專利名稱：對甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌特異的抗體及將其用于甲氧西林抗性葡萄球菌的檢測方 ...的制作方法
對甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌特異的抗體及將其用于甲氧西林抗性葡萄球菌的檢測方法和試劑盒技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明提供了針對在金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的甲氧西林抗性株(MRSA)中特異性表達(dá)的蛋白質(zhì)的抗體，和用于檢測MRSA的方法和試劑盒，所述方法和試劑盒包括所述抗體，從而可從其他金黃色葡萄球菌株中快速且準(zhǔn)確地選擇性區(qū)分并檢測 MRSA。
背景技術(shù)：
金黃色葡萄球菌(S. aureus)是醫(yī)院感染和非醫(yī)院感染的最常見病原體之一。金黃色葡萄球菌S. aureus的代表類型包括甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌(MRSA)、甲氧西林抗性凝固酶陰性葡萄球菌(MR-CNQ、甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(MSSA)和甲氧西林敏感凝固酶陰性葡萄球菌(MS-CNS)。在這些細(xì)菌中，MRSA是最常見醫(yī)院細(xì)菌之一，感染免疫力弱的患者。然而，僅很少的抗菌藥物被開發(fā)，因此由該細(xì)菌引起的患者感染率非常高。
目前，MRSA感染可通過以下方法診斷(1)在培養(yǎng)的細(xì)菌上進(jìn)行抗生素敏感性測試，(2)從培養(yǎng)細(xì)菌菌落檢測MRSA特異的基因，和C3)從培養(yǎng)的細(xì)菌菌落中檢測MRSA特異的蛋白。雖然大部分醫(yī)院使用方法(1)，但是獲得測試結(jié)果至少需要2-3天。特別是對于小型醫(yī)院，通過觀察培養(yǎng)細(xì)菌中MRSA特異的蛋白檢測感染的方法很難進(jìn)行，因?yàn)樵摲椒赡茉傩枰硗庖惶旎騼商臁Ｒ虼?，?jīng)常不進(jìn)行診斷測試就使用抗生素。在實(shí)踐中，方法(2)和[3]對于普通診所太復(fù)雜而難以進(jìn)行，使得僅為研究目的而進(jìn)行這些方法。
以這些目前可獲得的方法，MRSA感染的檢測被延遲，經(jīng)常的情況是失去最佳的治療時(shí)間點(diǎn)或者施用了不合適的抗生素。因此，非常需要開發(fā)用于快速且準(zhǔn)確檢測MRSA的方法和試劑盒。


圖Ia至Ic顯示了，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，金黃色葡萄球菌的菌株中青霉素結(jié)合蛋白2a(下文稱作PBP2a)氨基酸序列的種間同源性。
圖2顯示了，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，含PBPh的細(xì)菌中多個(gè)PBPh蛋白的氨基酸同源性，目的是選擇金黃色葡萄球菌特異的序列。
圖3顯示了，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案，細(xì)菌表達(dá)的多肽的電泳結(jié)果，其中所述多肽通過使用PBPh特異性引物獲得。在所述凝膠上，M列分別顯示175kDa、83kDa、62kDa、 47. 5kDa、32.^kDa的分子量標(biāo)志。1列是前蛋白質(zhì)表達(dá)物，2列是37kDa His_PBP2a 表達(dá)，3列是純化后獲得的蛋白。
圖4顯示了，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，其中顯示His-PBPh特異性抗體形成的 ELISA分析結(jié)果，與His-凝固酶(陰性對照抗原)比較。
