專利名稱：硬質(zhì)禾草內(nèi)生真菌檢測(cè)技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)方法，確切講是檢測(cè)一種生長(zhǎng)于植物體內(nèi)的真菌的方法。本發(fā)明的方法中包括將禾草樣品用染色劑進(jìn)行染色，再將經(jīng)染色的樣品置于光鏡下進(jìn)行檢測(cè)，或者將經(jīng)染色后的樣品稍加熱后再置于光鏡下進(jìn)行檢測(cè)。
背景技術(shù)：
內(nèi)生真菌(endophyte)是一類生活在植物體內(nèi)而不表現(xiàn)外部癥狀的真菌。禾草感染內(nèi)生真菌可以引起采食的家畜中毒甚至死亡。據(jù)美國(guó)和新西蘭的統(tǒng)計(jì)，每年僅因高羊茅內(nèi)生真菌(Neotyphodium coenophialum)和黑麥草內(nèi)生真菌(Lolium perenne)使牛羊患病、死亡造成的經(jīng)濟(jì)損失就達(dá)6億美元之多。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，生長(zhǎng)于我國(guó)北方的醉馬草(Achnatherum inebrians)中含有的內(nèi)生真菌可能是引起家畜中毒的原因。但在另一方面，禾草內(nèi)生真菌的侵染可以增加植物抗旱、抗蟲、抗病、耐踐踏等特性。因此，防治內(nèi)生真菌對(duì)畜牧業(yè)的危害和利用內(nèi)生真菌提高草坪草的抗逆性是當(dāng)前國(guó)際研究的兩大熱點(diǎn)領(lǐng)域。而對(duì)禾草內(nèi)生真菌的帶菌狀況進(jìn)行檢測(cè)是從事上述研究的前提。
目前國(guó)際上通用的禾草內(nèi)生真菌檢測(cè)方法為(1)直接光鏡檢測(cè)法；(2)血清學(xué)檢測(cè)法；(3)分子技術(shù)檢測(cè)法和(4)間接檢測(cè)法。在這四種檢測(cè)方法中，因后三種由于需較為復(fù)雜的前期準(zhǔn)備，費(fèi)時(shí)費(fèi)工，且花費(fèi)較大，一般不作為常用的檢測(cè)方法，直接光鏡檢測(cè)法由于簡(jiǎn)便、方便，操作相對(duì)容易而被用作常用檢測(cè)方法?，F(xiàn)廣泛采用的直接光鏡檢測(cè)法除種子糊粉層檢測(cè)法外，更為簡(jiǎn)便的是葉鞘染色法，它是沿禾草葉鞘內(nèi)側(cè)撕取內(nèi)皮層，再將內(nèi)皮層用染色劑進(jìn)行染色，然后將樣品置于光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行檢測(cè)。為使染色有更好的效果，也可以將染色后的樣品稍稍加熱，如將經(jīng)染色后的樣品放置于電熱盤上或者酒精火焰上加熱數(shù)秒后，再置于光鏡下進(jìn)行檢測(cè)。但這種檢測(cè)方法對(duì)于一些質(zhì)地較為堅(jiān)硬的禾草，如醉馬草、賴草(Leymus)、冰草(Agropyron)等，很難撕取其內(nèi)皮薄膜，既使撕取所得的皮層也往往厚度不夠，因而影響采用葉鞘染色和光鏡檢測(cè)法對(duì)此類禾草內(nèi)生真菌進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)也影響其檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供可以對(duì)質(zhì)地較為堅(jiān)硬的禾草進(jìn)行葉鞘染色和直接光學(xué)顯微鏡檢測(cè)的方法。
本發(fā)明的方法分為兩種，其中的第一種方法適用于檢測(cè)生長(zhǎng)期小于4周齡的早齡幼草，而第二種方法適用于檢測(cè)生長(zhǎng)期大于4周齡的老齡幼苗或成株。
本發(fā)明的第一種方法是先將禾草樣品(可以是整個(gè)禾草分蘗)用5～15％的NaOH水溶液浸泡3～5小時(shí)后，然后再進(jìn)行染色處理。
本發(fā)明的第二種方法是先將禾草樣品(使用葉鞘)用沸水煮4～8分鐘，再沿葉鞘內(nèi)側(cè)撕取內(nèi)皮層，再對(duì)內(nèi)皮層進(jìn)行染色處理。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明有如下特點(diǎn)1、適用于處理質(zhì)地較為堅(jiān)硬的禾草，而且檢測(cè)的準(zhǔn)確率高。通過本發(fā)明的方法可以使禾草組織軟化和透明，從而提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性；2、重復(fù)性好，檢測(cè)精度高。發(fā)明人曾利用本發(fā)明對(duì)甘肅的夏河、肅南、永靖、蘭州、慶陽等5個(gè)不同生態(tài)區(qū)域的3000余株幼苗、成株進(jìn)行檢測(cè)，其效果令人滿意，而且檢測(cè)的重復(fù)性很好。通過已經(jīng)進(jìn)行的對(duì)比實(shí)驗(yàn)，本發(fā)明的方法與直接撕取相比，其菌絲體更為清晰；3、方法簡(jiǎn)單，易于掌握和操作；4、檢測(cè)方法快速方便，而且可以對(duì)早齡幼苗整株進(jìn)行直接檢測(cè)。如果采用現(xiàn)有技術(shù)檢測(cè)，必須等幼苗生長(zhǎng)5～6周時(shí)間后才能進(jìn)行。本發(fā)明則可以對(duì)早期幼苗整株直接進(jìn)行檢測(cè)，大大縮短了工作進(jìn)程。此外，本發(fā)明的檢測(cè)速度也很快，根據(jù)實(shí)際測(cè)算，每小時(shí)可每人可檢測(cè)30個(gè)以上的植株。
