉-抗壞血酸兩步還原法制備粒徑40nm的膠體金a)第一次還原氯金酸溶液將6ml 0. 0164mol/L的HAuCl4水溶液加入200ml雙蒸水中，加熱煮沸30分鐘，之后緩慢攪動(dòng)并準(zhǔn)確加入50ml 0. 016mol/L檸檬酸三鈉水溶液。 25KHZ超聲振蕩2分鐘后冷卻至室溫，既制得約15nm粒徑的膠體金原溶液。b)第二次還原氯金酸溶液取第一步制得的膠體金原核溶液26ml，并放置于4V水浴鍋中穩(wěn)定溫度，隨后加入50ml預(yù)冷為4. (TC的0. 0035mol/L HAuCl4水溶液并立即緩慢滴加250ml預(yù)冷為4. (TC的含0. 018mol/L的抗壞血酸與0. 138g/L PVP的混合水溶液，滴加速度為1-2滴/s，攪拌反應(yīng)I小時(shí)，溶液呈透明的酒紅色，既制得40nm粒徑的膠體金溶液。制得的膠體金采用紫外分光光度計(jì)掃描有單一吸收峰，峰形窄，Xmax約為 525nm，采用透射電鏡觀察，如圖I所示，粒徑范圍約為40nm，粒徑尺寸均一，無凝集顆粒，基本未發(fā)現(xiàn)非球形粒子。(2)利用雜交瘤技術(shù)制備抗咖啡因-BSA單克隆抗體；a)取6周齡BALB/C雌性小鼠進(jìn)行免疫，首次腹腔注射100 U g純化的咖啡因-BSA 復(fù)合物，隨后每周注射IOOiI g咖啡因-BSA復(fù)合物，共注射3次進(jìn)行免疫。融合前3天用 150 u g靜脈注射加強(qiáng)免疫。b)取加強(qiáng)免疫的小鼠，拉頸處死小鼠，浸泡于75%酒精中3-5分鐘，取出脾臟，制備高活性的脾細(xì)胞懸浮液。c)將小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞按I : 5比例充分混合，在37°C水浴條件下利用PEG進(jìn)行細(xì)胞融合，融合細(xì)胞轉(zhuǎn)入HAT培養(yǎng)液中，接種96孔培養(yǎng)板繼續(xù)培養(yǎng)，約80 %的孔生長形成克隆，多步篩選獲得一株高抗體分泌細(xì)胞株，規(guī)模化培養(yǎng)后經(jīng)分離純化制得抗咖啡因-BSA單克隆抗體。(3)制備抗咖啡因-BSA(咖啡因-牛血清白蛋白)單克隆抗體-膠體金復(fù)合物；a)將抗咖啡因-BSA單克隆抗體用0. IM PH7. 2的磷酸鹽緩沖液稀釋成I. 2mg/ml 的單克隆抗體溶液。b)免疫膠體金溶液的配制在IOOOml的膠體金溶液里加入IOOml 0. IM PH7. 2的磷酸鹽緩沖液混勻。在攪拌下，再緩緩加入I. 2mg/ml的單克隆抗體溶液。室溫反應(yīng)10分鐘。c)反應(yīng)結(jié)束后，在上述反應(yīng)液中加入1/50倍反應(yīng)液總體積的5%BSA，使反應(yīng)液中 BSA的終濃度為0. I %。室溫反應(yīng)10分鐘。d)濃縮免疫膠體金復(fù)合物溶液至體積小于80ml，補(bǔ)充PH7. 2，0. OlM磷酸鹽-0. 01 % BSA緩沖液至最終體積80ml。e)將制備好的免疫膠體金8000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘，保留沉淀，并收集上清 12500轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘，棄上清。收集兩次離心沉淀用含有0. I % BSA的硼酸緩沖液復(fù)溶到OD54tl在13-15之間。制得的純化膠體金標(biāo)記的抗咖啡因單克隆抗體。(4)免疫膠體金紙制備分別采用方法1、2、3制備。方法I :4. I預(yù)處理液的制備準(zhǔn)確稱取7ml Tween-20,160g鹿糖，加純化水定容至 IOOOml04. 2噴金緩沖液的制備取800ml純化水，往里加入100ml I. OM Tris液，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至8. 5。準(zhǔn)確稱取3. Og聚乙二醇20000、2. Og牛血清白蛋白，2. Og脫脂牛奶，3. Og 酪蛋白溶液和0. 5g疊氮化鈉加入溶液中，充分溶解，混合均勻，加純化水至總體積1000ml。4. 3用噴金緩沖液稀釋步驟3制備的免疫膠體金，至溶液OD540值為I. 2，獲得免疫膠體金溶液。