圖fe和恥顯示本發(fā)明的單克隆抗體展示的對His-PBPh的親和度。具體地，圖 5a是His-PBPh被稀釋并通過ELISA測定的曲線圖，而圖恥是本發(fā)明的單克隆抗體被稀釋并通過ELISA測定的曲線圖。
圖6的曲線圖顯示了，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，測定本發(fā)明的單克隆抗體展示的對蛋白質(zhì)A的親和性的ELISA結(jié)果。
圖7a和7b顯示使用本發(fā)明的單克隆抗體在MRSA、MSSA和MS-CNS中檢查的PBPh 的存在情況。具體地，圖7a是免疫印跡測定的結(jié)果，而圖7b是ELISA的結(jié)果。
圖fe是夾心ELISA的簡單操作思路。圖8b是(快速)側(cè)流免疫譜測定(lateral flow immunographic assay)的簡單操作思路。
圖9a至9c顯示了，PBPh抗原可以通過以下方式檢測從本發(fā)明的單克隆抗體制備包被抗體和檢測抗體對，并且使用這樣的抗體對。具體地，圖9a顯示了夾心ELISA的結(jié)果，其中與生物素結(jié)合的本發(fā)明的單克隆抗體被用作檢測抗體。圖9b顯示了夾心ELISA的結(jié)果，其中本發(fā)明的6G10單克隆抗體被用作檢測抗體，并且本發(fā)明的'9C6'單克隆抗體作為包被抗體。圖9c顯示了夾心ELISA結(jié)果，其中His-PBPh被連續(xù)稀釋。
圖IOa和IOb顯示了，MRSA可以通過使用本發(fā)明的單克隆抗體從其他金黃色葡萄球菌選擇性檢測。圖IOa是這樣的測試結(jié)果，即其中使用從本發(fā)明的單克隆抗體構(gòu)建的抗體對通過夾心ELISA測定從5株MRSA和1株MSSA收集的裂解物。圖IOb顯示了這樣的測試結(jié)果，即其中使用從本發(fā)明的單克隆抗體構(gòu)建的抗體對通過夾心ELISA檢查多個(gè)菌株中 PBP2a的存在情況。
圖11顯示了使用從本發(fā)明的單克隆抗體構(gòu)建的抗體對的側(cè)流免疫測定的結(jié)果。
圖12顯示了其中抗-蛋白質(zhì)A多克隆抗體被用于檢測蛋白質(zhì)A存在情況的夾心 ELISA結(jié)果。
圖13顯示了其中使用了抗-蛋白質(zhì)A多克隆抗體的側(cè)流免疫測定的結(jié)果。
圖14a至14e顯示了使用本發(fā)明的單克隆抗體和抗-蛋白質(zhì)A多克隆抗體的MRSA 的檢測結(jié)果。圖14a是夾心ELISA的結(jié)果，而圖14b至14e是側(cè)流免疫測定的結(jié)果。
具體實(shí)施方式
技術(shù)問題
認(rèn)識(shí)到以上所述的問題，本發(fā)明人研究了用于MRSA感染的檢測方法并提供了本發(fā)明，本發(fā)明通過使用PBPh特異性單克隆抗體和蛋白質(zhì)A特異性抗體能夠以快速且準(zhǔn)確的方式檢測MRSA。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種與包含青霉素結(jié)合蛋白2a(PBP2a)片段的多肽特異性結(jié)合的單克隆抗體，其中所述PBPh片段具有SEQ ID NO 1的氨基酸。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種產(chǎn)生所述單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，其中所述雜交瘤細(xì)胞的登記號為 KCLRF-BP-00202、KCLRF-BP-00203 或 KCLRF-BP-00204。
本發(fā)明的又另一個(gè)目的是提供一種用于MRSA檢測的方法，包括以下步驟使測試樣本與PBPh特異性抗體和蛋白質(zhì)A特異性抗體接觸；檢測抗原-抗體復(fù)合物的形成。
本發(fā)明的再另一個(gè)目的是提供一種用于MRSA檢測的試劑盒，所述試劑盒包含 PBP2a特異性抗體和蛋白質(zhì)A特異性抗體。
本發(fā)明的再另一個(gè)目的是提供一種用于MRSA檢測的組合物，所述組合物包含 PBP2a特異性抗體和蛋白質(zhì)A特異性抗體。
