一種肌紅蛋白定量檢測(cè)的磁微粒化學(xué)發(fā)光微流控芯片的制作方法
【專利摘要】本實(shí)用新型提供一種肌紅蛋白定量檢測(cè)的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光微流控芯片，其結(jié)構(gòu)主要包括蓋片(1)和底片(11)，其中蓋片(1)上的空氣泵(3)，氣流微通道(5)，加樣口(2)，樣本液流通道(6)，第一生物標(biāo)記物存儲(chǔ)池(4)，微混合器(7)以及過渡區(qū)(10)依次連接；底片(11)上的過濾器(12)，反應(yīng)池(13)，清洗池(14)，檢測(cè)池(15)，溶液釋放通道(18)依次連接；底片(11)上的檢測(cè)池(15)通過溶液釋放通道(18)與清洗液存儲(chǔ)池(16)和發(fā)光液存儲(chǔ)池(17)連接；所述蓋片(1)和底片(11)用膠帶(20和22)密封；本實(shí)用新型提供的微流控芯片檢測(cè)結(jié)果靈敏度高，準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性好，成本低。
【專利說明】
一種肌紅蛋白定量檢測(cè)的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光微流控芯片
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域，具體涉及一種肌紅蛋白定量檢測(cè)的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光微流控芯片，能夠在數(shù)分鐘內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)生物樣品中肌紅蛋白的定量檢測(cè)，該檢測(cè)方法具有操作簡單，靈敏度高，低成本等特點(diǎn)?！颈尘凹夹g(shù)】[00〇2] 肌紅蛋白(myoglobin，MY0，Mb)是由一條肽鏈和一個(gè)血紅素輔基組成的結(jié)合蛋白， 是肌肉內(nèi)儲(chǔ)存氧的蛋白質(zhì)，它的氧飽和曲線為雙曲線型。肌肉中運(yùn)載氧的蛋白質(zhì)，由153個(gè)氨基酸殘基組成，分子量為16.7KD，含有血紅素，和血紅蛋白同源，與氧的結(jié)合能力介于血紅蛋白和細(xì)胞色素氧化酶之間，可幫助肌細(xì)胞將氧轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體。肌紅蛋白是組成骨骼肌和心肌的主要蛋白質(zhì)，當(dāng)肌肉損傷時(shí)，可以從肌肉組織中漏到循環(huán)血液中，使血清肌紅蛋白濃度增加。因此，該指標(biāo)用于判斷是否發(fā)生肌肉損傷。在健康人體內(nèi)，正常值，男性20?80y g/L;女性10?70iig/L;急性心肌梗死早期、急性肌損傷、肌營養(yǎng)不良、肌萎縮、多發(fā)性肌炎、 急性或慢性腎功能衰竭、嚴(yán)重充血性心力衰竭和長期休克等都可能導(dǎo)致肌紅蛋白含量升高。測(cè)定血清肌紅蛋白可作為急性心肌梗死(AMI)診斷的早期最靈敏的指標(biāo)。但特異性差， 骨骼肌損傷、創(chuàng)傷、腎功能衰竭等疾病，都可導(dǎo)致其升高。Myo陽性雖不能確診AMI，但可用于早期排除AMI診斷的重要指標(biāo)。
[0003]目前用于檢測(cè)肌紅蛋白的主要方法為酶聯(lián)免疫法(e n z y m e - 1 i n k e d immunosorbent assay，ELISA)和化學(xué)發(fā)光免疫分析法(chemiluminescence immunoassay, CLIA) ALISA則由于方法間差異較大，導(dǎo)致結(jié)果不均一，且線性范圍較窄，操作復(fù)雜，不適于做單人份或少量標(biāo)本的檢測(cè)?；瘜W(xué)發(fā)光技術(shù)興起于上個(gè)世紀(jì)80年代是繼酶聯(lián)免疫技術(shù)和放免技術(shù)之后發(fā)展起來的新興技術(shù)，由于其高靈敏度、高特異性，同時(shí)方法簡便、快速，標(biāo)記結(jié)合物穩(wěn)定，無放射性同位素?fù)p傷和污染等特點(diǎn)，在近些年得到了飛速發(fā)展。