專利名稱：一種測定乳制品中1,3-二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯含量的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及屬于分析化學技術領域，具體涉及一種測定乳制品中1，3_ 二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯含量的方法。
背景技術：
1,3- 二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯(OPO)是2008年衛(wèi)生部新增加的一種新資源食品，它是類似于母乳脂肪的一種甘油三酯。母乳脂肪中約70%的棕櫚酸連結在甘油三酯的 sn-2位上，而sn-1，3位主要是不飽和脂肪酸。棕櫚酸是人體重要的產能脂肪酸，它在甘油三酯上的位置對其消化和吸收有很大的影響，sn-2位上的棕櫚酸能以sn-2位單甘脂的形式被吸收，而sn-1，3位上的棕櫚酸則易與礦物質(鈣、鎂等)形成不溶性的鹽流失掉，同時也造成礦物質和能量的流失。因此，1,3- 二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯作為一種新型的食品添加劑，具有促進機體對能量吸收，促進鈣、鎂等骨骼礦物質吸收，緩解嬰幼兒便秘等功能。 目前，1，3_ 二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯的研究在國外已逐步從實驗室階段轉向工業(yè)化生產和應用，它主要應用于嬰幼兒配方食品中。目前國內所用的嬰幼兒奶粉中脂肪的檢測方法主要是測定奶粉中各種游離脂肪酸的含量。該方法主要是通過前處理提取脂肪后，再通過皂化反應把樣品中的脂肪甲酯化， 最后氣相色譜外標法對各脂肪酸甲酯定量，所以，該方法只能夠測定脂肪酸的量，不能用于甘油三酯的測定。目前用于檢測OPO的方法主要是測定2位棕櫚酸占總棕櫚酸的比例。該方法是利用胰脂肪酶去除甘油三酯sn-1，3位的脂肪酸，再用薄層層析法分離得到sn-2單甘脂，衍生成為甲酯后GC分析，譜圖面積歸一法得到sn-2位棕櫚酸的比例?？倶悠费苌芍舅峒柞?，GC譜圖得到總棕櫚酸的比例。使用公式
比例=2位_旨肪· *100 3*總樣品的脂肪酸即可得到sn-2位棕櫚酸占總棕櫚酸的比例，但該方法不能準確測定OPO的添加量。因此，尋找一種直接測定乳制品中的OPO含量及其它甘油三酯的方法是必須的。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種直接測定乳制品中1，3- 二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯含量的方法。為解決上述技術問題，本發(fā)明采用的技術方案如下一種測定乳制品中1，3_ 二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯含量的方法，該方法包括如下步驟
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(1)按照常規(guī)方法提取乳制品中的脂肪；(2)將步驟(1)提取的脂肪溶于溶于二氯甲烷中，再通過高效液相色譜法測定1， 3- 二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯的含量；其中，高效液相色譜法檢測條件為色譜柱正相C18色譜柱，其固定相為十八烷基硅烷鍵合硅膠吸附相；流動相A相為二氯甲烷，B相為丙酮或乙腈；tQ時刻，X為10 25%;從tQ時刻至 ti時刻，X線性提高，直至ti時刻X達到26 37% ；從ti時刻至t2時刻，X繼續(xù)線性提高， 直至t2時刻X達到38 60% ；從t2時刻至t3時刻，X線性降低，直至t3時刻X達到10 25% ；其中，VHt3為液相檢測總時間中的時刻，t3為樣品停止檢測時刻，W t2 < t3,取值范圍為 t0 = Omin, IOmin 彡、彡 20min, 21min 彡 t2 彡 30min, 29min 彡 t3 彡 35min ； X為A相體積與A、B兩相總體積的體積百分比；上述梯度洗脫的示意圖見圖4，但本發(fā)明方法不局限于圖4所顯示的具體洗脫方式。