固相上的分子網(wǎng)的制作方法
【專利說(shuō)明】固相上的分子網(wǎng)
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 本申請(qǐng)要求2013年3月14日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào)61/783, 189的權(quán)益，并 且是2012年3月22日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)13/511,364和2013年7月9日提交的 美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)13/938,055的部分繼續(xù)申請(qǐng)，以上申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用結(jié)合在 此。
【背景技術(shù)】
[0003] 存在的用于固相分析物捕獲、分析物檢測(cè)以及分析物測(cè)量的當(dāng)前策略使用吸附至 或共價(jià)鍵結(jié)至表面上的單層捕獲分子以用于直接實(shí)時(shí)感測(cè)，或者以間接檢測(cè)模態(tài)與二次檢 測(cè)步驟結(jié)合使用，這些策略在本領(lǐng)域中是眾所周知的。直接和間接方法都示出在靈敏度、特 異性、信噪比和/或成本上的局限性。
[0004] 存在對(duì)用于固相表面或裝置的分析物捕獲技術(shù)的需要，該技術(shù)可以在很少或沒(méi)有 樣品制備的情況下從復(fù)雜樣品中選擇性地捕獲分析物并且將所述選擇的分析物以最大化 捕獲分析物測(cè)量和/或檢測(cè)的方式定位，其方式為與大部分技術(shù)兼容。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 描述了用于捕獲分析物的裝置。在一個(gè)實(shí)施例中，一個(gè)裝置可以包括一個(gè)固相和 一個(gè)分子網(wǎng)，該分子網(wǎng)被聯(lián)接至該固相的表面的至少一部分上。該分子網(wǎng)可以包括至少一 種類型的多個(gè)捕獲分子，這些捕獲分子通過(guò)多種類型的多個(gè)連接分子彼此聯(lián)接，以便形成 一個(gè)共價(jià)連接的多層三維基體。這些捕獲分子可以被配置用于結(jié)合該分析物。
[0006] 還描述了一種制造用于捕獲分析物的裝置的方法。在一個(gè)實(shí)施例中，一種方法可 以包括提供一個(gè)固相，并且將一個(gè)分子網(wǎng)放置在該固相的表面的至少一部分上。該分子網(wǎng) 可以包括至少一種類型的多個(gè)捕獲分子，這些捕獲分子通過(guò)多種類型的多個(gè)連接分子彼此 聯(lián)接，以便形成一個(gè)共價(jià)連接的多層三維基體。這些捕獲分子可以被配置用于結(jié)合該分析 物。
[0007] 還描述了測(cè)量樣品中的分析物的量的方法。在一個(gè)實(shí)施例中，一種方法可以包括 提供一個(gè)或多個(gè)裝置，每個(gè)裝置包括一個(gè)固相和一個(gè)分子網(wǎng)，該分子網(wǎng)覆蓋該固相的表面 的至少一部分。該分子網(wǎng)可以包括至少一種類型的多個(gè)捕獲分子，這些捕獲分子通過(guò)多種 類型的多個(gè)連接分子彼此聯(lián)接，以便形成一個(gè)共價(jià)連接的多層三維基體。這些捕獲分子被 配置用于結(jié)合該分析物。該方法還包括將這些裝置暴露于該樣品，并且允許該分析物的至 少一部分結(jié)合這些裝置的分子網(wǎng)的捕獲分子。
【附圖說(shuō)明】
[0008] 圖1示出在IgG純化中傳統(tǒng)輒合微顆粒與分子網(wǎng)微顆粒的比較；
[0009] 圖2示出傳統(tǒng)捕獲分子與微顆粒的輒合以及相對(duì)應(yīng)的分析物測(cè)量能力；
[0010] 圖3示出分子網(wǎng)微顆粒在測(cè)量分析物中的有效性；
