專利名稱：雞傳染性貧血病毒抗體斑點免疫膠體金滲濾試驗檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及病毒檢測技術(shù)領(lǐng)域，更具體地說，是涉及一種雞傳染性貧血病毒抗體斑點免疫膠體金滲濾試驗(DIGFA)檢測方法。
背景技術(shù)：
雞傳染性貧血病(Chicken Infectious Anemia，CIA)是雞傳染性貧血病毒(Chicken Anemia Virus，CAV)引起的一種以再生障礙性貧血和全身淋巴器官萎縮，造成免疫抑制為主要特征的病毒性傳染病。其病原一雞傳染性貧血病毒1979年由日本學(xué)者Yuasa等首次報道以后，相繼在西德、瑞典、英國、丹麥、波蘭、美國、澳大利亞、荷蘭及巴西等國陸續(xù)證實了本病的發(fā)生。我國于1992年首次分離到此病毒。CAV為環(huán)狀單股DNA病毒，在國際病毒分類委員會(ICTV)發(fā)表的第六次病毒分類報告中將其與豬環(huán)狀病毒、鸚鵡喙羽病病毒一起設(shè)立了一個新科，即圓環(huán)病毒科(Circoviridae)。
目前可以用于雞傳染性貧血的診斷方法主要有CAV病毒的分離和鑒定、電鏡觀察、免疫熒光或過氧化物酶染色法和聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)方法等。上述方法都需要熒光顯微鏡、酶標儀、PCR儀等昂貴的儀器設(shè)備，反應(yīng)條件相對苛刻，再加上操作步驟繁瑣，試驗時間長等，因而使其在基層的應(yīng)用受到一定的局限性。鑒于上述原因，研究新的快速、敏感、特異、簡便、容易操作的CAV檢測技術(shù)就顯得十分必要，也是當前亟待解決的問題，這對于加強該病的診斷和預(yù)防研究具有極為重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，提供一種快速、簡便、敏感性高的雞傳染性貧血病毒抗體斑點免疫膠體金滲濾試驗檢測方法。
本發(fā)明雞傳染性貧血病毒抗體斑點免疫膠體金滲濾試驗檢測方法，通過下述步驟予以實現(xiàn)(1)點樣取1uL雞傳染性貧血病毒(CAV)層析抗原點在NC膜斑點中央，室溫下自然干燥0.5h，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3min、除去未吸附上的抗原；其中CAV層析抗原按照下述步驟制備a、CAV VP1基因的克隆及原核表達載體的構(gòu)建根據(jù)發(fā)表的CAV VP1基因組序列分別設(shè)計引物，以CAV天津分離TJBD33株為模板，采用聚合酶鏈式反應(yīng)方法擴增出690bp的DNA片段；將擴增的DNA片段純化后克隆至pGM-T Easy載體中構(gòu)建重組克隆質(zhì)粒；通過酶切、克隆將CAV VP1基因片段分別插入原核表達載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，用聚合酶鏈式反應(yīng)方法挑選陽性菌落，培養(yǎng)后提取表達CAV VP1基因的重組質(zhì)粒；b、CAV VP1表達蛋白的制備將上述陽性菌落接種于Luria-Bertani(LB)液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600值為0.6，然后加入異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)于26℃條件下誘導(dǎo)3.5h，獲得表達CAV VP1蛋白的菌體；培養(yǎng)表達重組蛋白的細菌，裂解后用幾丁柱方法進行純化，得到CAV層析抗原；(2)封閉將點樣后的NC膜浸于封閉液中，封閉液為0.01Mol/L、pH7.4的PBS溶液，PBS溶液中含5％牛血清白蛋白(BSA)、0.5％吐溫-20(Tween-20)，在37℃下作用30min，用PBS溶液洗3min、除去未吸附的封閉液后晾干；(3)加待檢血清加待檢血清標本100uL于NC膜的點樣處，37℃下作用30min；(4)加金標抗體加金標兔抗雞免疫球蛋白(IgG)100uL，37℃作用下15min，用去離子水洗3min；其中金標兔抗雞免疫球蛋白(IgG)按照下述步驟制備a、膠體金顆粒的制備分別按要求制備A液和B液；A液1％HAuCl4水溶液1mL加入79mL雙餾水中混勻；B液1％枸櫞酸三鈉4mL，0.1Mol/LK2CO30.025mL，1％鞣酸0.1mL，雙餾水15.875mL；將A液、B液分別加熱至60℃，在電磁攪拌下迅速將B液加入A液中，溶液變藍，繼續(xù)加熱攪拌、煮沸直至溶液呈亮紅色且顏色再不發(fā)生變化為止，室溫下冷卻，分裝為每份1mL保存于4℃；b、金標兔抗雞IgG的制備與純化分別取10mL上述膠體金溶液和兔抗雞IgG抗體，并將膠體金和兔抗雞IgG抗體溶液分別以0.1Mol/L