專利名稱：一種利多卡因分子印跡固相萃取柱的制備及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物分析領(lǐng)域，具體地說(shuō)是涉及一種利多卡因分子印跡固相萃取 (MISPE)柱及制備方法，并主要用于生物樣品中利多卡因的高選擇性分離、富集和純化。
背景技術(shù)：
鹽酸利多卡因，簡(jiǎn)稱利多卡因，化學(xué)名為2- 二乙氨基-N- (2，6- 二甲基苯基)乙酰 胺鹽酸鹽一水合物，屬氨酰基酰胺類中效局麻藥，主要用于神經(jīng)及硬膜外阻滯麻醉。血中質(zhì) 量濃度超過(guò)5μ g/mL時(shí)，則出現(xiàn)毒性癥狀[臨床麻醉藥理學(xué)、北京人民衛(wèi)生出版社，2000 33]。由于生物樣品中許多內(nèi)源性物質(zhì)的存在，使得樣品凈化成為必要步驟。目前，生 物樣品中的鹽酸利多卡因前處理手段較多，如溶劑萃取和固相萃取法，結(jié)合毛細(xì)管電泳、氣 相色譜質(zhì)譜法或高效液相色譜法。溶劑萃取法需要大量的有機(jī)溶劑，耗時(shí)且存在嚴(yán)重的基 體干擾，其它方法的儀器昂貴。固相萃取法(SPE)出現(xiàn)于20世紀(jì)70年代，至今已成為許多 領(lǐng)域樣品預(yù)處理的常用方法。傳統(tǒng)的SPE吸附劑選擇性不佳，在富集分析物過(guò)程中存在大 量基體和干擾物質(zhì)。因此，發(fā)展快速、高效、高選擇性、環(huán)境友好的樣品前處理技術(shù)非常重 要[中國(guó)科學(xué)B輯化學(xué)，2009，39 (8) :733]。分子印跡聚合物(MIP)是為模板分子量身定 做的高分子聚合物，具有預(yù)定性、實(shí)用性和識(shí)別性等特點(diǎn)[Chemistry of Materials, 2008, 20(3) 859 ；Anal.Chem. ,2009,81(4) :1615]。由于模板選擇的多樣性，使得MIP能廣泛應(yīng) 用于物質(zhì)的分離與分析過(guò)程，它對(duì)于目標(biāo)物質(zhì)的高度選擇性也是普通SPE填料所不能比擬 的[分析化學(xué)，2007，35 (9) 1319 ；AnalyticalLetters, 2009,42 (3) :600]。目前關(guān)于利多 卡因MISPE柱的制備未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種利多卡因MISPE柱及制備方法 和應(yīng)用，以高效地選擇性分離富集血清、血漿等生物樣品提取液中的利多卡因，結(jié)合光度法 或高效液相色譜即可實(shí)現(xiàn)生物樣品中利多卡因的快速分析。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明以利 多卡因?yàn)槟０?，衣康酸為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑，以N，N-二甲基甲酰 胺為致孔劑，偶氮二乙丁腈為引發(fā)劑，進(jìn)行聚合制備出MIP后，填充在固相萃取柱內(nèi)得利多 卡因MISPE柱。儀器與試劑UV-2450紫外可見分光光度計(jì)、LC-10A高效液相色譜儀(日本島津公司)； Inertsil 0DS-SP (5 μ m，4. 6X 250mm) C18 色譜柱；HumanpowerIII 超純水處理器(韓國(guó))； HC-2518微量高速離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器)；5S1020固相萃取儀(北京振翔工貿(mào) 有限公司)。利多卡因(LD)、衣康酸(純度>98.0% ,Sigma-Aldrich公司)，鹽酸胺碘酮(AD)、 N，N- 二甲基苯胺(C。，純度> 98. 0%，杭州大陽(yáng)化工有限公司)，N, N- 二甲基甲酰胺(DMF，色譜純，天津光復(fù)精細(xì)化工研究所)，乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA，分析純，百靈威化學(xué)技 術(shù)有限公司)，偶氮二乙丁腈(AIBN，化學(xué)純，上海試劑廠)，N' - (2，6 二甲基苯基)-N，N-二 乙基乙二胺(C1,自制)，其它試劑均為分析純。
四

附圖1為利多卡因乙腈溶液在MIP與非印跡聚合物(NIP)上的吸附量隨濃度變化 曲線。附圖2為1. Omg/L利多卡因溶液HPLC圖2a為利多卡因標(biāo)準(zhǔn)品溶液；2b為利多卡 因血清提取液_未經(jīng)過(guò)MISPE柱；2c為利多卡因血清提取液-經(jīng)過(guò)MISPE柱。
