利用陶瓷膜分離固定化酶和肝素酶解液的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種陶瓷膜分離固定化酶和肝素酶解液的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]肝素鈉Ofeparin Sodium)是粘多糖硫酸酯類抗凝血藥。肝素鈉是由豬或牛的腸粘膜中提取的硫酸氨基葡聚糖的鈉鹽，屬粘多糖類物質(zhì)。近年來(lái)研究證明肝素鈉還有降血脂作用。
[0003]利用小腸粘膜制備肝素鈉屬于目前現(xiàn)有的公知技術(shù)，例如，《酶解法制備肝素鈉關(guān)鍵工藝技術(shù)研究》一文中告知:首先，進(jìn)行小腸粘膜酶解，小腸粘膜的胰蛋白酶最適合的酶解工藝條件為:酶底物比為0.7%，溫度60°C，時(shí)間3h，pH8.5，鹽濃度0.3mol/L，料液比為1:7。然后，離子交換樹(shù)脂吸附黏膜酶解液，得粗品肝素鈉；當(dāng)采用FPA98cl類型的離子交換樹(shù)脂在最適合工藝條件下對(duì)黏膜酶解液進(jìn)行吸附時(shí)，肝素鈉的吸附量達(dá)到218.47mg/g，粗品肝素鈉的效價(jià)能達(dá)到90U/mg。最后，用乙醇直接沉淀法對(duì)粗品肝素鈉進(jìn)行精制，所得肝素鈉的效價(jià)能達(dá)到120U/mg。但，上述方法尚存在以下缺陷:酶解結(jié)束后需要高溫滅酶，對(duì)肝素效價(jià)有較大影響；滅酶后蛋白酶轉(zhuǎn)變?yōu)殡s質(zhì)，在后續(xù)的離子交換樹(shù)脂吸附工藝中易出現(xiàn)吸附不完全，影響產(chǎn)品得率。蛋白酶無(wú)法重復(fù)利用，成本較高。
[0004]陶瓷膜是無(wú)機(jī)膜中的一種，屬于膜分離技術(shù)中的固體膜材料，主要以不同規(guī)格的氧化鋁、氧化鋯、氧化鈦和氧化硅等無(wú)機(jī)陶瓷材料作為支撐體，經(jīng)表面涂膜、高溫?zé)贫?。商品化的陶瓷膜通常具有三層結(jié)構(gòu)(多孔支撐層、過(guò)渡層及分離層)，呈非對(duì)稱分布，其孔徑規(guī)格為0.8nm?1 ym不等，過(guò)濾精度涵蓋微濾、超濾、納濾級(jí)別。
[0005]目前，陶瓷膜在使用前的預(yù)處理方式為:新膜使用前需要用蒸餾水浸泡12h后，在溫度30°C，壓力0.2MPa，流速2m/s，循環(huán)蒸餾水壓濾2?3小時(shí)至水通量穩(wěn)定。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種陶瓷膜分離固定化酶和肝素酶解液的方法。
[0007]為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種陶瓷膜分離固定化酶和肝素酶解液的方法，包括以下步驟:
[0008]1)、對(duì)陶瓷膜進(jìn)行預(yù)處理:
[0009]將孔徑為800nm陶瓷膜用蒸餾水浸泡22?26h(較佳為24h)后，于壓力0.2Mpa、溫度29?31°C (較佳為30°C )、流速1.8?2.2m/s (較佳為2m/s)條件下循環(huán)蒸餾水55?65min(較佳為60min);得處理后陶瓷膜；
[0010]備注說(shuō)明:上述浸泡過(guò)程中需確保陶瓷膜始終被蒸餾水所浸沒(méi)；上述預(yù)處理的目的是實(shí)現(xiàn)將膜壓實(shí)，使其通量達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)；
[0011]2)、固定化酶制備:
[0012]在100ml的蒸餾水中加入0.22?0.26g(較佳為0.24g)胰蛋白酶，均勻攪拌，得酶液；
[0013]在所述酶液中加入平均粒徑為1.8?2.2 μ m(較佳為2 μ m)的二氧化硅，磁力攪拌1.5?2.5h(較佳為2h)，離心，棄去上清，得固定化胰蛋白酶；所述胰蛋白酶與二氧化娃的質(zhì)量比為1:25?28 ；
[0014]備注說(shuō)明:上述磁力攪拌的目的是使胰蛋白酶能固定于二氧化硅上；
[0015]3)、固定化胰蛋白酶制備肝素酶解液:
[0016]按照l(shuí)g/3?4ml (較佳為lg/3.3mL)的料液比，在小腸粘膜中加入水后進(jìn)行勻漿，調(diào)節(jié)所得漿液的pH為10.8?11.2(較佳為pH為11);然后加入固定化胰蛋白酶，胰蛋白酶與作為底物的小腸粘膜的質(zhì)量比為0.24% (即，酶底物比為0.24% )，于45?47°C水浴中酶解4.8?5.2h (較佳為46 °C水浴中酶解5h)；