技術(shù)方案為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種與包含PBPh片段的多肽特異性結(jié)合的單克隆抗體。所述PBPh片段優(yōu)選具有SEQ ID NO :1的氨基酸序列。本發(fā)明還提供了一種產(chǎn)生所述單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。所述雜交瘤細(xì)胞的登記號為 KCLRF-BP-00202、KCLRF-BP-00203 或 KCLRF-BP-00204。本發(fā)明還提供一種用于MRSA檢測的方法，包括以下步驟使測試樣本與PBPh特異性抗體和蛋白質(zhì)A特異性抗體接觸；檢測抗原-抗體復(fù)合物的形成。本發(fā)明還提供一種用于甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌(MRSA)檢測的試劑盒，所述試劑盒包含PBPh特異性抗體和蛋白質(zhì)A特異性抗體。本發(fā)明還提供一種用于甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌(MRSA)檢測的組合物，所述組合物包含PBPh特異性抗體和蛋白質(zhì)A特異性抗體。以下是本發(fā)明的更詳細(xì)描述。對于本發(fā)明，術(shù)語“單克隆抗體”是指本發(fā)明所屬領(lǐng)域廣泛為人所知的單克隆抗體。單克隆抗體顯示高特異性，即對單個(gè)抗原位點(diǎn)特異(單一特異性的)。與包括不同抗體(每個(gè)抗體識(shí)別每個(gè)不同的表位)的多克隆抗體不同，單克隆抗體識(shí)別每個(gè)抗原的單個(gè)表位。本發(fā)明的單克隆抗體能夠通過常規(guī)克隆和細(xì)胞融合技術(shù)制備。例如，可通過將目標(biāo)免疫原(抗原)注射進(jìn)入野生小鼠或養(yǎng)殖小鼠(即BALB/c)制備天然單克隆抗體或人單克隆抗體。這樣的抗體可以被單獨(dú)注射或與佐劑結(jié)合注射，可以通過載體表達(dá)，或者可以以 DNA或融合蛋白的形式誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。融合蛋白可以是由免疫應(yīng)答誘導(dǎo)的肽偶聯(lián)的載體蛋白質(zhì)。這樣的載體蛋白質(zhì)的實(shí)例包括但不限于半乳糖苷酶、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、匙孔蟲威血藍(lán)蛋白(KLH)、牛血清白蛋白。在該情況下，肽作為運(yùn)載蛋白質(zhì)的半抗原發(fā)揮作用。下文簡單地提供了單克隆抗體的制備方法。將選出的動(dòng)物加強(qiáng)免疫之后，取出脾臟收集脾細(xì)胞。然后使用本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域已知的技術(shù)將脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合 [Kohler and Milstein,Nature 256 :495-497(1975) ；and Harlow and Lane,Antibodies A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,New York(1988)]。獲得雜交瘤細(xì)胞后，通過常規(guī)技術(shù)(例如，通過有限稀釋)進(jìn)行克隆，然后培養(yǎng)產(chǎn)生所需單克隆抗體的克隆。單克隆抗體提供以下益處提高利用抗原-抗體復(fù)合物的診斷和分析技術(shù)的選擇性和特異性。另一個(gè)益處是，這樣的單克隆抗體無污染，因?yàn)樗鼈兪峭ㄟ^雜交瘤培養(yǎng)生產(chǎn)的。對于本發(fā)明，術(shù)語“雜交瘤，，為本領(lǐng)域技術(shù)人員廣泛所知，是指由抗體產(chǎn)生細(xì)胞和無限增殖細(xì)胞融合產(chǎn)生的細(xì)胞。