K2CO3調(diào)pH至9.0，在電磁攪拌下將兔抗雞IgG抗體溶液，加入膠體金溶液混合，攪拌10min，并加入一定量5％BSA使溶液終濃度為1％，以防止兔抗雞IgG抗體與膠體金聚合發(fā)生沉淀；將膠體金兔抗雞IgG結(jié)合物先1500r/min4℃離心30min，棄掉由凝聚形成的沉淀；將上清液于4℃、15000r/min離心1h，小心吸取上清液并棄掉，取沉淀；將沉淀物用含1％BSA、0.05％NaN3的0.01Mol/L pH8.2的PB液重懸沉淀至原量，于4℃下平衡過夜，然后重復(fù)4℃、15000r/min離心1h一次，再將沉淀物重懸為原來體積的1/5，分裝為每份10mL后于4℃保存；(5)銀加強染色NC膜浸入硝酸銀顯影液中、室溫下避光作用10min，移入定影液中、室溫下作用5min，然后用去離子水沖洗，自然干燥后觀察結(jié)果；(6)結(jié)果判定若與金標抗體作用20min，經(jīng)銀染色后NC膜上呈現(xiàn)紅色斑點的則為陽性、黑色斑點為強陽性，否則為陰性。
本發(fā)明所述NC膜為0.45um的硝酸纖維素膜。
本發(fā)明的有益效果是通過臨床檢測結(jié)果表明，本發(fā)明雞傳染性貧血DIGFA檢測方法，不需要任何特殊儀器設(shè)備，且操作簡便快速，所用試劑價格低廉，結(jié)果易于觀察，可在數(shù)分鐘內(nèi)報告結(jié)果，具有快速，簡便，敏感性高，特異性強和重復(fù)性好等優(yōu)點，尤其適用于基層單位推廣應(yīng)用。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步描述。
首先進行檢測中自制試劑的制備1.CAV層析抗原的制備a、雞傳染性貧血病毒VP1基因的克隆及原核表達載體的構(gòu)建根據(jù)發(fā)表的雞貧血病毒(CAV)VP1基因組序列分別設(shè)計引物，以CAV天津分離TJBD33株為模板，采用PCR方法擴增出與預(yù)期設(shè)計大小相符的DNA片段；將擴增的DNA片段純化后克隆至pGM-T easy載體中構(gòu)建重組克隆質(zhì)粒；通過酶切、克隆將CAV VP1基因片段分別插入原核表達載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，用聚合酶鏈式反應(yīng)方法挑選陽性菌落，培養(yǎng)后提取表達CAVVP1基因的重組質(zhì)粒；b、雞傳染性貧血病毒VP1表達蛋白的制備將上述陽性菌落接種于Luria-Bertani(LB)液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后加入異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)進行誘導(dǎo)，獲得表達CAV VP1蛋白的菌體；培養(yǎng)表達重組蛋白的細菌，裂解后用幾丁柱方法進行純化，得到CAV層析抗原。
2.金標兔抗雞免疫球蛋白(IgG)的制備a、膠體金顆粒的制備分別按要求制備A液和B液；A液1％HAuCl4水溶液1mL加入79mL雙餾水中混勻；B液1％枸櫞酸三鈉4mL，0.1Mol/LK2CO30.025mL，1％鞣酸0.1mL，雙餾水15.875mL；將A液、B液分別加熱至60℃，在電磁攪拌下迅速將B液加入A液中，溶液變藍，繼續(xù)加熱攪拌、煮沸直至溶液呈亮紅色且顏色再不發(fā)生變化為止，室溫下冷卻，分裝(每份1mL)保存于4℃；b、金標兔抗雞IgG的制備與純化分別取10mL的上述膠體金溶液和兔抗雞IgG抗體，并將膠體金和兔抗雞IgG抗體溶液分別以0.1Mol/L K2CO3調(diào)pH至9.0，在電磁攪拌下將兔抗雞IgG抗體溶液，加入膠體金溶液混合，攪拌10min，并加入一定量5％BSA使溶液終濃度為1％，以防止兔抗雞IgG抗體與膠體金聚合發(fā)生沉淀；將膠體金兔抗雞IgG結(jié)合物先1500r/min4℃離心30min，棄掉由凝聚形成的沉淀；將上清液于4℃、15000r/min離心1h，小心吸取上清液并棄掉，取沉淀；將沉淀物用含1％BSA、0.05％NaN3的0.01 Mol/L pH8.2的PB液重懸沉淀至原量，于4℃下平衡過夜，然后重復(fù)4℃、15000r/min離心1h一次，再將沉淀物重懸為原來體積的1/5，分裝(每份10mL)后于4℃保存。
