專利名稱：微量蛋白檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蛋白檢測方法，尤其涉及一種基于磁珠、納米金探針和滾環(huán)擴(kuò)增的微量蛋白檢測方法。
背景技術(shù)：
免疫學(xué)技術(shù)是用以檢測特定蛋白(抗原)的最有效的方法，比如在實(shí)驗(yàn)室最常用的Western blot、免疫熒光和在臨床廣泛使用的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)，都是利用抗體的特異性實(shí)現(xiàn)的。由于所有的結(jié)合反應(yīng)都通過自由擴(kuò)散進(jìn)行，結(jié)合效率比較低。因此， 磁珠就被引入到反應(yīng)體系中，磁珠是可以作為固相載體，對(duì)抗原進(jìn)行分離和富集，又因?yàn)槠涑叽巛^小，可以與待測的液體樣品充分接觸，有利于提高抗原結(jié)合效率。但是，蛋白檢測的靈敏度始終低于核酸檢測，其原因在于核酸可以擴(kuò)增而蛋白無法擴(kuò)增。于是有人想到了將DNA與抗體相連接，通過擴(kuò)增與抗體相連的DNA以放大信號(hào)，借此彌補(bǔ)蛋白無法擴(kuò)增的劣勢。DNA擴(kuò)增的方法有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)以及各種等溫?cái)U(kuò)增的方法，PCR是一種變溫?cái)U(kuò)增的方法，需要特定的儀器，且與之前的抗原抗體反應(yīng)不在同一種管子內(nèi)進(jìn)行，在操作上造成不便，也容易造成交叉污染。等溫?cái)U(kuò)增對(duì)儀器的要求較低，其中滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)因其技術(shù)的成熟性，是等溫?cái)U(kuò)增中最為廣泛使用的一種，將其與抗原抗體反應(yīng)相結(jié)合，就形成了免疫RCA(Immuno-RCA)的方法。在免疫RCA方法中，寡核苷酸引物的5’端標(biāo)記有抗體，抗原抗體反應(yīng)后，加入RCA反應(yīng)組分與環(huán)狀DNA模板進(jìn)行RCA,然后標(biāo)記有熒光素的探針與RCA產(chǎn)物原位雜交，最后對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行檢測。免疫RCA方法使蛋白檢測的靈敏度得到了改善，但是，對(duì)于微量蛋白的檢測，現(xiàn)有免疫RCA方法的靈敏度仍然偏低。隨著納米技術(shù)的發(fā)展，納米材料在其它學(xué)科的應(yīng)用也逐漸增加，這也為生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展提供了新的契機(jī)。作為標(biāo)記材料的納米金顆粒，對(duì)生物分子具有很強(qiáng)的吸附已經(jīng)在免疫檢測和免疫電鏡中被使用，是納米材料中最成熟的一種。將納米材料與生物醫(yī)學(xué)相結(jié)合，將推動(dòng)生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種微量蛋白檢測方法，該方法比傳統(tǒng)的免疫RCA方法具有更高的靈敏度。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種微量蛋白檢測方法，包括以下步驟將抗待測蛋白的抗體標(biāo)記到磁珠表面，制成抗體標(biāo)記的磁珠；將納米金顆粒與抗待測蛋白的抗體、DNA連接，制成抗體與DNA通過納米金顆粒相連接的納米金探針；將抗體標(biāo)記的磁珠與待測蛋白樣品混合，用磁鐵吸附該抗體標(biāo)記的磁珠，使待測蛋白得到分離和富集；加入納米金探針，該探針與所述分離和富集的待測蛋白結(jié)合；
加入環(huán)形DNA模板、滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)組分及熒光標(biāo)記探針，進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)；檢測熒光信號(hào)，得待測蛋白的檢測結(jié)果。所述連接抗體與DNA的納米金顆粒的直徑為10 30納米。所述納米金探針的抗體與DNA的分子數(shù)之比為I : 5 I : 20。優(yōu)選的，所述抗體與DNA的分子數(shù)之比為I : 8 I : 16。所述納米金顆粒由還原劑還原氯金酸制得。所述納米金探針的DNA通過金硫鍵與納米金顆粒連接。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種納米金探針，包含抗體、DNA、納米金顆粒，所述抗體和DNA通過納米金顆粒相連接。 所述抗體與DNA的分子數(shù)之比為I : 5 I : 20。優(yōu)選的，所述抗體與DNA的分子數(shù)之比為I : 8 I : 16。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種包含上述納米金探針的微量蛋白檢測試劑盒。本發(fā)明的微量蛋白檢測方法，是基于磁珠、納米金探針和滾環(huán)擴(kuò)增的蛋白檢測方法，該方法使DNA分子與抗原的比例從原先的I : I提高到50 : I至100 : 1，多了一級(jí)信號(hào)放大，提高了靈敏度；也使DNA與抗體的連接更簡便，無須化學(xué)試劑處理，減少對(duì)環(huán)境的污染。