[0017]4)、將步驟3)所得的肝素酶解液用100目濾網(wǎng)過(guò)濾，得濾液；
[0018]備注說(shuō)明:上述過(guò)濾的目的是為了除去小腸粘膜殘?jiān)椭窘M織等；該濾液中包括固定化胰蛋白酶、肝素、蛋白質(zhì)等；其PH約為11 ;
[0019]5)、利用步驟1)所得的處理后陶瓷膜對(duì)步驟4)所得的濾液進(jìn)行微濾，所述微濾的工藝參數(shù)為:壓力0.3MPa，溫度39?41°C (較佳為40°C )，流速1.8?2.2m/s (較佳為2m/s)，收集濾液；所述濾液中含有肝素。
[0020]備注說(shuō)明:步驟1)所得的處理后陶瓷膜對(duì)固定化胰蛋白酶的攔截率100%，肝素透過(guò)率達(dá)到92.5%，平均膜通量達(dá)到656.4L/m2.h。
[0021]作為本發(fā)明的陶瓷膜分離固定化酶和肝素酶解液的方法的改進(jìn)，該方法還包括以下步驟:
[0022]6)、陶瓷膜的再生:
[0023]將步驟5)微濾所得的陶瓷膜利用質(zhì)量濃度為1.8?2.2% (較佳為2% ) NaOH溶液進(jìn)行循環(huán)清洗，然后蒸餾水洗至中性。
[0024]作為本發(fā)明的陶瓷膜分離固定化酶和肝素酶解液的方法的進(jìn)一步改進(jìn):
[0025]步驟6)中的循環(huán)清洗為:于40?45 °C循環(huán)清洗30?45min，控制NaOH溶液的流速為1.8?2.2m/s (較佳為2m/s)。
[0026]備注說(shuō)明:再生所得的陶瓷膜的通量不低于初始通量的85%。
[0027]本發(fā)明中:
[0028]1、所用的孔徑為800nm陶瓷膜選用廈門(mén)福美科技有限公司生產(chǎn)的SMC-250型號(hào)的陶瓷膜。
[0029]2、所選用的胰蛋白酶的活性為250U/mg。
[0030]3、本發(fā)明的工藝步驟中，沒(méi)有明確限定的均為在室溫下進(jìn)行，所述室溫一般是指20 ?25°C。
[0031]本發(fā)明具有如下技術(shù)優(yōu)勢(shì):
[0032]1、與游離酶相比，固定化酶可以重復(fù)使用，降低了生產(chǎn)成本，同時(shí)酶的穩(wěn)定性也明顯提尚;
[0033]2、采用膜分離技術(shù)將固定化酶與產(chǎn)物分開(kāi)，不僅簡(jiǎn)化了提純工藝，而且無(wú)需高溫滅酶，避免了蛋白酶滅活后轉(zhuǎn)變?yōu)殡s質(zhì)影響后續(xù)的樹(shù)脂吸附純化工藝。
[0034]綜上所述，本發(fā)明利用固定化酶替代游離酶提取肝素，并使用膜分離技術(shù)實(shí)現(xiàn)固定化酶與提取產(chǎn)物的分離，無(wú)需高溫滅酶，克服了游離酶法提取肝素的蛋白酶無(wú)法重復(fù)利用、蛋白酶滅活后轉(zhuǎn)變?yōu)殡s質(zhì)影響產(chǎn)品得率等缺陷；所得產(chǎn)物的效價(jià)也較為理想。
【具體實(shí)施方式】
[0035]實(shí)施例1、一種利用陶瓷膜分離固定化酶和肝素酶解液的方法，依次進(jìn)行以下處理:
[0036]1)、對(duì)陶瓷膜進(jìn)行預(yù)處理:
[0037]將孔徑為800nm陶瓷膜用蒸餾水浸泡24小時(shí)后，于壓力0.2MPa，溫度30°C，流速2m/s條件下循環(huán)蒸餾水60min ;從而實(shí)現(xiàn)將膜壓實(shí)，使其通量達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)；得處理后陶瓷膜；
[0038]上述處理后陶瓷膜的膜通量為950L/m2.h。
[0039]2)、固定化酶制備:
[0040]在100ml的蒸餾水中加入0.24g胰蛋白酶，均勻攪拌，得酶液；
[0041]在所述酶液中加入平均粒徑約為2 μπι的二氧化硅，磁力攪拌2h，離心(轉(zhuǎn)速為5000r/min)，棄去上清，得固定化胰蛋白酶；所述胰蛋白酶與二氧化娃的質(zhì)量比為1:25 ;
[0042]備注說(shuō)明:上述磁力攪拌的目的是使胰蛋白酶能固定于二氧化硅上；
[0043]3)、固定化胰蛋白酶制備肝素酶解液:
[0044]按照l(shuí)g/3.3mL的料液比，在1