例如，雜交瘤可以是與骨髓瘤細(xì)胞融合產(chǎn)生的細(xì)胞。雜交瘤能夠持續(xù)提供抗體。對于本發(fā)明，術(shù)語“檢測標(biāo)簽”是指用于檢測免疫復(fù)合體的標(biāo)簽。這樣的檢測標(biāo)簽的實(shí)例包括但不限于放射性同位素、酶、化學(xué)發(fā)光化合物、熒光物質(zhì)(如熒光素)、藻膽蛋白、鑭系元素螯合物、羅丹明、酶輔因子和生物素。對于本發(fā)明，術(shù)語“測試樣本”是指任何生物材料，包括細(xì)胞、組織和生物流體 (biofluid) ο對于本發(fā)明，術(shù)語“抗原-抗體復(fù)合物”是指PBP2a(或蛋白質(zhì)Α)和識(shí)別所述 PBP2a(或蛋白質(zhì)A)的相應(yīng)抗原的復(fù)合物，因此所述復(fù)合物可以用于確定PBP2a(或蛋白質(zhì)A)在所給樣本中存在與否。
本發(fā)明的PBP^i特異性抗體可以是與包含具有SEQ ID NO :1的氨基酸的PBPh片段的多肽特異性結(jié)合的抗體，該片段在PBPh序列中顯示低程度的種間同源。所述PBP2a 特異性抗體優(yōu)選可以是單克隆抗體。
此外，所述具有SEQ ID NO 1的氨基酸的PBPh片段可以純化自所述MRSA株，或者可以通過使用載體以重組蛋白的形式制備。所述PBPh片段優(yōu)選可以通過使用EcoR I 和》!0 I作為限制性內(nèi)切酶進(jìn)行載體克隆而獲得。
所述多肽被構(gòu)建為包含對MRSA的PBPh特異的N末端區(qū)，這是通過在金黃色葡萄球菌多個(gè)株中同源分析PBPh發(fā)現(xiàn)的(參見實(shí)施例1-1)。
因此，本發(fā)明的抗體可以將所述多肽識(shí)別為抗原，從而檢測PBPh的存在情況。所述抗體優(yōu)選可以是單克隆抗體?？墒褂贸Ｒ?guī)抗體制備技術(shù)制備所述單克隆抗體。抗體優(yōu)選產(chǎn)生自選自雜交瘤KCLRF-BP-00202、KCLRF-BP-00203和KCLRF-BP-00204 (由保藏號表示) 的雜交瘤。所述雜交瘤于2009年2月18日保藏于韓國細(xì)胞系庫(Korean Cell LineBank) 0
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用PBPh特異性引物制備大量抗原(參見實(shí)施例1-2)。然后將所述抗原腹膜內(nèi)注射至小鼠。之后，對產(chǎn)生多克隆抗體的小鼠進(jìn)行選擇， 其中多克隆抗體顯示出針對PBP2a的最高抗體滴度，但對His-凝固酶(用作陰性對照)卻顯示出低度的親和性(參見實(shí)施例1- 。通過融合所述小鼠的脾臟細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞制備雜交瘤。從所述雜交瘤產(chǎn)生PBPh特異性單克隆抗體(參見實(shí)施例2)。
由于本發(fā)明的單克隆抗體表現(xiàn)出PBPh特異性識(shí)別，它們可以檢測MRSA和 MR-CNS,已知它們含有PBP2a。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，由ELISA證實(shí)了本發(fā)明的單克隆抗體具有PBPh抗原特異性(參見實(shí)施例3)。由免疫印跡測定或ELISA證實(shí)，本發(fā)明的單克隆抗體可以用于檢測MRSA (參見實(shí)施例4)。此外，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，從本發(fā)明的單克隆抗體中選擇單克隆抗體對，并且發(fā)現(xiàn)使用這樣的單克隆抗體對可以通過夾心ELISA或免疫色譜測定檢測MRSA (參見實(shí)施例5)。
本發(fā)明的單克隆抗體可以，但不限于，是與能夠產(chǎn)生可檢測信號的檢測標(biāo)簽結(jié)合的單克隆抗體。這樣的檢測標(biāo)簽可以是選自以下的一種或多種酶、熒光物質(zhì)、發(fā)光和放射性材料。更詳細(xì)地，檢測標(biāo)簽的實(shí)例包括多種酶、輔基、熒光材料、發(fā)光材料、生物發(fā)光材料和放射性材料。