[0011] 圖4不出具有拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的分子網(wǎng)在測(cè)量分析物中的有效性；
[0012] 圖5示出在TauELISA中傳統(tǒng)輒合微顆粒與分子網(wǎng)微顆粒的比較；
[0013] 圖6示出在TSHLuminex夾心免疫測(cè)定中傳統(tǒng)輒合微顆粒與分子網(wǎng)微顆粒的比 較；
[0014] 圖7示出顆粒上的示例性分子網(wǎng)；
[0015] 圖8示出顆粒上的示例性分子網(wǎng)拓?fù)涮卣鳎?br>[0016] 圖9示出用于分析物遞送的示例性分子網(wǎng)。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 美國(guó)專利序列號(hào) 61/281，991、61/337, 257、61/340, 287、61/343, 467、61/410, 837、 61/489,646以及61/489, 648中已示出構(gòu)造和使用一個(gè)共價(jià)連接的偽隨機(jī)多層三維基體使 得能夠快速且特異性地捕獲來(lái)自未處理樣品的蛋白質(zhì)、核酸、碳水化合物、脂質(zhì)、細(xì)胞或者 其他分析物，并且示出使用這種分子網(wǎng)可能是對(duì)常規(guī)分析物結(jié)合方法的明顯改進(jìn)，這些專 利中的每一個(gè)通過(guò)引用結(jié)合在此。分子網(wǎng)的設(shè)計(jì)和制造
[0018] 分子網(wǎng)的特性可以通過(guò)以下賦予：選擇以供使用的捕獲分子（捕獲分子的實(shí)例可 以包括抗體、核酸探針、酶類、重組蛋白、肽以及其他）；所述捕獲分子賦予的所得特異性； 選擇的捕獲分子的大小和數(shù)量；捕獲分子在該或這些分子網(wǎng)層中的放置和間隔；捕獲分子 的組合；可以使用捕獲分子的順序；以及使用的捕獲分子與連接分子和間隔分子的比率。
[0019] 分子網(wǎng)的特性還可以通過(guò)以下賦予：選擇以供使用的連接分子（連接分子的實(shí)例 包括同雙功能的、異雙功能的、三功能的以及多功能的類型）；連接分子的化學(xué)特異性；連 接分子的埃長(zhǎng)度；連接分子的組合；可以使用連接分子的順序；以及使用的捕獲分子與連 接分子和間隔分子的比率。
[0020] 分子網(wǎng)的特性還可以通過(guò)以下賦予：選擇以供使用的間隔分子（間隔分子的實(shí)例 包括PEG、聚合物、核酸、白蛋白、Fc區(qū)、肽以及其他）；間隔分子的化學(xué)特性；間隔分子的 大小和數(shù)量；可以使用間隔分子的順序；以及使用的間隔分子與連接分子和捕獲分子的比 率。
[0021] 捕獲分子、連接分子以及間隔分子的放置和間隔可以：給予在分子網(wǎng)表面上的特 征拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)；給予在一個(gè)分子網(wǎng)的每個(gè)層中的特征密度；給予分子網(wǎng)的特征孔隙率；消除 空間限制和由此的空間位阻；改進(jìn)結(jié)合能力；減少非特異性結(jié)合；使得能夠結(jié)合多種形式 的分析物（例如，同時(shí)捕獲降解的分析物、完整分析物以及復(fù)合的分析物），以及其他。
[0022] 分子網(wǎng)中的孔隙可以是隨機(jī)的、偽隨機(jī)的、或者不規(guī)則散布的。分子網(wǎng)的孔隙可以 用于過(guò)濾樣品；可以用于通過(guò)大小排除來(lái)區(qū)分樣品中的結(jié)合勢(shì)分子；可以用于實(shí)現(xiàn)由于空 間位阻減少，大分子或細(xì)胞的結(jié)合、或者其他。分子網(wǎng)的孔隙包含多個(gè)捕獲分子、多個(gè)連接 分子，并且可以包含多個(gè)間隔分子。在固相上產(chǎn)生孔隙的傳統(tǒng)方法涉及對(duì)固相表面的機(jī)械 修飾，并且采用如激光刻蝕、層壓、平板印刷、激光打印或者其他的方法來(lái)在固體表面中產(chǎn) 生孔隙、孔、或者其他結(jié)構(gòu)。