實施例1某雞場的雞出現(xiàn)精神沉郁、衰弱、消瘦、體重減輕、死亡率高等臨床癥狀。經(jīng)病理剖檢可見喙、肉髯和可視黏膜蒼白；血液稀薄，血凝時間延長；骨髓呈黃白色。采取了病雞的10份血清，100倍稀釋后進行CAV DOT-DIGFA檢測。檢測程序如下(1)點樣取1uL CAV層析抗原點在NC膜(0.45um硝酸纖維素膜)斑點中央，室溫下自然干燥0.5h，用PBS洗3min、除去未吸附上的抗原。
(2)封閉將點樣后的NC膜浸于封閉液(0.01Mol/L、pH7.4PBS，含5％BSA、0.5％Tween-20)中，37℃作用下30min，用PBS洗3min、除去未吸附的封閉液、晾干；(3)加待檢血清加待檢血清標本100uL于NC膜的點樣處，37℃作用下30min。
(4)加金標抗體加金標兔抗雞IgG 100UL，37℃作用下15min，用去離子水洗3min。
(5)銀加強染色NC膜浸入硝酸銀顯影液中、室溫下避光作用10min，移入定影液中、室溫下作用5min，然后用去離子水沖洗，自然干燥后觀察結(jié)果。
(6)結(jié)果判定若與金標抗體作用20min，經(jīng)銀染色后NC膜上呈現(xiàn)紅色斑點的則為陽性、黑色斑點為強陽性，否則為陰性。
結(jié)果NC膜上呈現(xiàn)紅色斑點，表明10份血清均為陽性。由于該雞群從未做過CAV免疫，說明感染了CAV。
實施例2某雞場的雞發(fā)生死亡，經(jīng)剖檢發(fā)現(xiàn)，股骨的骨髓被脂肪組織取代，呈脂肪色、淡黃色。胸腺萎縮甚至完全退化，顏色呈深紅褐色，法氏囊的外壁呈半透明狀態(tài)，肝臟腫脹、褪色，腺胃黏膜出血，疑似為雞傳染性貧血。隨機采集了20只雞的血清，100倍稀釋后用DOT-DIGFA方法進行CAV抗體檢測。檢測步驟如下取1uL CAV層析抗原點在NC膜(0.45um硝酸纖維素膜)斑點中央，室溫下自然干燥0.5h，用PBS洗3min、除去未吸附上的抗原；將點樣后的NC膜浸于封閉液(0.01mol/L、pH7.4PBS，含5％BSA、0.5％Tween-20)中，37℃作用下30min，用PBS洗3min、除去未吸附的封閉液、晾干；加待檢血清標本100uL于NC膜的點樣處，37℃作用下30min；加金標兔抗雞IgG 100uL，37℃作用下15min，用去離子水洗3min；銀加強染色NC膜浸入硝酸銀顯影液中、室溫下避光作用10min，移入定影液中、室溫下作用5min，然后用去離子水沖洗，自然干燥后觀察結(jié)果。
結(jié)果判定若與金標抗體作用20min，經(jīng)銀染色后NC膜上呈現(xiàn)紅色斑點的則為陽性、黑色斑點為強陽性，否則為陰性。
結(jié)果NC膜上呈現(xiàn)紅色斑點，表明20份血清均為陽性。由于該雞群從未做過CAV免疫，說明感染了CAV。
權(quán)利要求
1.一種雞傳染性貧血病毒抗體斑點免疫膠體金滲濾試驗檢測方法，其特征是，按照下述步驟進行(1)點樣取1uL雞傳染性貧血病毒(CAV)層析抗原點在NC膜斑點中央，室溫下自然干燥0.5h，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3min、除去未吸附上的抗原；其中CAV層析抗原按照下述步驟制備a、CAV VP1基因的克隆及原核表達載體的構(gòu)建根據(jù)發(fā)表的CAV VP1基因組序列分別設(shè)計引物，以CAV天津分離TJBD 33株為模板，采用聚合酶鏈式反應(yīng)方法擴增出690bp的DNA片段；將擴增的DNA片段純化后克隆至pGM-TEasy載體中構(gòu)建重組克隆質(zhì)粒；通過酶切、克隆將CAV VP1基因片段分別插入原核表達載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，用聚合酶鏈式反應(yīng)方法挑選陽性菌落，培養(yǎng)后提取表達CAV VP1基因的重組質(zhì)粒；b、CAV