一種hpv-e6蛋白的檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種HPV-E6蛋白的檢測方法，包括配制HPV-E6蛋白反應(yīng)劑、配制抗HPV-E6蛋白抗體試劑，將反應(yīng)劑與抗體試劑混合和與恒定值校準(zhǔn)液比較吸光值，計(jì)算出樣本中HPV-E6蛋白含量。本發(fā)明中樣本無需稀釋、操作簡單、準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好、抗干擾能力強(qiáng)、適用于各種類型的全自動(dòng)生化分析儀的特點(diǎn)。
【專利說明】—種HPV-E6蛋白的檢測方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種HPV-E6蛋白的檢測方法。

【背景技術(shù)】
[0002]HPV病毒(人乳頭瘤病毒縮寫)是一種屬于乳多空病毒科的乳頭瘤空泡病毒A屬，是球形DNA病毒，能引起人體皮膚黏膜的鱗狀上皮增殖。目前已分離出130多種，該病毒只侵犯人類，對其它動(dòng)物無致病性，人體一旦感染會(huì)終生攜帶。不同的型別引起不同的臨床表現(xiàn)，約35種型別與生殖道感染有關(guān)，大約20種型別與癌癥相關(guān)，與宮頸癌相關(guān)的高危HPV有 13 種:16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，68 ;其中 16 和 18 比較常見。HPV-E6 蛋白就是16和18型特異性表達(dá)的蛋白，被用來檢測人體是否感染HPV高致癌型的早期診斷指標(biāo)。
[0003]已知測定HPV-E6蛋白的方法有免疫擴(kuò)散法、免疫電泳法、放射免疫分析法。這些方法都存在操作繁瑣，需要特殊的設(shè)備，樣品需要預(yù)處理，不能進(jìn)行批量樣本分析和不能直接上全自動(dòng)化生化分析儀檢測等缺點(diǎn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]發(fā)明目的:本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種HPV-E6蛋白的檢測方法。
[0005]技術(shù)方案:為了達(dá)到上述發(fā)明目的，本發(fā)明具體是這樣來完成的:一種HPV-E6蛋白的檢測方法，包括以下步驟:
[0006](I)配制HPV-E6蛋白反應(yīng)劑:取5-200mmol/L緩沖液，以其作為基數(shù)，加入其重量
0.1%-5%防腐劑、0.1%-1%穩(wěn)定劑、0.1%-40%電解質(zhì)氯化鈉和20%-40%高分子加速劑混合；
[0007](2)配制抗HPV-E6蛋白抗體試劑:取抗HPV-E6蛋白抗體，以其為基數(shù)，加入其重量0.001%-5%的抗氧化劑和20%-40%的穩(wěn)定劑混合；
[0008](3)將HPV-E6蛋白反應(yīng)劑與抗HPV-E6蛋白抗體試劑按體積比3?100:1混合；
[0009](4)配制一提血清型恒定值校準(zhǔn)液:取濃度為20?100mmol/L的緩沖液50?100ml，加入其體積I?5%的防腐劑，5?20%的穩(wěn)定劑，防腐劑濃度為0.01?10mmol/L,穩(wěn)定劑濃度為0.1?40mmol/L ；
[0010](5)在340nm波長下測定步驟(3)所得混合液的吸光值，與步驟(4)的恒定標(biāo)準(zhǔn)液比較，計(jì)算出樣本中HPV-E6蛋白含量。