中國專利(CN 103033627 A)，公開了一種人肌紅蛋白酶促化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)方法，具體做法為:在固定有抗人肌紅蛋白單克隆抗體的聚苯乙烯微孔板上，加入待檢測(cè)樣本和辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗人肌紅蛋白單克隆抗體，孵育一定時(shí)間，經(jīng)過洗滌，再加入發(fā)光試劑，在化學(xué)發(fā)光儀測(cè)定發(fā)光值，根據(jù)抗原濃度和發(fā)光強(qiáng)度間的關(guān)系，得出待檢樣品中肌紅蛋白的含量。本方法用于肌紅蛋白的定量檢測(cè)靈敏度高，穩(wěn)定性好，但檢測(cè)時(shí)操作步驟繁瑣，需要專業(yè)人員操作，不適合中小醫(yī)院和基層醫(yī)療單位，同時(shí)檢測(cè)時(shí)間長，不能用于及時(shí)快速診斷。
[0004]近年來，生物分析技術(shù)領(lǐng)域得到了快速的發(fā)展，出現(xiàn)了很多重要的研究方向。微流控芯片分析技術(shù)是其中最活躍的一支，在科研和實(shí)際應(yīng)用領(lǐng)域都獲得了廣泛的重視。微流控芯片作為一種新型的分析檢測(cè)平臺(tái)，具有高通量、集成化、便攜式、易操作、低成本等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)在眾多領(lǐng)域中得到了廣泛的應(yīng)用，尤其是在免疫分析領(lǐng)域已嶄露頭角。
[0005]表面功能化的磁性微球作為固相載體，可以用來有效地捕獲核酸、蛋白分子、病毒顆粒甚至細(xì)胞，已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于各種生化指標(biāo)的臨床診斷等領(lǐng)域。而微流控芯片系統(tǒng)具有快速、高效、集成化等特點(diǎn)，兩者相結(jié)合，將成為一種新型的高性能檢測(cè)方法，以解決當(dāng)前檢測(cè)方法中存在的靈敏度低，檢測(cè)過程復(fù)雜，難以實(shí)現(xiàn)微量樣本檢測(cè)的問題，有望進(jìn)一步推動(dòng)臨床檢測(cè)儀器向便攜化和微型化發(fā)展。
[0006]免疫磁珠的生物微流控芯片是將磁顆粒技術(shù)，免疫分析集成到微流控芯片上的一種分析檢測(cè)方法，目前這種綜合性的檢測(cè)方法的主要難點(diǎn)表現(xiàn)為:1)液體在芯片內(nèi)部微流動(dòng)的智能控制，目前常采用的方法是在芯片內(nèi)部設(shè)置多個(gè)微栗和微閥，使得微流控體系變得更加復(fù)雜化;2)反應(yīng)體系的混合不充分，導(dǎo)致反應(yīng)不充分;3)集成化程度不高，導(dǎo)致非特異性背景高。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提出一種肌紅蛋白定量檢測(cè)的磁微粒化學(xué)發(fā)光微流控芯片，臨床檢驗(yàn)人員只需經(jīng)過簡單操作，即可在數(shù)分鐘內(nèi)快速實(shí)現(xiàn)樣品中肌紅蛋白濃度的定量檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果靈敏度高，準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性好，成本低。
[0008]本發(fā)明涉及的技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案如下為:
[0009]—種肌紅蛋白定量檢測(cè)的磁微粒化學(xué)發(fā)光微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片結(jié)構(gòu)主要包括蓋片(1)和底片(11)，其中蓋片(1)上空氣栗(3)，氣流微通道(5)，加樣口 (2)，樣本液流通道(6)，第一生物標(biāo)記物存儲(chǔ)池(4)，微混合器(7)以及過渡區(qū)(10)依次連接;底片(11)上過濾器(⑵，反應(yīng)池(13)，清洗池(14)，檢測(cè)池(15)，溶液釋放通道(18)依次連接;底片(11)上檢測(cè)池(15)通過溶液釋放通道(18)與清洗液存儲(chǔ)池(16)和發(fā)光液存儲(chǔ)池 (17)連接；
[0010]所述第一生物標(biāo)記物存儲(chǔ)池(4)存儲(chǔ)預(yù)封裝酶或發(fā)光劑標(biāo)記抗肌紅蛋白抗體溶液;所述反應(yīng)池(13)存儲(chǔ)預(yù)封裝磁顆粒標(biāo)記抗肌紅蛋白抗體;所述清洗液存儲(chǔ)池(14)和和發(fā)光液存儲(chǔ)池(17)分別存儲(chǔ)預(yù)封裝清洗液和發(fā)光液;所述蓋片(1)和底片(11)用膠帶(20和 22)密封;所述微流控芯片測(cè)試流程中，用磁鐵操控磁顆粒移動(dòng)或聚集。