所述檢測標(biāo)簽可直接地或通過偶聯(lián)物(即，本領(lǐng)域已知的連接物)間接地偶聯(lián)或結(jié)合至本發(fā)明的單克隆抗體。合適的酶的實(shí)例包括辣根過氧化物酶、乙酰膽堿酯酶、過氧化物酶、堿性磷酸酶、β -D-半乳糖苷酶、葡糖氧化酶、蘋果酸脫氫酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶和轉(zhuǎn)化酶。合適的輔基的實(shí)例包括鏈霉親和素/生物素和親和素/生物素。合適熒光材料的實(shí)例包括傘形酮、熒光素、異硫氰酸熒光素、羅丹明、二氯三嗪基胺熒光素、丹磺酰氯、 藻紅蛋白和藻膽蛋白。合適發(fā)光材料的實(shí)例包括魯米諾、異氨基苯二酰胼(isoluminol) 和光澤精。合適生物發(fā)光材料的實(shí)例包括螢光素酶、螢光素和水母蛋白。合適放射性材料的實(shí)例包括125I、131I、mIn、99TC、14C 和 3H。
待用于本發(fā)明的雜交瘤細(xì)胞系可以是登記號為KCLRF-BP-00202、KCLRF-BP-00203 或KCLRF-BP-00204的雜交瘤細(xì)胞。所述雜交瘤細(xì)胞系于2009年2月18日保藏于韓國細(xì)胞系庫。產(chǎn)生這樣的雜交瘤的技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員廣泛知曉，優(yōu)選通過抗體產(chǎn)生細(xì)胞和無限增殖細(xì)胞(例如，骨髓瘤細(xì)胞)融合制備雜交瘤。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，在雜交瘤中小鼠脾細(xì)胞和小鼠雜交瘤細(xì)胞融合，通過其證實(shí)可以產(chǎn)生PBPh特異性單克隆抗體(參見實(shí)施例2)。可以將本發(fā)明的MRSA檢測方法用于通過檢測抗原-抗體復(fù)合物的存在情況來檢測MRSA，在所述方法中使PBPh特異性抗體和蛋白質(zhì)A特異性抗體各自與測試樣本接觸。所述PBPh特異性抗體可以是與包含具有SEQ ID NO=I的氨基酸序列的PBPh片段的多肽特異性結(jié)合的抗體。所述與包含具有SEQ IDNO :1的氨基酸的PBPh片段的多肽特異性結(jié)合的PBPh特異性抗體是本發(fā)明的單克隆抗體。蛋白質(zhì)A是在金黃色葡萄球菌中特異性表達(dá)的蛋白，其在MRSA和MSSA中特異性表達(dá)，但不在MR-CNS或MS-CNS中表達(dá)。所述蛋白質(zhì)A特異性抗體可以，但不必須，是從以蛋白質(zhì)A免疫的雞中獲得的多克隆抗體。本發(fā)明的檢測方法能夠通過使用PBPh特異性抗體和蛋白質(zhì)A特異性抗體二者檢測MRSA。由于蛋白質(zhì)A存在于MRSA中，但不存在于MR-CNS中，所述兩菌株不能僅通過使用PBPh特異性抗體來區(qū)分，但可以通過使用PBPh特異性抗體和蛋白質(zhì)A特異性抗體二者輕易地區(qū)分。由于蛋白質(zhì)A對很多抗體中Fc區(qū)的親和性，通過使用抗體檢測蛋白質(zhì)A有困難。 然而，已知來自雞的抗-蛋白質(zhì)A抗體不表現(xiàn)這種對蛋白質(zhì)A的結(jié)合性質(zhì)(Larsson A， Sjoquist J. 1989 ；27 (12) :2856-7. J ClinMicrobiol.)。因此，抗-蛋白質(zhì) A 抗體通過用蛋白質(zhì)A免疫雞制備(參見實(shí)施例6-1)。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，證實(shí)了產(chǎn)生蛋白質(zhì)A的菌株MRSA和MSSA可以以如上制備的蛋白質(zhì)A特異性抗體通過夾心ELISA或免疫色譜測定檢測(參見實(shí)施例6-2和6_3)。因此，本發(fā)明的MRSA檢測方法⑴通過PBPh特異性抗體檢測PBP2a，⑵通過蛋白質(zhì)A特異性抗體檢測蛋白質(zhì)A，從而能夠特異性檢測MRSA，MRSA含有PBPh和蛋白質(zhì)A 二者。