轉(zhuǎn)基因蛋白cp4epsps的定量檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種定量檢測植物中轉(zhuǎn)基因蛋白CP4EPSPS的方法，其包括：從待檢植物中提取蛋白，得蛋白提取液；用抗CP4EPSPS蛋白的單克隆抗體包被酶標(biāo)板，封閉液封閉后，加入植物蛋白提取液，孵育，洗滌；加入HRP標(biāo)記的抗CP4EPSPS蛋白的多克隆抗體，孵育，洗滌；加入底物TMB溶液進(jìn)行顯色反應(yīng)；顯色結(jié)束后，用硫酸終止反應(yīng)并在450nm處檢測吸光度值；通過用CP4EPSPS蛋白標(biāo)準(zhǔn)品制作的濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算待檢樣品中的CP4EPSPS蛋白濃度。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因蛋白CP4EPSPS的定量檢測方法準(zhǔn)確、可靠，與已有技術(shù)相比操作時(shí)間短，成本低。
【專利說明】轉(zhuǎn)基因蛋白CP4EPSPS的定量檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因植物檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種轉(zhuǎn)基因蛋白CP4EPSPS的定量檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]自1996年孟山都(Monsato)公司上市第一例抗草甘膦大豆一來，轉(zhuǎn)基因作物的推廣應(yīng)用經(jīng)歷了 18年，抗除草劑性狀仍然是轉(zhuǎn)基因植物的首要性狀。CP4EPSPS被應(yīng)用于多種作物的轉(zhuǎn)基因研究中，包括玉米、大豆、棉花、油菜、甜菜和苜蓿等。
[0003]隨著各種各樣的轉(zhuǎn)基因食品通過貿(mào)易大量進(jìn)入國際市場，轉(zhuǎn)基因食品的安全性受到人們的日益關(guān)注，世界各國對轉(zhuǎn)基因食品的安全性存在著較大的爭議，歐盟、日本等地區(qū)已經(jīng)制定了相關(guān)法規(guī)對轉(zhuǎn)基因食品進(jìn)行了嚴(yán)格的管理。因此，檢測轉(zhuǎn)基因作物/植物中轉(zhuǎn)基因蛋白的定量技術(shù)逐漸成為研究熱點(diǎn)之一。
[0004]實(shí)時(shí)定量PCR最初是由Applied Biosystems公司于1996年開發(fā)的，自此,該方法被廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因DNA的測定。由于DNA相對而言較為脆弱，在加熱、存在核酸酶以及低PH值下均可能發(fā)生降解，而PCR方法學(xué)的可靠性又取決于DNA的完整性，因此，該方法存在一定的局限性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提出一種準(zhǔn)確、可靠的轉(zhuǎn)基因蛋白CP4EPSPS的定量檢測方法，以及基于該檢測方法的試劑盒。
[0006]為達(dá)此目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
[0007]第一方面，本發(fā)明提供了一種定量檢測植物中轉(zhuǎn)基因蛋白CP4EPSPS的方法，該方法包括:
[0008](I)從待檢植物中提取蛋白，得蛋白提取液；
[0009](2)用抗CP4EPSPS蛋白的單克隆抗體包被酶標(biāo)板，封閉液封閉后，加入步驟(I)所得植物蛋白提取液，孵育，洗滌；
[0010](3)加入HRP標(biāo)記的抗CP4EPSPS蛋白的多克隆抗體，孵育，洗滌；
[0011 ] (4)加入底物TMB溶液進(jìn)行顯色反應(yīng)；
[0012](5)顯色結(jié)束后,用硫酸終止反應(yīng)并在450nm處檢測吸光度值；
[0013](6)通過用CP4EPSPS蛋白標(biāo)準(zhǔn)品制作的濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算待檢樣品中的CP4EPSPS蛋白濃度。
[0014]作為優(yōu)選，步驟(2)中，所述抗CP4EPSPS蛋白的單克隆抗體為鼠抗CP4EPSPS單克隆抗體；
[0015]優(yōu)選地，所述包被在包被緩沖液中進(jìn)行，所述包被緩沖液為碳酸鹽緩沖液；進(jìn)一步優(yōu)選地，所述碳酸鹽緩沖液為Na2CO3-NaHCO3緩沖液，其濃度為0.1M，pH值為9.6 ；
[0016]優(yōu)選地，所述鼠抗CP4EPSPS單克隆抗體的包被濃度為1.8?2.2 μ g/ml、優(yōu)選1.9 ?2.I μ g/ml、更優(yōu)選 2 μ g/ml ；
[0017]優(yōu)選地，所述封閉液為含BSA的碳酸鹽緩沖液；
[0018]優(yōu)選地，加入植物蛋白提取液后的孵育溫度為22?26°C、優(yōu)選25°C，孵育時(shí)間為40?50分鐘、優(yōu)選45分鐘。