4. 4用預(yù)處理液浸泡玻璃纖維紙，每30ml預(yù)處理液浸泡玻璃纖維紙 26ImmX 220mm，浸泡30min后，37 °C下干燥；再用免疫膠體金溶液噴涂玻璃纖維紙，每 261mmX 220mm玻璃纖維紙上噴涂20ml免疫膠體金溶液，干燥，制得免疫膠體金紙片。方法2 4. I預(yù)處理液的制備準(zhǔn)確稱取5ml Tween-20,180g鹿糖，加純化水定容至 IOOOml04. 2噴金緩沖液的制備取800ml純化水，往里加入120ml 1.0M Tris液，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至8. 5。準(zhǔn)確稱取2. Og聚乙二醇20000、I. 5g牛血清白蛋白，3. Og脫脂牛奶，2. 5g 酪蛋白溶液和0. 8g疊氮化鈉加入溶液中，充分溶解，混合均勻，加純化水至總體積1000ml。4. 3用噴金緩沖液稀釋步驟3)的免疫膠體金，至溶液OD540值為I. 2，獲得免疫膠體金溶液。4. 4用預(yù)處理液浸泡玻璃纖維紙，每30ml預(yù)處理液浸泡玻璃纖維紙 26ImmX 220mm，浸泡25min后，37 °C下干燥；再用免疫膠體金溶液噴涂玻璃纖維紙，每 261mmX 220mm玻璃纖維紙上噴涂20ml免疫膠體金溶液，干燥，制得免疫膠體金紙片。方法3 4. I預(yù)處理液的制備準(zhǔn)確稱取8ml Tween-20,120g鹿糖，加純化水定容至 IOOOml04. 2噴金緩沖液的制備取800ml純化水，往里加入80ml I. OM Tris液，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至8. 5。準(zhǔn)確稱取4. Og聚乙二醇20000、2. 5g牛血清白蛋白，I. Og脫脂牛奶，3. 5g酪蛋白溶液和0. 2g疊氮化鈉加入溶液中，充分溶解,混合均勻,加純化水至總體積1000ml。4. 3用噴金緩沖液稀釋步驟3)的免疫膠體金，至溶液OD540值為I. 2，獲得免疫膠體金溶液。4. 4用預(yù)處理液浸泡玻璃纖維紙，每30ml預(yù)處理液浸泡玻璃纖維紙 26ImmX 220mm，浸泡30min后，37 °C下干燥；再用免疫膠體金溶液噴涂玻璃纖維紙，每 261mmX 220mm玻璃纖維紙上噴涂20ml免疫膠體金溶液，干燥，制得免疫膠體金紙片。(5)在硝酸纖維素膜的檢測線和質(zhì)控線上分別噴點(diǎn)咖啡因-BSA復(fù)合物及羊抗鼠 IgG，制得免疫硝酸纖維素膜；a) C線溶液的配制將羊抗鼠IgG原液用0. 01M, PH7. 2磷酸緩沖液稀釋成2. 5mg/ ml的羊抗鼠IgG抗體溶液。b) T線溶液的配制取20ml終濃度為2. Omg/ml的嗎啡-BSA單克隆抗體蛋白。d)在硝酸纖維素膜上噴點(diǎn)C、T線，將噴好的膜放入真空腔中抽真空干燥6小時(shí)以上，備用。(6)將濾樣紙、免疫膠體金紙、免疫硝酸纖維素膜、吸水紙依次粘貼在膠板上，切裁成寬度為3 5mm的試劑條制得檢測試劑條；(7)將檢測試劑條裝入塑料盒制得檢測試劑盒。實(shí)施例2咖啡因膠體金檢測試劑盒的靈敏度實(shí)驗(yàn)檢測方法I、取實(shí)施例I制得的咖啡因膠體金檢測試劑盒，將試劑盒放置在水平臺面上。2、用加樣吸管吸取樣品，然后滴3滴(約120ul)樣品到試劑盒的加樣孔中。每檢測一份不同的樣品使用不同的吸管。3、觀察結(jié)果在滴加樣品后3-8分鐘判讀結(jié)果。檢測樣品配置咖啡因濃度為10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml的質(zhì)控參考品作為樣品。檢測結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種咖啡因膠體金檢測試劑盒,包括試劑條,試劑條從加樣端開始依次為濾樣紙、免疫膠體金紙片、免疫硝酸纖維素膜和吸水紙，免疫膠體金紙片上包被有膠體金標(biāo)記的抗咖啡因-BSA單克隆抗體，硝酸纖維素膜上的檢測區(qū)噴點(diǎn)有咖啡因-載體復(fù)合物、質(zhì)控區(qū)噴點(diǎn)有羊抗鼠免疫球蛋白IgG。
2.如權(quán)利要求I所述咖啡因膠體金檢測試劑盒，其特征在于，所述膠體金標(biāo)記的抗咖啡因-BSA單克隆抗體中，膠體金為粒徑39-42nm的球形顆粒。