換言之，可得出這樣的結(jié)論，即當(dāng)在(1)和(2)兩項(xiàng)檢測中都觀察到陽性抗原-抗體反應(yīng)時(shí)，存在MRSA。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，通過如上所述的(1)和O)的抗原-抗體反應(yīng)檢測 MRSA的存在情況。參見實(shí)施例7。檢測所述抗原-抗體復(fù)合物存在情況的方法包括但不限于放射性免疫分析、 ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)、夾心免疫分析和側(cè)流免疫譜測定?？乖?抗體復(fù)合物的檢測涉及使用直接或間接標(biāo)記的抗體。上文描述了可用的檢測標(biāo)簽。所述方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員廣泛知曉的。例如，在ELISA的情況下，將測試樣本與本發(fā)明的單克隆抗體或蛋白質(zhì)A特異性抗體接觸，所述抗體包被在微量滴定板、膜、測試條等之上。在一個(gè)實(shí)施方案中，可用本發(fā)明的單克隆抗體或用蛋白質(zhì)A特異性抗體包被微量滴定板孔，并且用BSA封閉未占據(jù)的結(jié)合位點(diǎn)。用測試樣本孵育所述包被的孔，并對其檢查以確定抗原-抗體復(fù)合物的存在情況?？扇缟纤鰧⑺隹贵w標(biāo)記，用于檢測。具體地，如果使用夾心免疫分析和側(cè)流免疫譜測定，可以使用從本發(fā)明的單克隆抗體制備的抗體對進(jìn)行MRSA檢測。參見圖8。這樣的抗體對可以是利用本發(fā)明的單克隆抗體之一的任何抗體。優(yōu)選將從KCLRF-BP-00202雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體用作檢測抗體，將從KCLRF-BP-00203或KCLRF-BP-00204雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體用作包被抗體。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，通過選擇單克隆抗體對并利用所述單克隆抗體對， 可以通過夾心免疫分析和側(cè)流免疫譜測定實(shí)現(xiàn)MRSA檢測。具體地，進(jìn)行了 MRSA的有效檢測，其中從KCLRF-BP-00202雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體被用作檢測抗體，從KCLRF-BP-00203 或KCLRF-BP-00204雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體被用作包被抗體。參見實(shí)施例5。
本發(fā)明的MRSA檢測試劑盒包含PBPh特異性抗體和蛋白質(zhì)A特異性抗體。
所述PBPh特異性抗體可以是與包含具有SEQ ID NO=I的氨基酸的PBPh片段的多肽特異性結(jié)合的抗體。所述PBPh特異性抗體優(yōu)選是本發(fā)明的單克隆抗體。
可用于本發(fā)明的所述試劑盒系統(tǒng)可包含但不限于ELISA板、深插入裝置 (deep-stick device)、免疫色譜測定、徑向分隔免疫測定裝置、流過裝置(flow-through device)等。優(yōu)選可以使用以免疫色譜條或裝置形式提供的診斷試劑盒。在免疫色譜診斷中，測試血清中包含的抗原與結(jié)合至膠體金顆粒的微量抗體反應(yīng)。然后，當(dāng)通過毛細(xì)作用遷移通過硝酸纖維膜上的微孔時(shí)，所述抗原結(jié)合至捕獲抗體從而在所述條上出現(xiàn)顏色，使得通過肉眼可觀察到陽性和陰性信號。
這樣的試劑盒優(yōu)選使用ELISA或側(cè)流免疫譜測定。如前所述，當(dāng)使用夾心免疫測定和側(cè)流免疫譜測定時(shí)，使用本發(fā)明的單克隆抗體制備的抗體對可用于MRSA檢測。