[0011]具體地，本發(fā)明所述第一生物標(biāo)記物存儲(chǔ)池(4 )、清洗液存儲(chǔ)池(14)和發(fā)光液存儲(chǔ)池(17)體積為10?500yl，優(yōu)選10?300yl，為液囊或腔體;所述微流控芯片的微混合器是寬度為20?300_，深度為10?lOOwii的蛇形，折線形或方形結(jié)構(gòu);所述微流控芯片的過濾器由腔體和濾血膜組成。
[0012]優(yōu)選地，所述微流控芯片的微混合器寬度為150WI1，深度為50WI1的方形結(jié)構(gòu)，在外部壓力作用下，可使樣本和試劑充分混合，提高反應(yīng)效率。
[0013]優(yōu)選地，所述微流控芯片的過濾器的腔體體積為樣本體積的3?10倍，優(yōu)選腔體體積為樣本體積的4?6倍。
[0014]具體地，所述微流控芯片底片中過濾器內(nèi)的濾血膜材質(zhì)可以為玻璃纖維膜，聚酯纖維膜或CytoS印膜等，優(yōu)選地，以玻璃纖維膜作為濾血膜。
[0015]具體地，本發(fā)明所述微流控芯片的過濾器具有濾除樣本雜質(zhì)的功能外，還可以將液體引導(dǎo)進(jìn)入下一級(jí)微結(jié)構(gòu)和微通道。
[0016]具體地，本發(fā)明所述微流控芯片的反應(yīng)池為一毛細(xì)管微通道，該毛細(xì)管微通道為管狀通道或矩形通道，允許微液體流進(jìn)或通過。
[0017]優(yōu)選地，所述反應(yīng)池為管狀通道，直徑為0.5?10mm;更優(yōu)選微通道的直徑為5mm， 進(jìn)一步優(yōu)選2mm或1mm。
[0018] 優(yōu)選地，所述反應(yīng)池為矩形通道，寬為0.1?5mm，深度為0.01?2mm，長為5?40mm。 [〇〇19]具體地，本發(fā)明所述毛細(xì)管通道的體積小于150yl，作為優(yōu)選，毛細(xì)管通道的體積小于lOOiil，進(jìn)一步優(yōu)選，毛細(xì)管通道體積小于50yl，低于30yl甚至更好，低于20yl甚至更好，如小于15yl，小于lOyl甚至小于5yl。
[0020]具體地，本發(fā)明所述磁顆粒標(biāo)記抗肌紅蛋白抗體使用的磁顆粒為超順磁性顆粒， 可為順磁性的Fe3〇4或y _Fe2〇3化合物，優(yōu)選Fe3〇4化合物，磁顆粒粒徑為0.1?10圓。優(yōu)選磁顆粒粒徑為1?3ym，更優(yōu)選粒徑為2.0ym的磁顆粒。
[0021]具體地，本發(fā)明所述微流控芯片蓋片和底片內(nèi)除上述主要微通道和微結(jié)構(gòu)外還有許多透氣孔和用于組裝固定的讓位孔和立柱。
[0022]具體地，所述微流控芯片蓋片上的空氣栗(3)主要是通過氣流通道(5)傳遞壓力， 主要作用是用于樣本和第一生物標(biāo)記物的混合，提高一級(jí)孵育效果。[0〇23]具體地，本發(fā)明所述微流控芯片的氣流通道尺寸為0.1?lOOwn，進(jìn)一步優(yōu)選2?50 ym〇
[0024]具體地，本發(fā)明所述微流控芯片蓋片的過渡區(qū)是蓋片和底片連接的樞紐，一級(jí)反應(yīng)混合物經(jīng)過渡區(qū)流入過濾器，實(shí)現(xiàn)了液體在微流控芯片的上下片層間的流動(dòng)。[〇〇25]本發(fā)明所述微流控芯片的反應(yīng)池內(nèi)部需進(jìn)行一定的表面改性處理，所述表面改性處理方法可為化學(xué)反應(yīng)，表面涂層，等離子處理等，從而獲得良好的親水性，促使液體樣本在毛細(xì)管作用力下流動(dòng)，快速填充微通道。
[0026]本發(fā)明中所述酶，包含但不限定于過氧化氫酶(HRP)和堿性磷酸酶(ALP)。發(fā)光基底液為酶對(duì)應(yīng)的發(fā)光底物(如魯米諾或金剛烷)和發(fā)光增強(qiáng)液(如苯衍生物等增強(qiáng)劑)，其中發(fā)光底物和發(fā)光增強(qiáng)液可合并，如圖2所示混合均勻后注入一個(gè)發(fā)光基底液存儲(chǔ)池(17);但當(dāng)混合液保質(zhì)期少于1年時(shí)應(yīng)分開，如圖4所示分別注入發(fā)光基底液存儲(chǔ)池(17)和發(fā)光基底液存儲(chǔ)池(24 )，通過預(yù)混合通道(23)混合均勻。
