專利名稱：二甲氧基苯磺酰氯柱前衍生法分析胺基化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及胺基化合物的柱前衍生化方法，屬于分析化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
柱前衍生反相高效液相色譜法(RP-HPLC)是提高分析一些不含生色基團的胺基化合物如氨基酸等靈敏度的常用方法，目前已報道的用于柱前衍生氨基酸的試劑有很多， 但多少存在一些問題，如鄰苯二甲醛(OPA)只能與一級氨基酸發(fā)生反應(yīng)，不能檢測仲氨基酸，且衍生物不穩(wěn)定；異硫氰酸苯甲酯(PITC)衍生操作復(fù)雜，需要真空抽干衍生化后過量的溶劑；氯甲酸芴甲酯(FMOC-Cl)需要將反應(yīng)過程中剩余的衍生化試劑萃取出以終止衍生化反應(yīng)，衍生物易發(fā)生分解；丹酰氯(Dansyl-Cl)與包括亞氨基在內(nèi)的所有氨基酸均起反應(yīng)，影響定量；二硝基氟苯(FDNB)衍生化后生成干擾副產(chǎn)物，且需要通過抽干的方法除去反應(yīng)劑[牟世芬，于泓.氨基酸分析方法的研究進(jìn)展.[J]分析化學(xué)評述與進(jìn)展，2005， 3(33) :398-404]。二甲氧基苯磺酰氯(DMOSC)通常主要用于有機合成，未見有報道其用于柱前衍生化試劑，本發(fā)明對其進(jìn)行了有關(guān)的研究，并將其開發(fā)應(yīng)用為一新型衍生化試劑，以磺酰氯基(-SO2Cl)作為反應(yīng)基團，以苯環(huán)作為生色基團，以二甲氧基0，5_或2，4_或3， 4-或3，5-0Me)作為助色基團，提高氨基酸的分離檢測靈敏度。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是要提供一種衍生物靈敏度高，反應(yīng)條件溫和，操作簡單，能同時衍生一、二級胺基化合物，衍生產(chǎn)物穩(wěn)定，衍生化后無需除去過量試劑，分析時間短的DMOSC 柱前衍生化方法。本發(fā)明方法包括以下內(nèi)容胺基化合物的DMOSC柱前衍生化方法，其特征是將一級或二級或一級和二級胺基化合物樣品預(yù)處理后用PH8. 0 11. 5，濃度0. 05-0. 35M的硼砂緩沖溶液配成樣品濃度為 0. 001 1. Omg/mL的溶液，加入DMOSC的甲醇或乙醇或乙腈溶液，DMOSC與胺基化合物進(jìn)行衍生化反應(yīng)的摩爾比為3 8 1，混勻，在25 45°C條件下進(jìn)行衍生化反應(yīng)10 40min 后，于冰水浴冷卻，過濾進(jìn)樣至高效液相色譜儀，采用紫外檢測器測定胺基化合物衍生物的含量。所述的衍生化反應(yīng)的最佳溫度為30 35°C，最佳時間為10 15min。按常規(guī)方法進(jìn)行高效液相檢測，進(jìn)樣前先用0. 22 μ m膜進(jìn)行過濾。本發(fā)明具有衍生化反應(yīng)條件溫和，反應(yīng)時間短，靈敏度高，能同時衍生一、二級胺基化合物，無需除去衍生化后過量試劑，衍生化產(chǎn)物穩(wěn)定，室溫?zé)o避光的條件下能放置 25 60天。衍生化反應(yīng)溫度低，特別適合于生物樣品的分析。


圖1是甘氨酸柱前衍生化后高效液相色譜圖，1.衍生試劑水解物；2.甘氨酸衍生產(chǎn)物。
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圖2是混合氨基酸柱前衍生化后高效液相色譜圖，1.衍生試劑水解物；2. Glu ； 3. Thr ；4. Tyr ；5. Val ；6. Tyr ；7. Phe
具體實施例方式儀器與色譜條件Summit型Dionex (戴安)高效液相色譜儀，色譜系統(tǒng)由P680 HPLC泵、UVD-170U 可變波長紫外檢測器、8125型進(jìn)樣裝置和柱溫箱AT-330(天津奧特恩斯儀器有限公司) 組成。工作站美國戴安Chromeleon ；色譜條件十八烷基鍵合硅膠色譜柱規(guī)格為5 μ m， 250*4. 6mm ；流速0. 8 1. OmL/min ；柱溫25 35°C ；紫外檢測波長為220 240nm ；流動相甲醇、乙腈和磷酸鹽緩沖溶液(0. 02M 0. 05M，pH 5. 5 7. 5)體積比為10 5 85 20 50 30 ；進(jìn)樣量 20 μ L。實施例1實驗步驟用硼砂緩沖溶液(0. 35Μ，ρΗ 8. 1)配制濃度為0. 31mg/mL的草甘膦溶液，取該溶液ImL與0. 5mL濃度為3. 