VP1表達蛋白的制備將上述陽性菌落接種于Luria-Bertani(LB)液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600值為0.6，然后加入異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)于26℃條件下誘導(dǎo)3.5h，獲得表達CAV VP1蛋白的菌體；培養(yǎng)表達重組蛋白的細菌，裂解后用幾丁柱方法進行純化，得到CAV層析抗原；(2)封閉將點樣后的NC膜浸于封閉液中，封閉液為0.01Mol/L、pH7.4的PBS溶液，PBS溶液中含5％牛血清白蛋白(BSA)、0.5％吐溫-20(Tween-20)，在37℃下作用30min，用PBS溶液洗3min、除去未吸附的封閉液后晾干；(3)加待檢血清加待檢血清標本100uL于NC膜的點樣處，37℃下作用30min；(4)加金標抗體加金標兔抗雞免疫球蛋白(IgG)100uL，37℃作用下15min，用去離子水洗3min；其中金標兔抗雞免疫球蛋白(IgG)按照下述步驟制備a、膠體金顆粒的制備分別按要求制備A液和B液；A液1％HAuCl4水溶液1mL加入79mL雙餾水中混勻；B液1％枸櫞酸三鈉4mL，0.1Mol/LK2CO30.025mL，1％鞣酸0.1mL，雙餾水15.875mL；將A液、B液分別加熱至60℃，在電磁攪拌下迅速將B液加入A液中，溶液變藍，繼續(xù)加熱攪拌、煮沸直至溶液呈亮紅色且顏色再不發(fā)生變化為止，室溫下冷卻，分裝為每份1mL保存于4℃；b、金標兔抗雞IgG的制備與純化分別取10mL上述膠體金溶液和兔抗雞IgG抗體，并將膠體金和兔抗雞IgG抗體溶液分別以0.1Mol/L K2CO3調(diào)pH至9.0，在電磁攪拌下將兔抗雞IgG抗體溶液，加入膠體金溶液混合，攪拌10min，并加入一定量5％BSA使溶液終濃度為1％，以防止兔抗雞IgG抗體與膠體金聚合發(fā)生沉淀；將膠體金兔抗雞IgG結(jié)合物先1500r/min 4℃離心30min，棄掉由凝聚形成的沉淀；將上清液于4℃、15000r/min離心1h，小心吸取上清液并棄掉，取沉淀；將沉淀物用含1％BSA、0.05％NaN3的0.01Mol/L pH8.2的PB液重懸沉淀至原量，于4℃下平衡過夜，然后重復(fù)4℃、15000r/min離心1h一次，再將沉淀物重懸為原來體積的1/5，分裝為每份10mL后于4℃保存；(5)銀加強染色NC膜浸入硝酸銀顯影液中、室溫下避光作用10min，移入定影液中、室溫下作用5min，然后用去離子水沖洗，自然干燥后觀察結(jié)果；(6)結(jié)果判定若與金標抗體作用20min，經(jīng)銀染色后NC膜上呈現(xiàn)紅色斑點的則為陽性、黑色斑點為強陽性，否則為陰性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雞傳染性貧血病毒抗體斑點免疫膠體金滲濾試驗檢測方法，其特征是，所述NC膜為0.45um的硝酸纖維素膜。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種雞傳染性貧血病毒抗體斑點免疫膠體金滲濾試驗檢測方法，首先取1uL CAV層析抗原點在NC膜(0.45μm硝酸纖維素膜)斑點中央，室溫下自然干燥0.5h，用PBS洗3min、除去未吸附上的抗原；將點樣后的NC膜浸于封閉液(0.01Mol/L、pH7.4 PBS，含5％BSA、0.5％Tween－20)中，37℃作用下30min，用PBS洗3min、除去未吸附的封閉液、涼干；加待檢血清標本100uL于NC膜的點樣處，37℃作用下30min；加金標兔抗雞IgG 100UL，37℃作用下15min，用去離子水洗3min；NC膜浸入硝酸銀顯影液中、室溫下避光作用10min，移入定影液中、室溫下作用5min，然后用去離子水沖洗，自然干燥后觀察結(jié)果。若與金標抗體作用20min，經(jīng)銀染色后NC膜上呈現(xiàn)紅色斑點的則為陽性、黑色斑點為強陽性，否則為陰性。本發(fā)明對CAV進行臨床診斷不僅切實可行，且具有快速、準確、特異的優(yōu)點，滿足了臨床診斷的要求，為檢測CAV抗體提供了便利條件。
文檔編號G01N21/77GK101059516SQ200710057469
公開日2007年10月24日 申請日期2007年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月25日
發(fā)明者梁智選 申請人:天津市禽病診斷培訓(xùn)中心