具體實(shí)施例方式
以下提供本發(fā)明的實(shí)施例例1材料采自甘肅、青海、新疆和內(nèi)蒙古的醉馬草種樣，經(jīng)種子糊粉層染色檢測(cè)找出帶菌率為100％的種子，種植于16×6眼的塑料育種盤內(nèi)，在15～30℃溫室條件下生長(zhǎng)，取生長(zhǎng)期在4周以內(nèi)的單株幼苗為樣品。
方法將所取的早齡幼苗分蘗用5～15％的NaOH水溶液在室溫下浸泡3至5小時(shí)，然后將其直接置于玻片上，再用0.8％的乳酸苯胺藍(lán)溶液染色，將樣品輕壓，再用電熱盤或酒精火焰加熱數(shù)秒后，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行檢測(cè)。
結(jié)果2000個(gè)醉馬草早齡幼苗的葉鞘經(jīng)本發(fā)明處理后，其內(nèi)生真菌檢出率為98％。而使用現(xiàn)有技術(shù)，樣品極難以處理，經(jīng)處理所得樣品檢測(cè)其內(nèi)生真菌檢出率僅為12％。
例2材料采自甘肅、青海、新疆和內(nèi)蒙古的醉馬草種樣，經(jīng)種子糊粉層染色檢測(cè)找出帶菌率為100％的種子，種植于16×6眼的塑料育種盤內(nèi)，在15～30℃溫室條件下生長(zhǎng)，取生長(zhǎng)期在5周齡的老齡幼株。
方法將所取的老齡幼株葉鞘用開水煮4～6分鐘，再沿葉鞘內(nèi)側(cè)撕取內(nèi)皮層，將撕取的內(nèi)皮層置于玻片上，再用0.8％的乳酸苯胺藍(lán)溶液染色，再用電熱盤或酒精火焰加熱數(shù)秒后，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行檢測(cè)。
結(jié)果2000個(gè)醉馬草成株葉鞘經(jīng)本發(fā)明處理后，其內(nèi)生真菌檢出率為100％。而使用現(xiàn)有技術(shù)，樣品非常難處理，且經(jīng)處理所得樣品進(jìn)行檢測(cè)，其內(nèi)生真菌檢出率僅為5％。
例3材料采自甘肅、青海、新疆和內(nèi)蒙古的醉馬草種樣，經(jīng)種子糊粉層染色檢測(cè)找出帶菌率為100％的種子，種植于16×6眼的塑料育種盤內(nèi)，在15～30℃溫室條件下生長(zhǎng)，取生長(zhǎng)期在15月齡的成株。
方法將所取的成株葉鞘用開水煮5～8分鐘，再沿葉鞘內(nèi)側(cè)撕取內(nèi)皮層，將撕取的內(nèi)皮層置于玻片上，用0.8％的乳酸苯胺藍(lán)溶液染色，再用電熱盤或酒精火焰加熱數(shù)秒后，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行檢測(cè)。
結(jié)果2000個(gè)醉馬草成株葉鞘經(jīng)本發(fā)明處理后，其內(nèi)生真菌檢出率為100％。而使用現(xiàn)有技術(shù)，樣品非常難處理，且經(jīng)處理后所得樣品進(jìn)行檢測(cè)，其內(nèi)生真菌檢出率僅為20％。
權(quán)利要求
1.硬質(zhì)禾草內(nèi)生真菌檢測(cè)技術(shù)，將樣品用染色劑進(jìn)行染色，再將樣品置于光鏡下進(jìn)行檢測(cè)，或者將染色后的樣品稍加熱后再置于光鏡下進(jìn)行檢測(cè)，其特征是首先將樣品用5～15％的NaOH水溶液浸泡3～5小時(shí)后，再進(jìn)行染色處理。
2.禾草中內(nèi)生真菌檢測(cè)技術(shù)，將樣品用染色劑進(jìn)行染色，再將樣品置于光鏡下進(jìn)行檢測(cè)，或者將染色后的樣品稍加熱后再置于光鏡下進(jìn)行檢測(cè)，其特征是首先將樣品用沸水煮4～8分鐘，再沿葉鞘內(nèi)側(cè)撕取內(nèi)皮層，再對(duì)撕內(nèi)皮層進(jìn)行染色處理。
全文摘要
本發(fā)明涉檢測(cè)一種生長(zhǎng)于植物體內(nèi)的真菌的方法。本發(fā)明的第一種方法適用于幼苗，它是先將禾草樣品用5～15％的NaOH水溶液浸泡3～5小時(shí)后，再進(jìn)行染色處理和檢測(cè)；本發(fā)明的第二種方法適用于成株，它是先將樣品葉鞘用沸水煮4～8分鐘，再沿葉鞘內(nèi)側(cè)撕取內(nèi)皮層，再對(duì)內(nèi)皮層進(jìn)行染色處理和檢測(cè)。本發(fā)明的方法適用于處理質(zhì)地較為堅(jiān)硬的禾草，而且檢測(cè)的準(zhǔn)確率高，其檢測(cè)重復(fù)性好，檢測(cè)精度高，方法簡(jiǎn)單、快速，易于掌握和操作。
文檔編號(hào)G01N21/29GK1661357SQ20041002594
公開日2005年8月31日 申請(qǐng)日期2004年2月25日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月25日
發(fā)明者李春杰, 南志標(biāo) 申請(qǐng)人:蘭州大學(xué)