47mg/mL 2，5- 二甲氧基苯磺酰氯溶液(乙醇溶解)混合，在45°C 條件下進(jìn)行衍生化反應(yīng)IOmin后，于冰水浴冷卻，參照儀器與色譜條件，流動相甲醇、乙腈和磷酸鹽緩沖溶液(ρΗ = 5. 8,0. 05mol/L)體積比為15 5 80 ；流速1. OmL/min ；柱溫 25 0C ；檢測波長235nm。實施例2實驗步驟用硼砂緩沖溶液(0. 20M，ρΗΙΟ. 7)配制濃度為1. Omg/mL的甘氨酸溶液，取該溶液 3mL與1. 5mL濃度為18. 92mg/mL 2，5- 二甲氧基苯磺酰氯溶液(甲醇溶解)混合，在35°C 條件下進(jìn)行衍生化反應(yīng)15min后，于冰水浴冷卻，參照儀器與色譜條件，流動相甲醇、乙腈和磷酸鹽緩沖溶液(ρΗ = 5. 5,0. 02mol/L)體積比為20 10 70 ；流速1. OmL/min ；柱溫 30 0C ；檢測波長230nm。實施例3實驗步驟用硼砂緩沖溶液(0. 30M, ρΗ 10)配制濃度為0. 23mg/mL的脯氨酸溶液，取該溶液 ImL與0. 5mL濃度為4. 72mg/mL 2，5- 二甲氧基苯磺酰氯溶液(乙醇溶解)混合，在28 V 條件下進(jìn)行衍生化反應(yīng)15min后，于冰水浴冷卻，參照儀器與色譜條件，流動相甲醇、乙腈和磷酸鹽緩沖溶液(ρΗ = 6. 9,0. 02mol/L)體積比為18 15 67 ；流速0. 9mL/min ；柱溫 35 0C ；檢測波長220nm。實施例4實驗步驟用硼砂緩沖溶液(0. 10M，ρΗ 11. 2)配制濃度為0. 41mg/mL的蛋氨酸溶液，取該溶液ImL與0. 5mL濃度為7. 80mg/mL2, 5- 二甲氧基苯磺酰氯溶液(甲醇溶解)混合，在40°C 條件下進(jìn)行衍生化反應(yīng)20min后，于冰水浴冷卻，參照儀器與色譜條件，流動相甲醇、乙腈和磷酸鹽緩沖溶液(ρΗ = 6. 7,0. 03mol/L)體積比為18 5 77 ；流速1. OmL/min ；柱溫 30 0C ；檢測波長240nm。
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實施例5實驗步驟用硼砂緩沖溶液(0. 05M，pH 11. 5)配制濃度為0. 001mg/mL的色氨酸溶液，取該溶液ImL與0. 5mL濃度為0. 02mg/mL 3,4- 二甲氧基苯磺酰氯溶液(乙腈溶解)混合，在27°C 條件下進(jìn)行衍生化反應(yīng)25min后，于冰水浴冷卻，參照儀器與色譜條件，流動相甲醇、乙腈和磷酸鹽緩沖溶液(pH = 7. 5,0. 02mol/L)體積比為20 50 30 ；流速1. OmL/min ；柱溫 35 0C ；檢測波長235nm。實施例6實驗步驟用硼砂緩沖溶液(0. 18M，pH 9. 9)配制濃度為0. 16mg/mL的酪氨酸溶液，取該溶液ImL與0. 5mL濃度為2. 92mg/mL 3，5- 二甲氧基苯磺酰氯溶液(甲醇溶解)混合，在25 °C 條件下進(jìn)行衍生化反應(yīng)40min后，于冰水浴冷卻，參照儀器與色譜條件，流動相甲醇、乙腈和磷酸鹽緩沖溶液(pH = 7. 0,0. 02mol/L)體積比為10 25 65 ；流速0. 9mL/min ；柱溫 30 0C ；檢測波長225nm。實施例7實驗步驟用硼砂緩沖溶液(0. 05M，pH 10. 5)配制濃度為0. 28mg/mL的谷氨酸溶液，取該溶液ImL與0.5mL濃度為4.01mg/mL 3，5-二甲氧基苯磺酰氯溶液(乙腈溶解)混合，在34°C 條件下進(jìn)行衍生化反應(yīng)30min后，于冰水浴冷卻，參照儀器與色譜條件，流動相甲醇、乙腈和磷酸鹽緩沖溶液(pH = 6. 8,0. 04mol/L)體積比為12 20 68 ；流速1. OmL/min ；柱溫 25 0C ；檢測波長235nm。實施例8實驗步驟用硼砂緩沖溶液(0. 15M，pH 9. 8)配制濃度為0. 21mg/mL的賴氨酸溶液，取該溶液ImL與0. 5mL濃度為5. 43mg/mL 2,4- 二甲氧基苯磺酰氯溶液(乙醇溶解)混合，在32°C 條件下進(jìn)行衍生化反應(yīng)21min后，于冰水浴冷卻，參照儀器與色譜條件，流動相甲醇、乙腈和磷酸鹽緩沖溶液(pH = 7. 5,0. 02mol/L)體積比為20 50 30 ；流速0. 8mL/min ；柱溫 30 0C ；檢測波長230nm。實施例9實驗步驟用硼砂緩沖溶液(0. 25M，pH 9. 5)配制濃度為0. 12mg/mL的蘇氨酸溶液，取該溶液ImL與0. 5mL濃度為1. 