[0019]作為優(yōu)選，步驟(3)中，所述抗CP4EPSPS蛋白的多克隆抗體為兔抗CP4EPSPS多克隆抗體；
[0020]優(yōu)選地，所述抗CP4EPSPS的多克隆抗體的濃度為8?12 μ g/ml、優(yōu)選9?11 μ g/ml、更優(yōu)選 10 μ g/ml ；
[0021]優(yōu)選地，加入HRP標(biāo)記的抗CP4EPSPS蛋白的多克隆抗體后的孵育溫度為22?26°C、優(yōu)選25 °C，孵育時(shí)間為40?50分鐘、優(yōu)選45分鐘。
[0022]作為優(yōu)選，步驟(5)中，所述硫酸為1.8?2.2M、優(yōu)選1.9?2.1M、更優(yōu)選2M的硫酸。
[0023]第二方面，本發(fā)明提供了一種定量檢測植物中轉(zhuǎn)基因蛋白CP4EPSPS的試劑盒，其包括如下組分:
[0024](I)包被緩沖液，其為碳酸鹽緩沖液；
[0025](2)樣品稀釋液，其為磷酸鹽緩沖液；
[0026](3)洗滌液，其為含Tween-20的磷酸鹽緩沖液；
[0027](4)封閉液，其為含BSA的碳酸鹽緩沖液；
[0028](5)反應(yīng)終止液，其為H2SO4溶液；
[0029](6)鼠抗CP4EPSPS單克隆抗體；
[0030](7)辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的兔抗CP4EPSPS多克隆抗體；
[0031 ] (8) CP4EPSPS 標(biāo)準(zhǔn)品。
[0032]上述試劑盒中，作為優(yōu)選，所述碳酸鹽緩沖液為Na2CO3-NaHCO3緩沖液；
[0033]進(jìn)一步優(yōu)選地，Na2CO3-NaHCO3緩沖液的濃度為0.1M，pH值為9.6。
[0034]作為優(yōu)選，所述磷酸鹽緩沖液為PBS緩沖液。
[0035]作為優(yōu)選，所述洗滌液為含有體積百分含量為0.15?0.25 %、優(yōu)選0.18?
0.22%、更優(yōu)選0.2% Tween-20的磷酸鹽緩沖液。
[0036]作為優(yōu)選，所述反應(yīng)終止液為1.8?2.2M、優(yōu)選1.9?2.1M、更優(yōu)選2M的H2SO4溶液。
[0037]作為優(yōu)選，所述CP4EPSPS標(biāo)準(zhǔn)品為N端帶6個(gè)His標(biāo)簽的CP4EPSPS。
[0038]本發(fā)明提供的轉(zhuǎn)基因蛋白CP4EPSPS的定量檢測方法準(zhǔn)確、可靠，與已有技術(shù)相比操作時(shí)間短，成本低。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0039]圖1是使用本發(fā)明方法檢測CP4EPSPS的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0040]下文以示例性地方式對本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)地描述。
[0041]實(shí)施例1、本發(fā)明試劑盒的組裝:[0042]1、緩沖液的配制
[0043](I)包被緩沖液，0.1M碳酸鹽緩沖液CB，pH值為9.6 ;
[0044](2)稀釋液，0.01mM磷酸鹽緩沖液PBS，pH值為7.4 ；
[0045](3)洗滌液，含0.2 %吐溫-20的PBS ；
[0046](4)封閉液，含 I % BSA 的 CB ；
[0047](5)終止液，2M H2SO4 ;
[0048]2、酶標(biāo)板的制備
[0049](I)包被
[0050]移取一定量CP4EPSPS抗體于所需體積的包被液中，使其濃度約為2 μ g/mL,配置成包被工作液。將包被工作液按每孔100 μ L加入酶標(biāo)板微孔，4°C靜置過夜(注意要防止水分蒸發(fā))。
[0051](2)封閉
[0052]在CB緩沖液(pH9.6)中加入一定量的小牛血清，水楊酸鈉，蔗糖，使小牛血清，水楊酸鈉，蔗糖的濃度分別為10^,0.05^,5%,配置成封閉工作液。酶標(biāo)板以洗板機(jī)吸干-洗滌二次，將板條在潔凈的吸水紙上拍干。將封閉工作液按每孔150 μ L加入微孔，37°C烘焙3小時(shí)。
[0053](3)抽干密封
[0054]棄去封閉液，將板條在潔凈的吸水紙上拍干，放入冷凍真空干燥機(jī)抽干3小時(shí)，真空熱封。
[0055]3、CP4EPSPS標(biāo)準(zhǔn)品凍干粉的制備
[0056]大腸桿菌E.coli中原核表達(dá)并通過親和純化的His-EPSPS，N端帶有6個(gè)His標(biāo)簽，其母液濃度為3mg/ml，稀釋到900ng/ml，3mL棕色玻璃瓶加入100 μ L900ng/ml標(biāo)準(zhǔn)品，冷凍干燥機(jī)過夜抽干得到標(biāo)準(zhǔn)品凍干粉。
[0057]4、酶標(biāo)記抗體工作液的配置
[0058]酶標(biāo)抗體的制備:取純化的特異性兔多抗，與HRP進(jìn)行偶聯(lián)，得到酶標(biāo)記抗體。
[0059]取一定量的酶標(biāo)記抗體加入到稀釋液中，充分混勻，使其終濃度為2μ g/mL，2_8°C避光保存。