可用于本發(fā)明的試劑盒可以是但不限于包含以下組分的試劑盒固相支持物；本發(fā)明的單克隆抗體和蛋白質(zhì)A特異性抗體；和ELISA反應(yīng)流體，其含有用于與抗原反應(yīng)的酶標(biāo)抗體溶液和用于發(fā)出酶反應(yīng)信號的染料試劑。更具體地，所述酶標(biāo)抗體溶液可以是山羊抗小鼠Ig-HRP (合適濃度下每孔50-150 μ 1)。所述染料試劑可選自四甲基聯(lián)苯胺(TMB)。 終止溶液可選自IN HCl和IN H2S04。
本發(fā)明的用于MRSA檢測的組合物包含PBPh特異性抗體和蛋白質(zhì)A特異性抗體。
所述PBPh特異性抗體可以是與包含具有SEQ ID NO=I的氨基酸的PBPh片段的多肽特異性結(jié)合的抗體。所述PBPh特異性抗體優(yōu)選可以是本發(fā)明的單克隆抗體。
除了所述PBPh特異性抗體和蛋白質(zhì)A特異性抗體外，所述組合物還可以包含用于免疫測定的載體、能夠產(chǎn)生可檢測信號的檢測標(biāo)簽、溶劑(resolvent)和清洗劑。此外， 在標(biāo)記物質(zhì)是酶的情況下，所述組合物還可包含底物和反應(yīng)終止劑。合適載體的實(shí)例包括但不限于，可溶載體，例如本領(lǐng)域已知的生理可接受的緩沖溶液(例如，PBS)；不可溶載體， 例如聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚酯、聚丙烯腈、氟樹脂、交聯(lián)葡聚糖、多糖、大分子(包括鋪在乳膠、紙、玻璃、金屬、瓊脂糖及其結(jié)合物上的金屬磁性微粒)。
如上所述，通過使用用于檢測PBPh的PBPh特異性抗體和使用用于檢測蛋白質(zhì)A 的蛋白質(zhì)A特異性抗體，本發(fā)明能夠快速且準(zhǔn)確地檢測含有PBPh*蛋白質(zhì)A 二者的MRSA。
參考以下實(shí)施例進(jìn)一步解釋本發(fā)明。但是，這些實(shí)施例不應(yīng)以任意方式解釋為限制本發(fā)明的范圍。
<實(shí)施例1>
制備對MRSA中PBPh特異的多克隆抗體
<1-1>確定PBP2a中的特異性位點(diǎn)
使用 SIB BLAST NetworkService(ExPASy Proteomics Server, http// au. expasy. orR/tools/blast/)來測量金黃色葡萄球菌PBP2a的種間同源性。結(jié)果顯示在圖1中。在圖Ia至Ic中，綠色表示高同源性，所有顯示綠色的部分都來自具有PBPh的細(xì) 。Mf 胃^"ΡΒΡ2ει 的SIB BLASTNetworkService (ExPASy Proteomics Server, http://au. expasy. org/tools/blast/)來確定顯示低同源性的序列組。如圖2中所示，N末端顯示低同源性，而C末端顯示相對高同源性。此外，在與轉(zhuǎn)肽酶功能有關(guān)的C末端部分，觀察到了相似PBP2a中的高度同源性。因此，N末端部分(SEQ ID No 1)被選作PBP^i蛋白質(zhì)中的MRSA特異性位點(diǎn)。PBPh的整個(gè)氨基酸序列在SEQ ID No 2中提供。<1-2>PBP2 抗原在表1所示的條件下，對從MRSA菌落提取的基因DNA進(jìn)行PCR。使用如下表2中的PBP^i特異性引物。表1 :PCR 條件
權(quán)利要求
1.一種與包含青霉素結(jié)合蛋白2a(PBP2a)片段的多肽特異性結(jié)合的單克隆抗體，其中所述PBPh片段具有SEQ ID NO 1的氨基酸序列。
2.權(quán)利要求1的單克隆抗體，其中所述單克隆抗體由登記號為KCLRF-BP-00202、 KCLRF-BP-00203 或 KCLRF-BP-00204 的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生。