91mg/mL2，4- 二甲氧基苯磺酰氯溶液(乙醇溶解)混合，在37°C 條件下進(jìn)行衍生化反應(yīng)ISmin后，于冰水浴冷卻，參照儀器與色譜條件，流動相甲醇、乙腈和磷酸鹽緩沖溶液(pH = 6. 5,0. 03mol/L)體積比為12 20 68 ；流速1. OmL/min ；柱溫 30 0C ；檢測波長240nm。實施例10實驗步驟用硼砂緩沖溶液(0. 20M，pH 10)配制總濃度為0. 31mg/mL的氨基酸(谷氨酸Glu， 蘇氨酸Ilir，酪氨酸Tyr，纈氨酸Val和苯丙氨酸Wie)混合溶液，取該溶液2mL與ImL濃度為5. 25mg/mL2，5-二甲氧基苯磺酰氯溶液(甲醇溶解)混合，在36°C條件下進(jìn)行衍生化反應(yīng)15min后，于冰水浴冷卻，參照儀器與色譜條件，以梯度洗脫10% A不變，流動相B比例變化8% (0-3min) ,6%^ 13% (3-8min), 13%^ 20% (8-llmin), 20 % ^ 25% (Il-Hmin)，25%—30% (14_19min)，C 磷酸鹽緩沖溶液(pH = 5. 8,0. 02mol/L)；流速 1. OmL/min ；柱溫 32 °C ；檢測波長 230nm。
權(quán)利要求
1.一種胺基化合物的柱前衍生化方法，其特征是將一級或二級或一級和二級胺基化合物樣品預(yù)處理后用PH8. 0 11. 5，濃度0. 05 0. 35M的硼砂緩沖溶液配成樣品溶液，加入衍生化試劑二甲氧基苯磺酰氯，或簡稱DM0SC，的甲醇或乙醇或乙腈溶液，混勻，在25 45°C條件下進(jìn)行衍生化反應(yīng)10 40min后，于冰水浴冷卻，再過濾進(jìn)樣至高效液相色譜儀， 采用紫外檢測器測定胺基化合物衍生物的含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胺基化合物的柱前衍生化方法，其特征是所述的二甲氧基苯磺酰氯試劑的反應(yīng)基團為磺酰氯基-SO2Cl,生色基團為苯環(huán)，助色基團二甲氧基為2，5_或 2,4-或 3，4_ 或 3，5-0Me。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胺基化合物的柱前衍生化方法，其特征是所述的一級或二級或一級和二級胺基化合物溶液樣品濃度范圍為0. 001 1. Omg/mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胺基化合物的柱前衍生化方法，其特征是所述的二甲氧基苯磺酰氯與胺基化合物進(jìn)行衍生化反應(yīng)的摩爾比為3 8 1。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胺基化合物的柱前衍生化方法，其特征是高效液相色譜條件為十八烷基鍵合硅膠色譜柱規(guī)格為5 μ m，250*4. 6mm;流速0.8 1. OmL/min ；柱溫 25 35°C ；紫外檢測波長為220 240nm ；流動相甲醇、乙腈和磷酸鹽緩沖溶液體積比為 10 5 85 20 50 30。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的胺基化合物的柱前衍生化方法，其特征是流動相磷酸鹽緩沖溶液濃度為0. 02M 0. 05M, pH值為5. 5 7. 5。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種分析胺基化合物的高效液相色譜柱前衍生化方法，屬于分析化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。其過程為將一級或二級或一級和二級胺基化合物樣品用pH8.0～11.5，濃度0.05～0.35M的硼砂緩沖溶液配成樣品溶液，加入二甲氧基苯磺酰氯的甲醇或乙醇或乙腈溶液，混勻，在25～45℃條件下進(jìn)行衍生化反應(yīng)10～40min后，于冰水浴冷卻，過濾進(jìn)樣全高效液相色譜儀，采用紫外檢測器對胺基化合物的衍生物進(jìn)行定量分析。本發(fā)明具有衍生反應(yīng)操作簡單，反應(yīng)時間短，靈敏度高，能同時衍生一、二級胺基化合物，衍生后無需除去過量試劑，衍生產(chǎn)物穩(wěn)定，衍生反應(yīng)溫度低，特別適合于生物樣品的分析。
文檔編號G01N30/06GK102288707SQ201110125478
公開日2011年12月21日 申請日期2011年5月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月16日
發(fā)明者劉曉寧, 方芳, 李壽椿, 魏榮卿 申請人:南京工業(yè)大學(xué)