[0027]本發(fā)明所述微流控芯片的組裝，蓋片和底片通過密封膠帶進(jìn)行黏合，密封膠帶可為普通雙面膠，熱敏膠和壓敏膠等，作為優(yōu)選密封膠帶為熱敏膠或壓敏膠。
[0028]具體地，本發(fā)明所述清洗液，用于清洗磁顆粒，去除未參與反應(yīng)的雜質(zhì)物質(zhì)。清洗液主要包含緩沖體系、蛋白質(zhì)、表面活性劑和防腐劑，其中緩沖體系包含但不限于硼酸鹽、 磷酸鹽、Tris-HCl和醋酸鹽等。其中蛋白質(zhì)包含但不限于牛血清白蛋白、酪蛋白等；其中表面活性劑包含但不限于吐溫20、吐溫80、曲拉通X-100、聚乙二醇和聚乙烯基吡咯烷酮等。
[0029]本發(fā)明提供一種使用上述微流控芯片對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行檢測(cè)的方法，具體操作步驟包括:
[0030]步驟1)從加樣口加入樣本，將微流控芯片放入配套儀器中，從第一生物標(biāo)記物存儲(chǔ)池釋放酶或發(fā)光劑標(biāo)記抗肌紅蛋白抗體溶液后，按壓空氣栗，氣流通過氣流微通道推進(jìn)樣本流經(jīng)樣本液流通道，在微混合器與酶或發(fā)光劑標(biāo)記抗肌紅蛋白抗體溶液混合均勻反應(yīng)，形成一種免疫復(fù)合物，然后流入過渡區(qū)進(jìn)入底板過濾器中；
[0031]步驟2)樣本經(jīng)過濾器后，到達(dá)反應(yīng)池，復(fù)溶包被在該區(qū)域的磁顆粒標(biāo)記抗肌紅蛋白抗體，且與之發(fā)生反應(yīng)，接著磁鐵收集磁顆粒并移動(dòng)至清洗池，從清洗液存儲(chǔ)池釋放清洗液，磁顆粒經(jīng)充分洗滌后，在磁鐵作用下移至檢測(cè)池，從發(fā)光液存儲(chǔ)池釋放發(fā)光基底液，根據(jù)相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度(RLU)與肌紅蛋白抗原濃度間的比例關(guān)系，檢測(cè)系統(tǒng)可自動(dòng)換算，可快速報(bào)告測(cè)試結(jié)果，從而實(shí)現(xiàn)肌紅蛋白的定量檢測(cè)。
[0032]具體地，本發(fā)明所用的檢測(cè)樣品包括來自人體的全血，血清和血漿，所用樣本體積為5?200yl，優(yōu)選150yl，進(jìn)一步優(yōu)選50yl。
[0033]具體地，所述配套儀器為小型便攜設(shè)備，所述設(shè)備主要包括控制裝置和檢測(cè)裝置。
[0034]具體地，所述配套小型便攜設(shè)備的控制裝置主要作用為對(duì)放置其內(nèi)部的微流控芯片可實(shí)施包含控制液體流動(dòng)，樣本混合，釋放存儲(chǔ)池內(nèi)試劑，磁鐵移動(dòng)，檢測(cè)裝置的主要作用為采集發(fā)光信號(hào)并對(duì)其進(jìn)行分析，最終顯示檢測(cè)結(jié)果。
[0035]具體地，所述磁鐵運(yùn)動(dòng)為相對(duì)于反應(yīng)池的勾速直線運(yùn)動(dòng)或加速運(yùn)動(dòng)或減速運(yùn)動(dòng)， 勾速運(yùn)動(dòng)的速度為lmm/s?50mm/s，優(yōu)選磁鐵運(yùn)動(dòng)速度為2mm/s?30mm/s。
[0036]具體地，本發(fā)明所述便攜設(shè)備的控制裝置主要作用為對(duì)微流控芯片實(shí)施擠壓空氣栗實(shí)現(xiàn)樣本和生物標(biāo)記物的混合，控制磁鐵的運(yùn)動(dòng)實(shí)現(xiàn)磁性微球標(biāo)記抗體和一級(jí)反應(yīng)物的充分混合和磁珠的收集，控制磁鐵的運(yùn)動(dòng)實(shí)現(xiàn)反應(yīng)混合物依次在反應(yīng)池，清洗池，檢測(cè)池間的移動(dòng)，有效降低非特異性干擾。
[0037]本發(fā)明所述微流控芯片的制備方法如下:
[0038]步驟1)酶或發(fā)光劑標(biāo)記抗肌紅蛋白抗體，磁顆粒標(biāo)記抗肌紅蛋白抗體，這兩種標(biāo)記抗體可為同一種抗體或不同抗體；
[0039]步驟2)將酶或發(fā)光劑標(biāo)記抗體溶液放入蓋片的標(biāo)記抗體存儲(chǔ)池中，密封，將磁顆粒標(biāo)記抗體溶液放入底片的反應(yīng)池中，干燥，將清洗液和發(fā)光基底液分別注入清洗液存儲(chǔ)池和發(fā)光基底液存儲(chǔ)池中，密封，用膠帶(20和22)密封蓋片和底片，并組裝形成一個(gè)完整的微流控芯片。
[0040]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，所獲得的有益效果為:
[0041]1)測(cè)試前無需對(duì)樣本進(jìn)行復(fù)雜的預(yù)處理工作，且對(duì)樣本類型無局限性，全血，血清，血衆(zhòng)都在本方法中適用；
[0042]2)將磁免疫技術(shù)集成到微流控芯片上，綜合了兩種技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，使整個(gè)檢測(cè)過程具有操作簡單，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，靈敏度高的特點(diǎn)。[〇〇43]3)配合小型檢測(cè)設(shè)備和芯片內(nèi)部的簡單處理，無需復(fù)雜的栗閥和電場就能夠有效地在微流控芯片內(nèi)部實(shí)現(xiàn)液流的智能控制。
[0044]4)具有多步混合功能，在一定程度上可提高免疫反應(yīng)效率。
[0045]5)在微流控芯片上的各種反應(yīng)、清洗和檢測(cè)過程分區(qū)域進(jìn)行，集成化程度高，可有效降低非特異性干擾，提高檢測(cè)的靈敏度。
[0046]6)采用本發(fā)明所涉及微流控芯片進(jìn)行檢測(cè)，能夠快速報(bào)告檢測(cè)結(jié)果，可進(jìn)一步用于床旁檢測(cè)和各種便攜設(shè)備。[〇〇47]本發(fā)明的核心技術(shù)是將磁微粒技術(shù)、化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)技術(shù)和微流控芯片技術(shù)三者相結(jié)合，其中磁顆粒的種類、大小、通道形狀、大小等參數(shù)的細(xì)微改變都會(huì)極大影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。本發(fā)明通過微流控芯片的精細(xì)設(shè)計(jì)和加工，并配合小型便攜設(shè)備，成功實(shí)現(xiàn)了微流體在微流控芯片內(nèi)部的智能控制，通過磁鐵的作用使得磁微粒能夠在微流控芯片內(nèi)部實(shí)現(xiàn)可控的運(yùn)動(dòng)，混合，收集和清洗，提高反應(yīng)效率，降低了非特異性干擾，從而增強(qiáng)了檢測(cè)信號(hào)，提高了檢測(cè)靈敏度。本發(fā)明的技術(shù)并非三者的簡單疊加，而是集成了三者的優(yōu)勢(shì)， 在現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)上進(jìn)行了完善和改進(jìn)的一種新的用于肌紅蛋白快速定量的方法?！靖綀D說明】
[0048]圖1為微流控芯片的蓋片結(jié)構(gòu)示意圖，其中2為加樣口，3為空氣栗，4為第一生物標(biāo)記物存儲(chǔ)池，5為氣流通道，6為樣本液流通道，7為微混合器，8為儲(chǔ)液池讓位孔，9為磁鐵運(yùn)動(dòng)滑槽，10為過渡區(qū)。
[0049]圖2為微流控芯片的底片結(jié)構(gòu)示意圖，其中12為過濾器，13為反應(yīng)池，14為清洗池， 15為檢測(cè)池，16為清洗液存儲(chǔ)池，17為發(fā)光液存儲(chǔ)池，18為清洗液和發(fā)光試劑釋放通道，19 為廢液回收池。
[0050]圖3為微流控芯片的完整結(jié)構(gòu)示意圖，其中1為蓋片，11為底片，20為頂部膠帶，22 為底部膠帶。[0051 ]圖4為三個(gè)液體存儲(chǔ)池的底片結(jié)構(gòu)示意圖，其中16為清洗液存儲(chǔ)池，17和24為發(fā)光液存儲(chǔ)池，18為清洗液，23為發(fā)光液釋放通道?！揪唧w實(shí)施方式】:[〇〇52]本發(fā)明公開了一種肌紅蛋白定量檢測(cè)的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光微流控芯片，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。[〇〇53]為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面對(duì)照附圖并結(jié)合優(yōu)選【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的闡述。