隨后制備這種固體表面以用于接收輒合捕獲分子。使用分子網(wǎng) 消除了對(duì)表面的機(jī)械修飾的需要，并且因此是更有成本效益的。此外，傳統(tǒng)方法仍受到高非 特異性結(jié)合的問(wèn)題的妨礙，并且需要結(jié)合至機(jī)械修飾的固相上的捕獲化學(xué)品，這不是一個(gè) 改進(jìn)。此外，與傳統(tǒng)捕獲形式相比，由于由分子網(wǎng)的每個(gè)層中建立的孔隙率給予的大小排除 特性，柔性可賦予至分子網(wǎng)中。在一些層中，孔隙直徑和深度可以是類似的或者可以根據(jù)應(yīng) 用而變化。在一些層中，孔隙大小可以改變，孔隙大小的變化可以取決于應(yīng)用。
[0023] 可以被賦予在一個(gè)分子網(wǎng)上的孔隙可以包括但是不限于皮孔、納米孔、微孔、濾 孔、篩孔、袋或者其他?？梢酝ㄟ^(guò)選擇特異性捕獲分子、連接分子以及間隔分子以及將它們 并入分子網(wǎng)的每個(gè)層中的方法來(lái)將孔隙賦予到分子網(wǎng)中。還可以通過(guò)選擇以及并入用于制 造連續(xù)層的特異性捕獲分子、連接分子以及間隔分子的方法來(lái)將孔隙賦予到分子網(wǎng)中。
[0024] 基于層中使用的捕獲分子、連接子以及間隔子的性質(zhì)，分子網(wǎng)孔隙的直徑范圍可 以從約6埃至大于約lum。在一些情況下，分子網(wǎng)的孔隙可以包括一個(gè)孔隙直徑范圍。示例 性直徑范圍可以是從約5nm至約50nm、從約10nm至約100nm、從約50nm至約200nm、從約 250nm至約500nm、從約500nm至約lum以及從約800nm至約1. 5um。
[0025] 在一些情況下，捕獲分子可以用于在分子網(wǎng)中產(chǎn)生孔隙。在這些實(shí)例中，可在將捕 獲分子并入分子網(wǎng)層之前，將捕獲分子預(yù)先連接至彼此。在一些情況下，可基于間隔臂的埃 長(zhǎng)度選擇連接子。在一些實(shí)例中，可以使用增充劑將一個(gè)第一連接子連接至一個(gè)第二連接 子上，以便產(chǎn)生一個(gè)長(zhǎng)的多功能連接子。在一些情況下，間隔子可以用于在分子網(wǎng)中產(chǎn)生孔 隙。也可在將間隔子并入分子網(wǎng)層之前，將間隔子預(yù)先連接至彼此。在其他實(shí)例中，惰性物 理插栓可以用于構(gòu)造孔隙，借此每個(gè)物理插栓可以被放置在一個(gè)先前構(gòu)造的層上，同時(shí)構(gòu) 建一個(gè)新的層。在固化后，可以移除這些物理插栓，因此留下特定直徑的孔隙。
[0026] 分子網(wǎng)的柔性性質(zhì)使得能夠使用多種類型的捕獲分子。在一些實(shí)例中，分子網(wǎng)包 括單一類型的捕獲分子。在其他實(shí)例中，分子網(wǎng)包括多種類型的捕獲分子。在一些實(shí)例中， 在分子網(wǎng)的制造過(guò)程中使用多于一種單克隆抗體使得所述分子網(wǎng)能夠結(jié)合分析物的多于 一個(gè)表位。多于一種類型的表位特異性捕獲分子的使用能夠?qū)崿F(xiàn)分子網(wǎng)分析物捕獲的改 進(jìn)，并且與該分子網(wǎng)的性能相關(guān)。在一些實(shí)例中，多于一種核酸序列的使用可以在制造過(guò)程 中用于產(chǎn)生能夠結(jié)合分析物的多于一個(gè)表位的分子網(wǎng)。有益的實(shí)例取決于分子網(wǎng)的使用， 并且可以包括當(dāng)用于測(cè)試中時(shí)，在檢測(cè)的最低水平、靈敏度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、對(duì)降 解樣品起作用的能力、對(duì)各種不同群體起作用的能力以及其他方面的改進(jìn)的性能；可以包 括當(dāng)用作純化工具時(shí)，在結(jié)合能力、純度、結(jié)合動(dòng)力學(xué)、目標(biāo)分析物耗盡以及其他方便的改 進(jìn)的性能；或者其他。