3.一種雜交瘤細(xì)胞，所述雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生權(quán)利要求1的單克隆抗體，并且具有登記號 KCLRF-BP-00202、KCLRF-BP-00203 或 KCLRF-BP-00204。
4.一種用于檢測甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌(Maphylococcusaureus) (MRSA)的方法，包括以下步驟使測試樣本與親霉素結(jié)合蛋白質(zhì)h(PBP2a)特異性抗體和蛋白質(zhì)A特異性抗體接觸；并檢測抗原-抗體復(fù)合物的形成。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述PBPh特異性抗體與包含具有SEQIDN0:1的氨基酸的PBPh片段的多肽特異性結(jié)合。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述PBPh特異性抗體是從登記號為KCLRF-BP-00202、 KCLRF-BP-00203或KCLRF-BP-00204的雜交瘤細(xì)胞中產(chǎn)生的抗體。
7.權(quán)利要求4的方法，其中所述蛋白質(zhì)A特異性抗體是從以蛋白質(zhì)A免疫的雞得到的多克隆抗體。
8.權(quán)利要求4的方法，其中所述檢測抗原-抗體復(fù)合物的形成的步驟通過選自以下的至少一種方法來進(jìn)行放射性免疫分析、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、夾心免疫分析和側(cè)流免疫譜測定。
9.一種用于檢測甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌(MRSA)的試劑盒，包含青霉素結(jié)合蛋白質(zhì)h(PBP2a)特異性抗體和蛋白質(zhì)A特異性抗體。
10.權(quán)利要求9的試劑盒，其中所述PBPh特異性抗體是與包含具有SEQID N0:1的氨基酸的PBPh片段的多肽特異性結(jié)合的抗體。
11.權(quán)利要求10的試劑盒，其中所述PBPh特異性抗體由登記號為KCLRF-BP-00202、 KCLRF-BP-00203 或 KCLRF-BP-00204 的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生。
12.權(quán)利要求9的用于MRSA檢測的試劑盒，其中所述試劑盒被應(yīng)用于ELISA法或側(cè)流免疫譜測定。
13.一種用于檢測甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌(MRSA)的組合物，包含青霉素結(jié)合蛋白質(zhì)h(PBP2a)特異性抗體和蛋白質(zhì)A特異性抗體。
14.權(quán)利要求13的用于MRSA檢測的組合物，其中所述PBP2a-特異性抗體是與包含具有SEQ ID NO 1的氨基酸的PBPh片段的多肽特異性結(jié)合的抗體。
15.權(quán)利要求14的用于MRSA檢測的組合物，其中所述PBPh特異性抗體由登記號為 KCLRF-BP-00202、KCLRF-BP-00203 或 KCLRF-BP-00204 的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生。
全文摘要
本發(fā)明涉及抗在金黃色葡萄球菌甲氧西林抗性菌株(MRSA)中特異性表達(dá)的蛋白的抗體，以及用于檢測MRSA的方法和試劑盒。通過使用用于檢測PBP2a的PBP2a特異性抗體和用于檢測蛋白質(zhì)A的蛋白質(zhì)A特異性抗體，本發(fā)明能夠快速且準(zhǔn)確地檢測MRSA。
文檔編號G01N33/569GK102482346SQ200980159211
公開日2012年5月30日 申請日期2009年6月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月11日
發(fā)明者宋亨根, 尹相淳, 文裕利, 池吉龍, 申美香, 金海貞 申請人:狄諾納有限公司