3.如權(quán)利要求I所述咖啡因膠體金檢測試劑盒的制備方法，包括以下步驟1)用兩步還原法制備平均粒徑為39-42nm的膠體金；2)采用步驟I制得的膠體金標(biāo)記抗咖啡因-BSA單克隆抗體獲得免疫膠體金；3)采用噴金緩沖液稀釋步驟2)的免疫膠體金獲得免疫膠體金溶液，用免疫膠體金溶液噴涂經(jīng)預(yù)處理的玻璃纖維墊片，制得免疫膠體金紙片；4)在硝酸纖維素膜的檢測線和質(zhì)控線上分別噴點(diǎn)咖啡因-載體復(fù)合物及羊抗鼠免疫球蛋白IgG，制得免疫硝酸纖維素膜；5)將濾樣紙、步驟3制備的免疫膠體金紙片、步驟4制備的免疫硝酸纖維素膜、吸水紙依次粘貼在膠板上，切裁制得檢測試劑條；最后將檢測試劑條裝入塑料盒制得檢測試劑盒。
4.如權(quán)利要求3所述咖啡因膠體金檢測試劑盒的制備方法，其特征在于，步驟I)所述兩步還原法制備平均粒徑為39-42nm的膠體金具體包括下列步驟a)第一次還原氯金酸溶液制備濃度為O. 0004-0. 0005mol/L的HAuCl4水溶液，加熱煮沸20-30分鐘，之后邊攪拌邊加入檸檬酸三鈉水溶液，HAuCl4與檸檬酸三鈉的摩爾比為I : (8-9)，超聲振蕩2-3分鐘后冷卻至室溫，既制得14 16nm粒徑的膠體金原溶液；b)第二次還原氯金酸溶液將第一步制得的膠體金原溶液放置于4. 0-4. 5°C恒溫冰浴中穩(wěn)定溫度，隨后按膠體金原溶液與 HAuCIjK溶液體積比 I (I. 9-2. O)加入 4. 0-4. 5°C 的 O. 003-0. 004mol/L HAuCl4 水溶液，隨后立即邊攪拌邊滴加4. 0-4. 5°C的抗壞血酸與PVP (聚乙烯醇吡咯烷酮)的混合水溶液，加入的抗壞血酸與本步驟加入的HAuCl4的摩爾比為(25-26) 1，加入的PVP與本步驟加入的HAuCl4的重量比為I : (2.0-2. I)，反應(yīng)中保持溫度恒定，攪拌至反應(yīng)完全，溶液呈透明的酒紅色，既制得39-42nm粒徑的膠體金溶液；兩步還原法中，配置各種水溶液均采用雙蒸水。
5.如權(quán)利要求4所述咖啡因膠體金檢測試劑盒的制備方法，其特征在于，步驟a)中，加入檸檬酸三鈉水溶液的濃度為O. 01-0. 02mol/L。
6.如權(quán)利要求4所述咖啡因膠體金檢測試劑盒的制備方法，其特征在于，步驟b)中，所述抗壞血酸與PVP的混合雙蒸水水溶液中，抗壞血酸的濃度為O. 017-0. 019mol/L,PVP的濃度為 O. 137-0. 139g/L。
7.如權(quán)利要求3所述咖啡因膠體金檢測試劑盒的制備方法，其特征在于，步驟3)免疫膠體金紙片的制備包括下列步驟I.用噴金緩沖液稀釋步驟2)的免疫膠體金，獲得OD54tl值為I.O 2. O的免疫膠體金溶液；II.用預(yù)處理液浸泡玻璃纖維紙，干燥后，再用免疫膠體金溶液噴涂玻璃纖維紙，干燥，制得免疫膠體金紙片。
8.如權(quán)利要求7所述咖啡因膠體金檢測試劑盒的制備方法，其特征在于，步驟I所述噴金緩沖液的組分為8 12v% I. OM Tris液、O. 2 O. 4￥八％聚乙二醇20000、0· 15 O. 25界八％牛血清白蛋白，O. I O. 3w/v%脫脂牛奶、O. 25 O. 35w/v%酪蛋白，和O. 02 O. 08w/v%疊氮化鈉，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至8. 5 ±O. 05，余量為水。
9.如權(quán)利要求7所述咖啡因膠體金檢測試劑盒的制備方法，其特征在于，步驟II所述預(yù)處理液的組分包括0. 5 O. 8v% Tween-20,12 18w/v%鹿糖,溶劑為水。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種咖啡因膠體金檢測試劑盒，包括試劑條，試劑條從加樣端開始依次為濾樣紙、免疫膠體金紙片、免疫硝酸纖維素膜和吸水紙，免疫膠體金紙片上包被有膠體金標(biāo)記的抗咖啡因-BSA單克隆抗體，硝酸纖維素膜上的檢測區(qū)噴點(diǎn)有咖啡因-載體復(fù)合物、質(zhì)控區(qū)噴點(diǎn)有羊抗鼠免疫球蛋白IgG。本發(fā)明還進(jìn)一步提供了上述咖啡因膠體金檢測試劑盒的制備方法，采用本發(fā)明可獲得一種快速檢測人尿液中是否含有咖啡因的試劑盒。
文檔編號G01N33/558GK102590521SQ201210046239
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月27日
發(fā)明者張國華 申請人:上海凱創(chuàng)生物技術(shù)有限公司