[0027] 在一些實(shí)例中，針對(duì)相互確認(rèn)的分析物的捕獲分子的使用可以被用在分子網(wǎng)中并 且與該分子網(wǎng)的性能相關(guān)。分子網(wǎng)中相互確認(rèn)的捕獲分子的使用可以以一種確認(rèn)的方式來(lái) 使用，借此多于一種分析物的捕獲可以提供統(tǒng)計(jì)上更顯著的陽(yáng)性結(jié)果；可以提供更穩(wěn)定的 測(cè)試結(jié)果；可以提供關(guān)于樣品的另外的信息；以及其他。分子網(wǎng)中相互確認(rèn)的捕獲分子的 使用還可以用于限定樣品，或者可以在測(cè)試中用作對(duì)照物，或者可以用于測(cè)量有關(guān)疾病狀 態(tài)的多于一個(gè)相關(guān)分子變量，或者可以用于測(cè)量有關(guān)疾病治療的多于一個(gè)相關(guān)分子變量。
[0028] 分子網(wǎng)可以被制造用于從樣品同時(shí)捕獲的相互確認(rèn)分析物的實(shí)例可以包括：基因 序列和相對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物（例如，在BRCA1和BRCA1蛋白中的癌癥相關(guān)SNP) ;mRNA和相對(duì) 應(yīng)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物（例如，人類乳糖酶mRNA和乳糖酶蛋白）；基因序列和相對(duì)應(yīng)的mRNA產(chǎn)物 (例如，LMNA中的疾病相關(guān)SNP以及預(yù)剪接的或剪接的核纖層蛋白A/CmRNA) ;miRNA和相 關(guān)的mRNA或者蛋白質(zhì)產(chǎn)物（miR9和REST、或者CoRESTmRNA、或者miR9和REST蛋白）；小 分子藥物和藥物靶標(biāo)（托法替尼和兩面神激酶）；表位特異性生物制劑和對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)（例 如抗-TNF抗體和循環(huán)TNF細(xì)胞因子）；表位特異性抗體、表位特異性T細(xì)胞和/或表位特 異性B細(xì)胞等（例如，抗-DNA自身抗體、抗-DNA⑶4+T細(xì)胞和/或抗-DNAB細(xì)胞）；或者 其他。有益的實(shí)例取決于使用并且可以與在測(cè)試靈敏度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、特異性、 疾病的診斷、對(duì)經(jīng)歷遺傳漂變的樣品起作用的能力、響應(yīng)于治療的測(cè)量能力、測(cè)量治療劑有 效性的能力、或者其他方面的改進(jìn)的性能相關(guān)。
[0029] 在一個(gè)實(shí)例中，分子網(wǎng)可以按捕獲和定位結(jié)合分析物的方式來(lái)制造，其方式為增 強(qiáng)可檢測(cè)信號(hào)的強(qiáng)度或者可以增強(qiáng)對(duì)結(jié)合分析物的檢測(cè)，如當(dāng)在利用光學(xué)檢測(cè)的測(cè)試中使 用時(shí)。通過(guò)預(yù)先定位的分層捕獲分子將捕獲的分析物以分層的方式放置能夠通過(guò)信號(hào)強(qiáng)化 來(lái)快速檢測(cè)分析物。通過(guò)分子網(wǎng)實(shí)現(xiàn)的信號(hào)強(qiáng)化的實(shí)例可以涉及熒光、熒光共振能量轉(zhuǎn)移、 吸光度、發(fā)光、光散射、表面等離子體共振、光外差檢測(cè)、或者其他。
[0030] 可以設(shè)計(jì)和制造所述分子網(wǎng)來(lái)替代對(duì)用于超靈敏檢測(cè)的昂貴又費(fèi)時(shí)的方法的需 求，這些方法如PCR、分支DNA、或信號(hào)放大所需的多步檢測(cè)方法。還可以設(shè)計(jì)和制造所述分 子網(wǎng)來(lái)替代對(duì)昂貴且復(fù)雜的分析裝置的需求。
[0031] 通常，并入三維分子網(wǎng)基體中的捕獲分子的數(shù)量小于或等于使用常規(guī)方法以二維