[0054]實(shí)施例1:辣根過氧化物酶-魯米諾(HRP-luminol)系統(tǒng)用于肌紅蛋白的檢測(cè) [〇〇55]1.微流控芯片的制作[0〇56]1)抗體標(biāo)記:i)酶標(biāo)抗體:稱取5mg HRP溶解于lml蒸餾水中；于上液中加入0.2ml新配的0.1M NalO 4溶液，室溫下避光攪拌20分鐘;將上述溶液裝入透析袋中，對(duì)ImM pH4.4 的醋酸鈉緩沖液透析，4°C過夜；加20yl 0.2M pH9.5碳酸鹽緩沖液，使以上醛化HRP的pH升高到9.0?9.5，然后立即加入10mg肌紅蛋白抗體，在lml 0.01M碳酸鹽緩沖液中，室溫避光輕輕攪拌2小時(shí)；加0.lml新配的4mg/ml NaBH4液，混勻，再置4°C2小時(shí);將上述液裝入透析袋中，對(duì)0.15M pH7.4PBS透析，4 °C過夜;在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨，置4 °C 1小時(shí)；3000rpm離心半小時(shí)，棄上清；沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，最后沉淀物溶于少量 0.15M pH7.4的PBS中；將上述溶液裝入透析袋中，對(duì)0.15M pH7.4的PBS緩沖液透析，去除銨離子后，10,000rpm離心30分鐘去除沉淀，上清液即為酶結(jié)合物，分裝后，2-4°C保存。ii)磁標(biāo)抗體:準(zhǔn)確移取30yl濃度為lmg/ml的鏈霉親和素標(biāo)記磁珠，其中該功能化磁顆粒是以 Fe3〇4為核，聚苯乙烯為殼，粒徑為2.0wn，于2ml離心管中，渦旋震蕩30min。再加入30yl濃度為1 Oyg/ml的生物素標(biāo)記的人肌紅蛋白二抗，室溫下孵育2小時(shí)。磁性分離器除去磁珠中的液體，用0.01]\1?85(含0.01%854/0.2%恥吧口117.4)清洗3次，將磁珠懸浮于0.01]\1?85，孵育過夜，重復(fù)上述分離，清洗步驟，最終稀釋至指定濃度。[〇〇57]2)磁標(biāo)抗體的包被:采用點(diǎn)樣儀或噴點(diǎn)儀將lOiil磁性微球點(diǎn)樣在微流控芯片的反應(yīng)池中，室溫干燥30分鐘以上。
[0058]3)微流控芯片的組裝:將10yl濃度為3yg/ml的HRP，300yl清洗液，200yl發(fā)光試劑分別封裝在試劑卡的各存儲(chǔ)池內(nèi)，同時(shí)將芯片卡其他部件進(jìn)行組裝，形成一張完整的微流控芯片。[〇〇59]4)存儲(chǔ):4。(:，濕度為50%條件下保存。[〇〇6〇] 2.肌紅蛋白的定量檢測(cè)
[0061]1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作:將肌紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)品用小牛血清稀釋，配成濃度為Ong/ml，10ng/ml，25ng/ml，50ng/ml，150ng/ml，400ng/ml的肌紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)品各 150yl，取30yl加入本發(fā)明實(shí)施例中制備的微流控芯片的加樣口，蓋上血液蓋，將試劑盒置于配套的設(shè)備中，放置 15min。每個(gè)樣本分別重復(fù)測(cè)定3次。讀取器自動(dòng)顯示肌紅蛋白含量，根據(jù)肌紅蛋白的濃度及相應(yīng)的發(fā)光強(qiáng)度，取三次測(cè)定平均值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。[〇〇62]2)取待檢樣本200iU，置于本發(fā)明實(shí)施例中所制作的微流控芯片中進(jìn)行檢測(cè)，每次取樣30iU，重復(fù)測(cè)定3次，根據(jù)1)中繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得待檢樣品中肌紅蛋白的濃度。[〇〇63]3)結(jié)果表明:采用本發(fā)明所述方法，得出的檢出限為lng/ml，檢測(cè)范圍為0.5ng/ml-1000ng/ml，批間CV小于10%，批內(nèi)CV小于5%。