[0011]其中，上述步驟(I)中另加入緩沖液重量基數(shù)0.1%_10%表面活性劑和2%?8%反應(yīng)促進(jìn)劑；其中表面活性劑為非離子表面活性劑、陽離子表面活性劑、陰離子表面活性劑或兩性離子表面活性劑，反應(yīng)促進(jìn)劑為溴化己二甲胺，濃度為0.01-19mmol/L。
[0012]其中，所述步驟(I)中的緩沖液為磷酸鹽緩沖液、三羥甲基氨基甲烷緩沖液，PIPES緩沖液、HEPES緩沖液、TAPS緩沖液、甘氨酸緩沖液或硼酸緩沖液，優(yōu)選pH值為5?10的磷酸鹽緩沖液，更優(yōu)選的為PH值為7.4?8.1的磷酸鹽緩沖液。
[0013]其中，所述步驟(I)和(4)中的防腐劑為疊氮鈉、對羥基苯甲酸、苯酚或廣譜殺菌劑。
[0014]其中，所述步驟(I)和(2)中的穩(wěn)定劑為氯化鎂、乙二醇或海藻糖。
[0015]其中，所述步驟(I)中的高分子加速劑為聚乙二醇2000、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000或聚乙二醇8000。
[0016]其中，所述步驟(2)中的抗氧化劑為丁基羥基茴香醚、硫代二丙酸二月桂酯、二丁羥基甲醛或苯多酚。
[0017]其中，所述步驟(2)中的抗HPV-E6蛋白抗體為羊抗人HPV-E6蛋白抗血清、馬抗人HPV-E6蛋白抗血清、鼠抗人HPV-E6蛋白抗血清或兔抗人HPV-E6蛋白抗血清。
[0018]其中，所述步驟(4)中的緩沖液為PBS、Tris、TAPS、HEPPS, CHES, CAPS、CAPSO,P0PS0、Trice、甘氨酸、雙甘氨酸、二甘氨酸或硼酸鹽。
[0019]其中，所述步驟(4)中的穩(wěn)定劑的實(shí)例可以是乙二胺四乙酸二鈉、氯化鎂、丙三醇、單糖、多糖中的一種或多種混合。
[0020]本發(fā)明利用抗原抗體反應(yīng)，加入反應(yīng)劑，解除樣品抗原周圍的電子層和水化層，使抗原位點(diǎn)充分暴露，然后加入抗HPV-E6蛋白抗體試劑；高特異性的抗HPV-E6蛋白與樣品中相應(yīng)的HPV-E6蛋白抗原反應(yīng)，形成不溶性的抗原抗體復(fù)合物，產(chǎn)生一定的濁度，其濁度的高低與樣本中HPV-E6蛋白含量成正比，在規(guī)定波長下測定該不溶物抗原-抗體復(fù)合物的吸光值，與已知恒定的標(biāo)準(zhǔn)液比較，則可計(jì)算出樣本中HPV-E6蛋白含量。
[0021]有益效果:本發(fā)明中樣本無需稀釋、操作簡單、準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好、抗干擾能力強(qiáng)、適用于各種類型的全自動(dòng)生化分析儀的特點(diǎn)。

【具體實(shí)施方式】
[0022]實(shí)施例1:
[0023]配制HPV-E6蛋白反應(yīng)劑:取50ml濃度為5mmol/L磷酸鹽緩沖液，以其作為基數(shù)，加入其重量0.1%疊氮鈉、0.1%%氯化鎂、0.1%電解質(zhì)氯化鈉和20%聚乙二醇2000混合；
[0024]配制抗HPV-E6蛋白抗體試劑:取20ml羊抗人HPV-E6蛋白抗血清，以其為基數(shù)，力口入其重量0.001%的丁基羥基茴香醚和20%的氯化鎂混合；
[0025]將HPV-E6蛋白反應(yīng)劑與抗HPV-E6蛋白抗體試劑按體積比3:1混合而成；
[0026]配制一提血清型恒定值校準(zhǔn)液:取濃度為20mmol/L的二甘氨酸50ml，加入其體積1%的疊氮鈉、濃度為0.01?10mmol/L,5%的乙二胺四乙酸二鈉、濃度為0.1?40mmol/L ；
[0027]在340nm波長下測定HPV-E6蛋白反應(yīng)劑與抗HPV-E6蛋白抗體試劑混合液的吸光值，與一提血清型恒定值校準(zhǔn)液比較，計(jì)算出樣本中HPV-E6蛋白含量。
[0028]實(shí)施例2:
[0029]配制HPV-E6蛋白反應(yīng)劑:取60ml濃度為40mmol/L三羥甲基氨基甲烷緩沖液，以其作為基數(shù)，加入其重量0.5%對羥基苯甲酸、0.3%乙二醇、5%電解質(zhì)氯化鈉和25%聚乙二醇4000混合，另加入緩沖液重量基數(shù)0.1%非離子表面活性劑和2%濃度為0.0lmmol/L溴化己二甲胺；
[0030]配制抗HPV-E6蛋白抗體試劑:取30ml馬抗人HPV-E6蛋白抗血清，以其為基數(shù)，力口入其重量1%的硫代二丙酸二月桂酯和25%的乙二醇混合；[0031 ] 將HPV-E6蛋白反應(yīng)劑與抗HPV-E6蛋白抗體試劑按體積比10:1混合而成；
[0032]配制一提血清型恒定值校準(zhǔn)液:取濃度為30mmol/L的雙甘氨酸60ml,加入其體積2%的對輕基苯甲酸、濃度為lmmol/L,8%的氯化鎂、濃度為5mmol/L ；
[0033]在340nm波長下測定HPV-E6蛋白反應(yīng)劑與抗HPV-E6蛋白抗體試劑混合液的吸光值，與一提血清型恒定值校準(zhǔn)液比較，計(jì)算出樣本中HPV-E6蛋白含量。
[0034]實(shí)施例3:
[0035]配制HPV-E6蛋白反應(yīng)劑:取70ml濃度為80mmol/LPIPES緩沖液，以其作為基數(shù)，加入其重量1%苯酚、0.5%海藻糖、10%電解質(zhì)氯化鈉和30%聚乙二醇6000混合；
[0036]配制抗HPV-E6蛋白抗體試劑:取40ml鼠抗人HPV-E6蛋白抗血清，以其為基數(shù)，力口入其重量2%的二丁羥基甲醛和30%的海藻糖混合；
[0037]將HPV-E6蛋白反應(yīng)劑與抗HPV-E6蛋白抗體試劑按體積比30:1混合而成；
[0038]配制一提血清型恒定值校準(zhǔn)液:取濃度為40mmol/L的甘氨酸70ml，加入其體積3%的苯酹、濃度為3mmol/L, 15%的丙三醇、濃度為10mmol/L ；
[0039]在340nm波長下測定HPV-E6蛋白反應(yīng)劑與抗HPV-E6蛋白抗體試劑混合液的吸光值，與一提血清型恒定值校準(zhǔn)液比較，計(jì)算出樣本中HPV-E6蛋白含量。
[0040]實(shí)施例4:
[0041]配制HPV-E6蛋白反應(yīng)劑:取80ml濃度為120mmol/LHEPES緩沖液，以其作為基數(shù)，加入其重量2%廣譜殺菌劑、0.7%氯化鎂、20%電解質(zhì)氯化鈉和35%聚乙二醇8000混合，另加入緩沖液重量基數(shù)5%陽離子表面活性劑和6%濃度為lOmmol/L溴化己二甲胺；
[0042]配制抗HPV-E6蛋白抗體試劑:取50ml兔抗人HPV-E6蛋白抗血清，以其為基數(shù)，力口入其重量3%的苯多酚和35%的氯化鎂混合；
[0043]將HPV-E6蛋白反應(yīng)劑與抗HPV-E6蛋白抗體試劑按體積比50:1混合而成；
[0044]配制一提血清型恒定值校準(zhǔn)液:取濃度為60mmol/L的PBS緩沖液80ml，加入其體積4%的廣譜殺菌劑、劑濃度為5mmol/L，18%的葡萄糖、濃度為20mmol/L ；
[0045]在340nm波長下測定HPV-E6蛋白反應(yīng)劑與抗HPV-E6蛋白抗體試劑混合液的吸光值，與一提血清型恒定值校準(zhǔn)液比較，計(jì)算出樣本中HPV-E6蛋白含量。
[0046]實(shí)施例5:
[0047]配制HPV-E6蛋白反應(yīng)劑:取90ml濃度為160mmol/LTAPS緩沖液，以其作為基數(shù)，加入其重量3%對羥基苯甲酸、0.8%、乙二醇、25%電解質(zhì)氯化鈉和40%聚乙二醇2000混合；
[0048]配制抗HPV-E6蛋白抗體試劑:取20ml羊抗人HPV-E6蛋白抗血清，以其為基數(shù)，力口入其重量4%的丁基羥基茴香醚和40%的乙二醇混合；