[0060]5、試劑盒的組裝
[0061]
【權(quán)利要求】
1.一種定量檢測植物中轉(zhuǎn)基因蛋白CP4EPSPS的方法，其特征在于，包括: (1)從待檢植物中提取蛋白，得蛋白提取液； (2)用抗CP4EPSPS蛋白的單克隆抗體包被酶標(biāo)板，封閉液封閉后，加入步驟(1)所得植物蛋白提取液，孵育，洗滌； (3)加入HRP標(biāo)記的抗CP4EPSPS蛋白的多克隆抗體，孵育，洗滌； (4)加入底物TMB溶液進(jìn)行顯色反應(yīng)； (5)顯色結(jié)束后,用硫酸終止反應(yīng)并在450nm處檢測吸光度值； (6)通過用CP4EPSPS蛋白標(biāo)準(zhǔn)品制作的濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算待檢樣品中的CP4EPSPS蛋白濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，所述抗CP4EPSPS蛋白的單克隆抗體為鼠抗CP4EPSPS單克隆抗體； 優(yōu)選地，所述包被在包被緩沖液中進(jìn)行，所述包被緩沖液為碳酸鹽緩沖液；進(jìn)一步優(yōu)選地，所述碳酸鹽緩沖液為Na2CO3-NaHCO3緩沖液，其濃度為0.1M，pH值為9.6 ； 優(yōu)選地，所述鼠抗CP4EPSPS單克隆抗體的包被濃度為1.8~2.2μ g/ml、優(yōu)選1.9~2.1 μ g/ml、更優(yōu)選 2 μ g/ml ； 優(yōu)選地，所述封閉液為含BSA的碳酸鹽緩沖液； 優(yōu)選地，加入植物蛋白提取液后的孵育溫度為22~26°C、優(yōu)選25°C，孵育時(shí)間為40~50分鐘、優(yōu)選45分鐘。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟(3)中，所述抗CP4EPSPS蛋白的多克隆抗體為兔抗CP4EPSPS多克隆抗體； 優(yōu)選地，所述抗CP4EPSPS的多克隆抗體的濃度為8~12 μ g/ml、優(yōu)選9~11 μ g/ml、更優(yōu)選10 μ g/ml ； 優(yōu)選地，加入HRP標(biāo)記的抗CP4EPSPS蛋白的多克隆抗體后的孵育溫度為22~26°C、優(yōu)選25°C,孵育時(shí)間為40~50分鐘、優(yōu)選45分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，步驟(5)中，所述硫酸為1.8~2.2M、優(yōu)選1.9~2.1M、更優(yōu)選2M的硫酸。
5.一種定量檢測植物中轉(zhuǎn)基因蛋白CP4EPSPS的試劑盒，其特征在于，包括如下組分: (1)包被緩沖液，其為碳酸鹽緩沖液； (2)樣品稀釋液，其為磷酸鹽緩沖液； (3)洗滌液，其為含Tween-20的磷酸鹽緩沖液； (4)封閉液，其為含BSA的碳酸鹽緩沖液； (5)反應(yīng)終止液，其為H2SO4溶液； (6)鼠抗CP4EPSPS單克隆抗體； (7)辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的兔抗CP4EPSPS多克隆抗體； (8)CP4EPSPS標(biāo)準(zhǔn)品。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述碳酸鹽緩沖液為Na2CO3-NaHCO3緩沖液； 優(yōu)選地，Na2CO3-NaHCO3緩沖液的濃度為0.1M，pH值為9.6。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的試劑盒，其特征在于，所述磷酸鹽緩沖液為PBS緩沖液。
8.根據(jù)權(quán)利要求5-7任一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于，所述洗滌液為含有體積百分含量為0.15~0.25%、優(yōu)選0.18~0.22%、更優(yōu)選0.2% Tween-20的磷酸鹽緩沖液。
9.根據(jù)權(quán)利要求5-8任一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于，所述反應(yīng)終止液為1.8~2.2M、優(yōu)選1.9~2.1M、更優(yōu)選2M的H2SO4溶液。
10.根據(jù)權(quán)利要求5-9任一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于，所述CP4EPSPS標(biāo)準(zhǔn)品為N端帶6個(gè)His標(biāo)簽的CP4EPSPS。
【文檔編號】G01N33/68GK104020296SQ201410253821
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年6月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月9日
【發(fā)明者】武愛波, 徐偉, 楊文杰, 宋麗敏, 王學(xué)武 申請人:無錫福陽生物科技有限公司