[0064]實(shí)施例2:堿性磷酸酶-金剛烷(ALP-AMPPD)系統(tǒng)用于肌紅蛋白的檢測(cè) [〇〇65]1.微流控芯片的制作[〇〇66]1)抗體標(biāo)記:1)酶標(biāo)抗體:2.511^八1^(5011]/11^)，加入20(^1含1.25%戊二醛的100mM的ro(pH6.8)，混勻，室溫反應(yīng)過夜;4°C條件下，電磁攪動(dòng)，透析至50mM PBS(pH7.2)， 12小時(shí)，換液4次；1.5mg肌紅蛋白抗體溶于lOOyl 1M的碳酸鹽溶液(pH9.0);將活化的AP加入配好的蛋白質(zhì)液體中，混勻，4°C條件下反應(yīng)24小時(shí)，加入10yl 200mM的賴氨酸溶液，混勻，22°C條件下反應(yīng)2小時(shí);4°C條件下透析至50mM PBS(pH7.2)，12小時(shí)，換液4次；離心，取上清，用50mM TB7.4+0.6 %BSA+0.05 %NaN3稀釋所需濃度，-20 °C保存。i i)磁標(biāo)抗體:準(zhǔn)確移取30yl濃度為lmg/ml的鏈霉親和素標(biāo)記磁珠，其中該功能化磁顆粒是以Fe3〇4為核，聚苯乙烯為殼，粒徑為2.0圓，于21111離心管中，渦旋震蕩3〇111111。再加入3(^1濃度為10邱/1111的生物素標(biāo)記的人肌紅蛋白二抗，室溫下孵育2小時(shí)。磁性分離器除去磁珠中的液體，用0.01M 1^(含0.01%834/0.2%似陶)117.4)清洗3次，將磁珠懸浮于0.0謂1^，孵育過夜，重復(fù)上述分離，清洗步驟，最終稀釋至指定濃度。
[0067]2)磁標(biāo)抗體的包被:采用點(diǎn)樣儀或噴點(diǎn)儀將lOiil磁性微球點(diǎn)樣在微流控芯片的反應(yīng)池中，室溫干燥30min以上。[〇〇68]3)微流控芯片的組裝:將10yl濃度為3yg/ml的HRP，300yl清洗液，200yl發(fā)光試劑分別封裝在試劑卡的各存儲(chǔ)池內(nèi)，同時(shí)將芯片卡其他部件進(jìn)行組裝，形成一張完整的微流控芯片。[〇〇69]4)存儲(chǔ):4°C，濕度為50%條件下保存。
[0070]2.肌紅蛋白的定量檢測(cè)
[0071]1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作:將肌紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)品用小牛血清稀釋，配成濃度為Ong/ml， 10ng/ml，25ng/ml，50ng/ml，150ng/ml，400ng/ml的肌紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)品各 150yl，取30yl加入本發(fā)明實(shí)施例中制備的試劑盒的加樣區(qū)，蓋上血液蓋，將試劑盒置于配套的設(shè)備中，放置15分鐘。每個(gè)樣本分別重復(fù)測(cè)定3次。讀取器自動(dòng)顯示肌紅蛋白含量，根據(jù)肌紅蛋白的濃度及相應(yīng)的發(fā)光強(qiáng)度，取三次測(cè)定平均值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0072]2)取待檢樣本200iU，置于本發(fā)明實(shí)施例中所制作的微流控芯片中進(jìn)行檢測(cè)，每次取樣30iU，重復(fù)測(cè)定3次，根據(jù)1)中繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得待檢樣品中肌紅蛋白的濃度。
[0073]3)結(jié)果表明:采用本發(fā)明所述方法，得出的檢出限為0.05ng/ml，檢測(cè)范圍為 0 ? 01ng/ml-1500ng/ml，批間CV小于8 ? 5%，批內(nèi)CV小于2 ? 4%。[〇〇74]實(shí)施例3:磁微粒顆粒尺寸篩選[〇〇75]磁性微球的粒徑小，比表面積大，表面含有活性基團(tuán)，故偶聯(lián)容量大，但磁顆粒尺寸過小不利于磁鐵收集，故進(jìn)行磁微粒尺寸篩選。
[0076]其他的實(shí)驗(yàn)條件參見實(shí)施例2,磁微粒顆粒的尺寸按照以下方案進(jìn)行。
[0077]選擇顆粒尺寸分別為0.1wik0.5m1、1.8M1、2iim、3iim、lOym磁顆粒標(biāo)記抗C反應(yīng)蛋白抗體。檢測(cè)時(shí)采用磁性大小經(jīng)過優(yōu)選的永磁鐵，固定磁鐵高度。[〇〇78] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
[0079]磁微粒粒徑尺寸從0.1wik0.5ym、1.8ym、2iim、3iim依次增強(qiáng)，3ym干擾加大，lOym開始減小，信號(hào)值最低，綜合各因素1.8ym信號(hào)最強(qiáng)，干擾最小。