五具體實(shí)施例方式A)將模板、功能單體、交聯(lián)劑、引發(fā)劑、致孔劑按lmmol :4mmol :16mmol 78. 5mg的 配比置于50mL圓底燒瓶中，充分溶解混勻，超聲脫氣5min，通氮?dú)?5min，于80°C恒溫油浴 鍋中加熱24h。B)將步驟Α)制備的聚合物磨碎成粉末，粉末過(guò)篩，收集粒徑在38 75 μ m的聚合 物，用索氏提取器以含冰乙酸-甲醇(1 9，V/V)溶液洗至無(wú)利多卡因檢出，繼續(xù)用甲醇洗 去乙酸，最后真空干燥至恒重，得利多卡因MIP顆粒。用HPLC評(píng)價(jià)多卡因MIP顆粒的選擇性。將洗滌過(guò)的MIP顆粒干法裝填于不銹鋼 色譜柱(50mmX 4. 6mm)中，以乙腈為流動(dòng)相，流速0. 4mL/min,色譜柱溫25°C，波長(zhǎng)262nm檢 測(cè)。以丙酮測(cè)量死時(shí)間。模板分子的乙腈溶液1.0g/L，每次進(jìn)樣10 μ L，結(jié)果表明制備的 MIP對(duì)利多卡因具有高的親和性和選擇性。表HPLC評(píng)價(jià)利多卡因MIP選擇性 AD 胺碘酮；C。N，N-二甲基苯胺；C1 - (2，6 二甲基苯基)-N，N-二乙基乙二胺C)稱取IOOmg上述利多卡因MIP顆粒，均勻填充至空的固相萃取柱中，在聚合物上 放置聚乙烯塞板，制得本發(fā)明的利多卡因MISPE柱。D)取空白牛血清0.3mL樣品，置具塞離心管中，精密加入1. Og/L利多卡因的水溶 液0. 3mL,渦旋混勻lmin，加入乙腈2. 4mL混勻，后于4000r/min離心30min除去蛋白質(zhì)，精 密量取上清液1. OmL作為生物樣品提取液。將MISPE柱用2mL乙腈活化后，加入上述提取液 l.OmL，用5%甲醇-乙腈ImL淋洗，5%鹽酸-甲醇ImL洗脫MISPE柱兩次，洗脫液于45°C 用N2吹干，用HPLC測(cè)定。HPLC測(cè)定條件甲醇:pH = 4.0 (40 60, ν/ν)為流動(dòng)相，流速為 1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm，柱溫為31. 9°C，20 μ L進(jìn)樣。
權(quán)利要求
一種利多卡因分子印跡固相萃取(MISPE)柱，其特征是固相萃取柱中填充有利多卡因分子印跡聚合物(MIP)顆粒。
2.如權(quán)利要求1所述的利多卡因MISPE柱，其特征在于上述利多卡因MIP顆粒大小為 38 75ym0
3.利多卡因MISPE柱的制備方法，其特征在于包括以下步驟Α)將利多卡因0. 2343g (Immol)、衣康酸0. 5204g (4mmol)、乙二醇二甲基丙烯酸酯 3. 1715g(16mmol)，偶氮二乙丁腈 0. 0785mg, N, N- 二甲基甲酰胺 3. 9262g 置于 50mL 圓底燒 瓶中，充分溶解混勻，超聲脫氣5min，通氮?dú)?5min，于80°C恒溫油浴鍋中加熱24小時(shí)，得到 塊狀聚合物。將塊狀聚合物用研缽磨碎，過(guò)篩收集得到粒徑在38 75 μ m,含有利多卡因的 MIP顆粒；B)將上述含有利多卡因的MIP顆粒，用索氏提取器以含冰乙酸-甲醇(1 9，V/V)溶 液洗至無(wú)LD檢出，繼續(xù)用甲醇洗去乙酸，再經(jīng)甲醇反復(fù)沉降，濾去甲醇，將獲得的顆粒物真 空干燥至恒重，即為利多卡因MIP顆粒；C)稱取IOOmg上述利多卡因MIP顆粒，均勻填充至空的固相萃取柱中，在聚合物上放置 塞板，制得利多卡因MISPE柱。
4.如權(quán)利要求1所述的利多卡因MISPE柱，其特征在于將上述利多卡因MIP顆粒填充 在聚丙烯固相萃取柱內(nèi)得利多卡因MISPE柱。
5.如權(quán)利要求1所述的利多卡因MISPE柱用途，其特征在于利用該利多卡因MISPE柱 分離富集生物樣品中的利多卡因。
6.如權(quán)利要求5所述的利多卡因MISPE柱的用途，其特征在于用該利多卡因MISPE柱 分離富集血清(或血漿)樣品利多卡因提取液，以乙腈為上樣溶劑、5%甲醇-乙腈為淋洗 劑、5%鹽酸-甲醇洗脫劑。
7.如權(quán)利要求6所述的利多卡因MISPE柱應(yīng)用于血清(或血漿)樣品利多卡因提取 液，其特征在于上述血清樣品利多卡因提取液制備方法是取空白牛血清0. 3mL樣品，置具 塞離心管中，精密加入1. Og/L利多卡因的水溶液0. 3mL，渦旋混勻lmin，加入乙腈2. 4mL混 勻，后于4000r/min離心30min除去蛋白質(zhì)，精密量取上清液1. OmL作為生物樣品提取液。全文摘要
本發(fā)明涉及吸附材料的制備及其在藥物分離、富集中的應(yīng)用，是一種利多卡因分子印跡聚合物和利多卡因分子印跡固相萃取柱的制備及其應(yīng)用。該分子印跡聚合物以利多卡因?yàn)槟０?，衣康酸為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑，N，N-二甲基甲酰胺為致孔劑，采用本體聚合法合成分子印跡聚合物，將分子印跡聚合物顆粒均勻填充于固相萃取柱內(nèi)，得到利多卡因分子印跡固相萃取柱。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了生物樣品中利多卡因的高效分離、富集與純化，與以往普通溶劑萃取法、C18固相萃取法等相關(guān)技術(shù)相比，選擇性高，并且利多卡因分子印跡固相萃取柱可以重復(fù)使用，成本低，可望成為生物樣品中利多卡因前處理的必備手段。
文檔編號(hào)G01N1/34GK101905150SQ20101022814
公開日2010年12月8日 申請(qǐng)日期2010年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月16日
發(fā)明者劉翠, 吐爾洪·買買提 申請(qǐng)人:新疆大學(xué)