下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。圖I是本發(fā)明納米金探針的制備流程示意圖；圖2是本發(fā)明蛋白檢測流程示意圖；圖3是本發(fā)明實(shí)施例I的流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式為了提高微量蛋白檢測的靈敏度，本發(fā)明方法將抗體標(biāo)記的磁珠、納米金探針和滾環(huán)擴(kuò)增相結(jié)合，其中使用的納米金探針是抗體與DNA通過納米金顆粒連接的探針，且連接在納米金顆粒上的抗體與DNA的分子數(shù)之比為I : 5 I : 20，該納米金探針取代了現(xiàn)有免疫RCA中抗體與DNA直接I : I連接的方法，使檢測信號(hào)明顯放大，顯著提高了微量蛋白檢測的靈敏度。本發(fā)明微量蛋白檢測方法，包括以下步驟將抗待測蛋白的抗體標(biāo)記到磁珠表面，制成抗體標(biāo)記的磁珠；將納米金顆粒與抗待測蛋白的抗體、DNA連接，制成抗體與DNA通過納米金顆粒相連接的納米金探針(見圖I)，其中，納米金顆粒的直徑為10 30納米，抗體與DNA的分子數(shù)之比為I : 5 I : 20，DNA通過金硫鍵與納米金顆粒連接；將抗體標(biāo)記的磁珠與待測蛋白樣品混合，用磁鐵吸附該抗體標(biāo)記的磁珠，使待測蛋白得到分離和富集；加入納米金探針，該探針與所述分離和富集的待測蛋白結(jié)合；加入環(huán)形DNA模板、滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)組分及熒光標(biāo)記探針，進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)；
檢測熒光信號(hào)，得待測蛋白的檢測結(jié)果(見圖2)。本發(fā)明微量蛋白檢測方法的具體步驟如下I.磁珠標(biāo)記按照所購買磁珠的說明書，將針對(duì)待測蛋白的抗體標(biāo)記到磁珠表面。2.納米金探針制備用檸檬酸鈉還原四氯金酸法制備直徑為10 20納米的納米金顆粒，將納米金的pH調(diào)至9 9. 5，再加入能使納米金穩(wěn)定的最少量抗體，室溫孵育30分鐘后加入一定量的巰基修飾的DNA，10度孵育4分鐘，加入IOOmM磷酸鈉緩沖液(pH7. O)至磷酸鹽終濃度9mM，室溫振蕩30分鐘，然后放置3小時(shí)以上；加入高鹽緩沖液(IOmM磷酸鹽緩沖液(pH7. O)，2M
氯化鈉)至氯化鈉終濃度150mM，室溫放置I小時(shí)，4度10000 Xg離心15分鐘，用洗液(IOmM磷酸鹽緩沖液(PH7. 4)，150mM氯化鈉)洗3次；最后加200微升洗液，4度保存。3.微量蛋白檢測取一定量的抗體標(biāo)記的磁珠用100微升洗液重懸，加入100微升待測血清樣品，室溫振蕩I. 5小時(shí)，用磁鐵吸附磁珠，棄上清，用洗液洗兩次，加入49微升洗液和I微升納米金探針，室溫振蕩I小時(shí)，用洗液洗兩次，加入環(huán)形模板孵育30分鐘，用洗液洗兩次，加入φ29 DNA聚合酶、配套的緩沖液、dNTP，30度反應(yīng)I. 5小時(shí)，最后進(jìn)行檢測。實(shí)施例II.磁珠標(biāo)記取100 微升 Dynabeads M-280 Tosylactivated (Invitrogen 公司)，按照說明書，加入60微克抗乙肝表面抗原單抗進(jìn)行標(biāo)記，最后重懸到I毫升說明書推薦的緩沖液，4度保存。2.納米金顆粒的制備在一個(gè)回流裝置中加熱250毫升ImM四氯金酸至110度以上，然后加入25毫升38. SmM檸檬酸鈉，再加熱15分鐘，冷卻至室溫，4度保存，制備的納米金顆粒平均直徑為13納米。3.納米金探針制備取I毫升納米金，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至9. 2，加入8微克抗乙肝表面抗原多抗，室溫孵育30分鐘后加入Inmol的巰基修飾的DNA，10度孵育4分鐘，加入110毫升IOOmM磷酸鈉緩沖液(PH7. O)，室溫每分鐘1000轉(zhuǎn)振蕩30分鐘，然后放置3小時(shí)；加入99微升高鹽緩沖液(IOmM磷酸鹽緩沖液(ρΗ7· O)，2Μ氯化鈉)，室溫放置I小時(shí)，4度10000 X g離心15分鐘，用I毫升洗液(IOmM磷酸鹽緩沖液(pH7. 4)，150mM氯化鈉)洗3次；最后加200微升洗液，4度保存。4.微量乙肝表面抗原檢測乙肝表面抗原用血清稀釋成10ng/mL、lng/mL、100pg/mL、10pg/mL 和 lpg/mL。