普通高效液相檢測儀都可設定洗脫程序，完成上述梯度洗脫過程。流動相流速0.3 1. 3mL/min,優(yōu)選 0. 8mL/min ；檢測儀蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)或示差折光檢測器(RI)；色譜柱溫18 30°C，優(yōu)選21 °C ；進樣體積10 20μ k，優(yōu)選20μ L。其中，所述的乳制品為初乳、嬰幼兒食品、奶粉、還原乳或含乳飲料。步驟(1)中，提取乳制品中的脂肪可按常規(guī)方法處理，優(yōu)選按照如下步驟提取脂肪，具體參考 GB5413. 27-2010 ①預處理若乳制品為固態(tài)且含淀粉的樣品時，加入適量淀粉酶去除淀粉后，再加入熱水溶解；若乳制品為固態(tài)且不含淀粉的樣品時，直接加入熱水溶解；若乳制品為液態(tài)樣品時，不需要預處理；②處理酪蛋白鈣鹽向步驟①得到的溶液中加入氨水，振蕩均勻，熱水水浴10 30min ；③提取向步驟②得到的溶液中加入乙醇混勻，繼續(xù)加入乙醚混勻，再繼續(xù)加入石油醚混勻，靜置10 60min，取有機層；重復加入上述三種試劑1 5次，靜置，取有機層， 合并有機層，旋轉蒸發(fā)儀20 70°C下蒸發(fā)提取液至近干，得到的粘稠狀液體即為乳制品中的脂肪。其中，所述的正相C18色譜柱規(guī)格為4. 6*250mm，5ym。其中，步驟(1)提取的脂肪溶于溶于二氯甲烷后，在進樣前，樣品需經有機膜過濾及超聲處理。所述的有機膜孔徑< 0. 45 μ m,優(yōu)選孔徑為0. 25 μ m。其中，所述的檢測儀為蒸發(fā)光散射檢測器時，漂移管溫度為40 70°C，優(yōu)選50°C; 靈敏度為1、2、4、8或16，優(yōu)選1 ；氮氣流速為1. 2 1. 8L/min，優(yōu)選1. 5L/min。本發(fā)明中，1，3-二油酸-2-棕櫚酸的含量可通過本領域常用的定量分析方法確定，優(yōu)選用外標法或內標法計算峰面積，從而確定1，3-二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯的含量。本發(fā)明中所述的氨水、乙醇、乙醚和石油醚的純度可用本領域常規(guī)使用純度，較佳的選用分析純；二氯甲烷、丙酮和乙腈較佳的選用色譜純。本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。
有益效果本發(fā)明較現(xiàn)有技術優(yōu)勢在于1、本發(fā)明將乳制品中脂肪的常規(guī)提取方法與高效液相色譜法結合，解決了乳制品中甘油三酯的定量分析問題，與目前乳品中所用的脂肪檢測方法相比，本方法可以把不同的甘油三酯分離并通過外標法定量，從而實現(xiàn)了甘油三酯的準確檢測。2、采用色譜柱對樣品進行分離檢測OPO的含量，與氣相色譜檢測2位棕櫚酸占總棕櫚酸比例的方法相比，可以直接測得OPO的添加量。另外，本色譜柱還可通過調節(jié)流動相的比例來實現(xiàn)樣品間的分離，使樣品之間可以很好的實現(xiàn)基線分離，從而達到準確定量分析的目的。3、本發(fā)明使用高效液相色譜法中最為常用的C18色譜柱，檢測成本相對較低。


圖1為1，3-二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯標準品與其同分異構體的HPLC曲線圖。圖2為HPLC測定1，3_ 二油酸_2_棕櫚酸甘油三酯質量濃度的標準曲線圖。圖3為實施例1中奶粉的1，3-二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯檢測的HPLC曲線圖， 其中，1、三油酸甘油三酯(000)及比它極性還弱的甘油三酯；2、1，3_ 二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯(OPO) ；3、1，2-二油酸-3-棕櫚酸甘油三酯(OOP) ；4、1，2-二棕櫚酸-3-油酸甘油三酯(PPO) ；5、1，3-二棕櫚酸-2-油酸甘油三酯(POP) ；6、三棕櫚酸甘油三酯(PPP)及比它極性還強的甘油三酯。圖4為本發(fā)明高效液相檢測法中梯度洗脫示意圖。