[0080]結(jié)果分析:磁微粒尺寸較小時(shí)，比表面積較大，表面所負(fù)載的生物分子量大，同時(shí)能夠很好地分散在溶液中，但要保證磁性微球充分被收集所需的磁場強(qiáng)度大。在本實(shí)施例中由于磁珠所受的磁場力不能保證其充分被收集，導(dǎo)致部分有效磁珠在清洗過程中流失， 從而導(dǎo)致最終檢測(cè)信號(hào)值不高。當(dāng)磁顆粒粒徑較大時(shí)，比表面積小，表面生物分子的標(biāo)記率相對(duì)較低，相同條件下，磁性粒子所受磁場力大，分散的磁珠能夠得到充分的收集，但其由于極易發(fā)生沉降，導(dǎo)致生物分子間反應(yīng)不充分，從而減弱發(fā)光信號(hào)。綜合考慮，粒徑為1?3y m磁性微球效果較好，因此本發(fā)明的實(shí)施例中1.8mi的磁性微球效果最好。
[0081]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種肌紅蛋白定量檢測(cè)的磁微粒化學(xué)發(fā)光微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯 片結(jié)構(gòu)主要包括蓋片(1)和底片(11)，其中蓋片(1)上的空氣栗(3)，氣流微通道(5)，加樣口 (2)，樣本液流通道(6)，第一生物標(biāo)記物存儲(chǔ)池(4)，微混合器(7)以及過渡區(qū)(10)依次連 接;底片(11)上的過濾器(12)，反應(yīng)池(13)，清洗池(14)，檢測(cè)池(15)，溶液釋放通道(18)依 次連接;底片(11)上的檢測(cè)池(15)通過溶液釋放通道(18)與清洗液存儲(chǔ)池(16)和發(fā)光液存 儲(chǔ)池(17)連接；所述第一生物標(biāo)記物存儲(chǔ)池(4)存儲(chǔ)預(yù)封裝酶或發(fā)光劑標(biāo)記抗肌紅蛋白抗體溶液;所 述反應(yīng)池(13)存儲(chǔ)預(yù)封裝磁顆粒標(biāo)記抗肌紅蛋白抗體;所述清洗液存儲(chǔ)池(16)和發(fā)光液存 儲(chǔ)池(17)分別存儲(chǔ)預(yù)封裝清洗液和發(fā)光液;所述蓋片(1)和底片(11)用膠帶(20和22)密封。2.如權(quán)利要求1所述微流控芯片，其特征在于，所述第一生物標(biāo)記物存儲(chǔ)池(4)、清洗液 存儲(chǔ)池(16)和發(fā)光液存儲(chǔ)池(17)體積為10?500yl，為液囊或腔體;所述微流控芯片的微混 合器是寬度為20?300wii，深度為10?lOOwii的折線形或方形結(jié)構(gòu);所述微流控芯片的過濾 器由腔體和濾血膜組成;所述微流控芯片的反應(yīng)池為毛細(xì)管微通道，該毛細(xì)管微通道為管 狀通道或矩形通道，允許微液體流進(jìn)或通過。3.如權(quán)利要求2所述微流控芯片，其特征在于，所述反應(yīng)池為管狀通道，直徑為0.5? 10mm〇4.如權(quán)利要求2所述微流控芯片，其特征在于，所述反應(yīng)池為矩形通道，寬為0.1?5mm， 深度為〇.01?2mm，長為5?40mm。5.如權(quán)利要求1所述微流控芯片，其特征在于，所述磁顆粒為超順磁性顆粒，為Fe3〇4或 y -Fe2〇3化合物，磁顆粒粒徑為0.1?lOym。6.如權(quán)利要求1所述的一種肌紅蛋白定量檢測(cè)的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光微流控芯片，其特征 在于，所述樣本體積為5?200y 1。7.如權(quán)利要求1所述的一種肌紅蛋白定量檢測(cè)的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光微流控芯片，其特征 在于，所述芯片還包含配套儀器，所述配套儀器為小型便攜設(shè)備，所述設(shè)備主要包括控制裝 置和檢測(cè)裝置。
【文檔編號(hào)】G01N21/76GK205650213SQ201520828637
【公開日】2016年10月19日
【申請(qǐng)日】2015年10月26日 公開號(hào)201520828637.X, CN 201520828637, CN 205650213 U, CN 205650213U, CN-U-205650213, CN201520828637, CN201520828637.X, CN205650213 U, CN205650213U
【發(fā)明人】范玉霞, 李泉
【申請(qǐng)人】深圳華邁興微醫(yī)療科技有限公司