[0049]將HPV-E6蛋白反應(yīng)劑與抗HPV-E6蛋白抗體試劑按體積比60:1混合而成；
[0050]配制一提血清型恒定值校準(zhǔn)液:取濃度為80mmol/L的TAPS緩沖液100ml，加入其體積5%的對羥基苯甲酸、劑濃度為6mmol/L，20%的麥芽糖、濃度為30mmol/L ；
[0051 ] 在340nm波長下測定HPV-E6蛋白反應(yīng)劑與抗HPV-E6蛋白抗體試劑混合液的吸光值，與一提血清型恒定值校準(zhǔn)液比較，計(jì)算出樣本中HPV-E6蛋白含量。
[0052]實(shí)施例6:
[0053]配制HPV-E6蛋白反應(yīng)劑:取IOOml濃度為180mmol/L甘氨酸緩沖液，以其作為基數(shù)，加入其重量4%疊氮鈉、1%海藻糖、30%電解質(zhì)氯化鈉和20%聚乙二醇4000混合，另加入緩沖液重量基數(shù)10%陰離子表面活性劑和8%濃度為19mmol/L溴化己二甲胺；
[0054]配制抗HPV-E6蛋白抗體試劑:取30ml馬抗人HPV-E6蛋白抗血清，以其為基數(shù)，力口入其重量5%的硫代二丙酸二月桂酯和20%的海藻糖混合；
[0055]將HPV-E6蛋白反應(yīng)劑與抗HPV-E6蛋白抗體試劑按體積比80:1混合而成；
[0056]配制一提血清型恒定值校準(zhǔn)液:取濃度為lOOmmol/L的CAPS緩沖液50ml，加入其體積3%的疊氮鈉\濃度為8mmol/L，10%的乙二胺四乙酸二鈉、氯化鎂混合液、濃度為3Smmol/I,；
[0057]在340nm波長下測定HPV-E6蛋白反應(yīng)劑與抗HPV-E6蛋白抗體試劑混合液的吸光值，與一提血清型恒定值校準(zhǔn)液比較，計(jì)算出樣本中HPV-E6蛋白含量。
[0058]實(shí)施例7:
[0059]配制HPV-E6蛋白反應(yīng)劑:取80ml濃度為200mmol/L硼酸緩沖液，以其作為基數(shù)，加入其重量5%苯酚、1%氯化鎂、40%電解質(zhì)氯化鈉和40%聚乙二醇6000 ；
[0060]配制抗HPV-E6蛋白抗體試劑:取40ml鼠抗人HPV-E6蛋白抗血清，以其為基數(shù)，力口入其重量5%的二丁羥基甲醛和40%的氯化鎂混合；
[0061 ] 將HPV-E6蛋白反應(yīng)劑與抗HPV-E6蛋白抗體試劑按體積比100:1混合而成；
[0062]配制一提血清型恒定值校準(zhǔn)液:取濃度為100mmol/L的Trice緩沖液100ml，加入其體積5%的苯酚、濃度為lOmmol/L，20%的乙二胺四乙酸二鈉、氯化鎂、丙三醇混合液、濃度為 40mmol/L ；
[0063]在340nm波長下測定HPV-E6蛋白反應(yīng)劑與抗HPV-E6蛋白抗體試劑混合液的吸光值，與一提血清型恒定值校準(zhǔn)液比較，計(jì)算出樣本中HPV-E6蛋白含量。
【權(quán)利要求】
1.一種HPV-E6蛋白的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)配制HPV-E6蛋白反應(yīng)劑:取5-200mmol/L緩沖液，以其作為基數(shù)，加入其重量0.1%-5%防腐劑、0.1%-1%穩(wěn)定劑、0.1%-40%電解質(zhì)氯化鈉和20%-40%高分子加速劑混合； (2)配制抗HPV-E6蛋白抗體試劑:取抗HPV-E6蛋白抗體，以其為基數(shù)，加入其重量0.001%-5%的抗氧化劑和20%-40%的穩(wěn)定劑混合； (3)將HPV-E6蛋白反應(yīng)劑與抗HPV-E6蛋白抗體試劑按體積比3?100:1混合； (4)配制一提血清型恒定值校準(zhǔn)液:取濃度為20?10mmoI/L的緩沖液50?100ml，加入其體積I?5%的防腐劑,5?20%的穩(wěn)定劑，防腐劑濃度為0.01?10mmol/L,穩(wěn)定劑濃度為 