圖5為實施例3中嬰幼兒奶粉中1，3- 二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯檢測的HPLC曲線圖，其中，1、三油酸甘油三酯(000)及比它極性還弱的甘油三酯；2、1，3-二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯(OPO) ；3、1，2-二油酸-3-棕櫚酸甘油三酯(OOP) ；4、1，2-二棕櫚酸-3-油酸甘油三酯(PPO) ；5、1，3-二棕櫚酸-2-油酸甘油三酯(POP) ；6、三棕櫚酸甘油三酯(PPP)及比它極性還強的甘油三酯。
具體實施例方式根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的內容僅用于說明本發(fā)明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發(fā)明。實施例1 嬰幼兒奶粉中0P0的含量測定。稱取嬰幼兒奶粉樣品(法國合生元)1. 0g(精確到0. Img)至抽脂管中，加入IOmL 65 士 1 °C的水溶解試樣，振搖，使樣品完全分散。在樣品中加入2mL氨水，于65 士 1 °C水浴鍋中放置15min，取出輕搖，冷至室溫。在制備好的樣品中加入IOmL乙醇，混勻。加入25mL乙醚，加塞振搖lmin，加入25mL石油醚，加塞振搖lmin，靜置、分層，有機層轉入磨口燒瓶中。 再加入25mL乙醚及25mL石油醚，加塞振搖lmin，靜置、分層，有機層轉入磨口燒瓶中，再重復提取操作一次。合并有機層于磨口燒瓶中，旋轉蒸發(fā)儀下濃縮至干。二氯甲烷稀釋至250mL，即得到脂肪溶液。將上述得到的脂肪溶液用0. 25μπι有機系濾膜針式過濾器過濾至樣品瓶內，超聲處理后，供高效液相色譜測定。
HPLC檢測條件如下高效液相色譜儀Agilent 1200型；色譜柱S印axHP-C18 (250*4. 6mm, 5 μ m，美國)；流動相A相為二氯甲烷，B相為乙腈；t0時刻，X為20%；JA t0時刻至、時刻，X線性提高，直至、時刻X達到35% ；從、時刻至t2時刻，X繼續(xù)線性提高，直至t2時刻X達到 55% ；從t2時刻至t3時刻，X線性降低，直至t3時亥Ij X達到20% ；t0 = Omin,、= 17min， t2 = 27min, t3 = 35min, X為A相體積與A、B兩相總體積的體積百分比；流速0. 8mL/min ；檢測儀蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD) ；ELSD漂移管溫度50°C，氮氣流速1.5L/ min,靈敏度1 ；色譜柱溫21°C;進樣體積20 μ L。標準曲線的繪制(外標法測定物質含量)準確稱取1，3- 二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯(OPO)標品(瑞士 sigma公司)制成的OPO溶液濃度分別為1 300 μ g/mL ；用高效液相色譜測定溶液在ELSD中峰面積繪制標準曲線如下:lgY = 1. 4537+1. 19231gX(R2 = 0. 9990，圖 2)。OPO和其同分異構體1，2- 二油酸-3-棕櫚酸甘油三酯(OOP)分離度的確定分別稱取OPO和OOP標品制成混合溶液，濃度為50 μ g/mL,高效液相色譜檢測，得到它們的分離譜圖(圖1)，分離度為R = 3. 18 > 1. 5，即完全分離。0P0和其同分異構體1，2-二油酸-3-棕櫚酸甘油三酯(00P)檢測限與定量限的確定稱取0P0標品制成標準溶液，濃度為5 μ g/mL,逐級稀釋，高效液相色譜檢測，得到 0P0最低檢測限(信噪比S/N = 3)為0. 001 μ g，最低定量限(信噪比S/N = 10)為0. 05 μ g。 精密度實驗通過上述方法對同一嬰幼兒奶粉樣品進行6次同步實驗，實驗1的HPLC測定如圖 3所示，可以看出實驗能夠將0P0與00P及其它甘油三酯的基線分離，對照標準曲線，結果如表1。表1同一種嬰幼兒奶粉的0P0含量的測定
序號峰面積保留時間/min 樣品含量/mg/g
15876.319.53820.39
25658.419.83719.45
35642.420.28719.38