取 5微升抗體標(biāo)記的磁珠，用100微升洗液重懸，加入100微升待測血清標(biāo)準(zhǔn)樣品，室溫每分鐘1000轉(zhuǎn)振蕩I. 5小時(shí)，用磁鐵吸附磁珠，棄上清，用200微升洗液洗兩次，加入49微升洗液和I微升納米金探針，室溫振蕩每分鐘1000轉(zhuǎn)I小時(shí)，用200微升洗液洗兩次，加入IOpmol環(huán)形模板(溶于50微升洗液)，孵育30分鐘，用200微升洗液洗兩次，加入50微升反應(yīng)體系，包括 10 單位 φ29 DNA 聚合酶(Fermentas 公司)、1Χ 緩沖液、O. 2mM dNTP.O. 2μΜ Cy3標(biāo)記的探針，30度反應(yīng)I. 5小時(shí)；經(jīng)重懸后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，結(jié)果見錯(cuò)誤！未找到引用源。。檢測極限可以達(dá)到10pg/mL，是常規(guī)ELISA靈敏度的100倍，且線性關(guān)系較好。以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能 因此而理解為對(duì)本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。
權(quán)利要求
1.一種微量蛋白檢測方法，其特征在于，包括以下步驟 將抗待測蛋白的抗體標(biāo)記到磁珠表面，制成抗體標(biāo)記的磁珠； 將納米金顆粒與抗待測蛋白的抗體、DNA連接,制成抗體與DNA通過納米金顆粒相連接的納米金探針； 將抗體標(biāo)記的磁珠與待測蛋白樣品混合，用磁鐵吸附該抗體標(biāo)記的磁珠，使待測蛋白得到分離和富集； 加入納米金探針，該探針與所述分離和富集的待測蛋白結(jié)合； 加入環(huán)形DNA模板、滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)組分及熒光標(biāo)記探針，進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)； 檢測熒光信號(hào)，得待測蛋白的檢測結(jié)果。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的微量蛋白檢測方法，其特征在于，所述連接抗體與DNA的納米金顆粒的直徑為10 30納米。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的微量蛋白檢測方法，其特征在于，所述納米金探針的抗體與DNA的分子數(shù)之比為I : 5 I : 20。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的微量蛋白檢測方法，其特征在于，所述納米金顆粒由還原劑還原氯金酸制得。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的微量蛋白檢測方法，其特征在于，所述納米金探針的DNA通過金硫鍵與納米金顆粒連接。
6.—種納米金探針,其特征在于,包含抗體、DNA、納米金顆粒,所述抗體和DNA通過納米金顆粒相連接。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的納米金探針，其特征在于，所述抗體與DNA的分子數(shù)之比為I: 5 I : 20。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的納米金探針，其特征在于，所述抗體與DNA的分子數(shù)之比為I: 8 I : 16。
9.一種微量蛋白檢測試劑盒，其特征在于，包含權(quán)利要求6所述的納米金探針。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種微量蛋白檢測方法，包括以下步驟制備抗體標(biāo)記的磁珠；制備抗體與DNA通過納米金顆粒相連接的納米金探針；將抗體標(biāo)記的磁珠與待測蛋白樣品混合，用磁鐵吸附磁珠，使待測蛋白得到分離和富集；加入納米金探針，該探針與所述分離和富集的待測蛋白結(jié)合；加入環(huán)形DNA模板、滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)組分及熒光標(biāo)記探針，進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)；檢測熒光信號(hào)。本發(fā)明的微量蛋白檢測方法，顯著提高了靈敏度，降低了蛋白與DNA連接的難度，適用于醫(yī)學(xué)檢測。
文檔編號(hào)G01N33/532GK102879580SQ20111019335
公開日2013年1月16日 申請(qǐng)日期2011年7月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月11日
發(fā)明者張捷 申請(qǐng)人:上海生物芯片有限公司