0.1 ?40mmo1 /I,； (5)在340nm波長下測定步驟(3)所得混合液的吸光值，與步驟(4)的恒定標(biāo)準(zhǔn)液比較，計(jì)算出樣本中HPV-E6蛋白含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的HPV-E6蛋白的檢測方法，其特征在于，所述步驟(I)中另加入緩沖液重量基數(shù)0.1%_10%表面活性劑和2%?8%反應(yīng)促進(jìn)劑；其中表面活性劑為非離子表面活性劑、陽離子表面活性劑、陰離子表面活性劑或兩性離子表面活性劑，反應(yīng)促進(jìn)劑為溴化己二甲胺，濃度為0.01-19mmol/Lo
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的HPV-E6蛋白的檢測方法，其特征在于，所述步驟(I)中的緩沖液為磷酸鹽緩沖液、三羥甲基氨基甲烷緩沖液，PIPES緩沖液、HEPES緩沖液、TAPS緩沖液、甘氨酸緩沖液或硼酸緩沖液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的HPV-E6蛋白的檢測方法，其特征在于，所述步驟(I)和(4)中的防腐劑為疊氮鈉、對羥基苯甲酸、苯酚或廣譜殺菌劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的HPV-E6蛋白的檢測方法，其特征在于，所述步驟(I)和(2)中的穩(wěn)定劑為氯化鎂、乙二醇或海藻糖。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的HPV-E6蛋白的檢測方法，其特征在于，所述步驟(I)中的高分子加速劑為聚乙二醇2000、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000或聚乙二醇8000。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的HPV-E6蛋白的檢測方法，其特征在于，所述步驟(2)中的抗氧化劑為丁基羥基茴香醚、硫代二丙酸二月桂酯、二丁羥基甲醛或苯多酚。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的HPV-E6蛋白的檢測方法，其特征在于，所述步驟(2)中的抗HPV-E6蛋白抗體為羊抗人HPV-E6蛋白抗血清、馬抗人HPV-E6蛋白抗血清、鼠抗人HPV-E6蛋白抗血清或兔抗人HPV-E6蛋白抗血清。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的HPV-E6蛋白的檢測方法，其特征在于，所述步驟(4)中的緩沖液為 PBS、Tris、TAPS、HEPPS、CHES、CAPS、CAPSO、P0PS0、Trice、甘氨酸、雙甘氨酸、二甘氨酸或硼酸鹽。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的HPV-E6蛋白的檢測方法，其特征在于，所述步驟(4)中的穩(wěn)定劑的實(shí)例可以是乙二胺四乙酸二鈉、氯化鎂、丙三醇、單糖、多糖中的一種或多種混口 ο
【文檔編號】G01N33/68GK104076150SQ201310106698
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2013年3月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月28日
【發(fā)明者】沈萍萍, 張帥, 陳霆 申請人:沈萍萍, 張帥, 陳霆