45739.420.39219.83
55621.720.35419.30
65797.620.44620.08由表1結果計算得到的相對標準偏差RSD = 2. 20%。由上述可得，相對標準偏差為2. 20%，則表明其重現(xiàn)性良好。
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通過上述方法在嬰幼兒奶粉中加入不同量的OPO標品，與本底做比較，對照標準曲線，結果如表2所示表2回收率測定
權利要求
1.一種測定乳制品中1，3-二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯含量的方法，其特征在于該方法包括如下步驟(1)按照常規(guī)方法提取乳制品中的脂肪；(2)將步驟(1)提取的脂肪溶于溶于二氯甲烷中，再通過高效液相色譜法測定1，3_二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯的含量；其中，高效液相色譜法檢測條件為色譜柱正相C18色譜柱；流動相A相為二氯甲烷，B相為丙酮或乙腈；、時刻，X為10 25%;從、時刻至、時刻，X線性提高，直至、時刻X達到沈 37% ；從、時刻至t2時刻，X繼續(xù)線性提高，直至 t2時亥|J X達到38 60%;從t2時刻至t3時刻，X線性降低，直至t3時亥Ij X達到10 25%； 其中，Wt2J3為液相檢測總時間中的時刻，t3為樣品停止檢測時刻，、<、< t2 < t3， 取值范圍為 t0 = Omin, IOmin 彡、彡 20min, 21min 彡 t2 彡 30min, 29min 彡 t3 彡 35min ；X 為A相體積與A、B兩相總體積的體積百分比；檢測儀蒸發(fā)光散射檢測器或示差折光檢測器；色譜柱溫18 30°C ；進樣體積10 20 μ L。
2.根據(jù)權利要求1所述的測定乳制品中1，3_二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯含量的方法， 其特征在于所述的乳制品為初乳、嬰幼兒食品、奶粉、還原乳或含乳飲料。
3.根據(jù)權利要求1所述的測定乳制品中1，3_二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯含量的方法， 其特征在于所述的正相C18色譜柱規(guī)格為4. 6*250mm，5 μ m。
4.根據(jù)權利要求1所述的測定乳制品中1，3_二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯含量的方法， 其特征在于將步驟(1)提取的脂肪溶于溶于二氯甲烷后，在進樣前，樣品需經有機膜過濾及超聲處理。
5.根據(jù)權利要求1所述的測定乳制品中1，3_二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯含量的方法， 其特征在于所述的檢測儀為蒸發(fā)光散射檢測器時，漂移管溫度為40 70°C，靈敏度為1、2、 4、8或16，氮氣流速為1. 2 1. 8L/min。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種測定乳制品中1，3-二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯含量的方法，該方法包括如下步驟(1)按照常規(guī)方法提取乳制品中的脂肪；(2)將步驟(1)提取的脂肪溶于溶于二氯甲烷中，再通過高效液相色譜法測定1，3-二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯的含量。本發(fā)明方法解決了無法直接對甘油三酯定量的難點，具有準確程度高、受環(huán)境變化影響較小、操作方法簡便等優(yōu)點。
文檔編號G01N30/06GK102175800SQ20111000267
公開日2011年9月7日 申請日期2011年1月7日 優(yōu)先權日2011年1月7日
發(fā)明者吳菁嵐, 姜金斗, 應漢杰, 楊金寶, 柏建新, 沈劼, 熊健, 程利花, 謝婧婧, 陳勇, 陳曉春 申請人:南京工業(yè)大學