一種使用磁微粒化學(xué)發(fā)光定量檢測抗SS-A抗體IgG的試劑盒及其制備方法和檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及免疫學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種使用磁微粒化學(xué)發(fā)光定量檢測抗 SS-A抗體IgG的試劑盒及其制備方法和檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 抗SS-A抗體與各種自身免疫性疾病相關(guān)，常見于干燥綜合征、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、慢 性活動性肝炎患者。此外，在100 %的新生兒紅斑狼瘡中也可檢出抗SS-A抗體，抗SS-A抗體 可經(jīng)胎盤傳給胎兒，引起炎癥反應(yīng)，還可導(dǎo)致新生兒先天性屯、臟傳導(dǎo)阻滯。SS-A抗體在其他 疾病W及正常人血清中陽性率很低、抗體效價亦低，結(jié)合臨床表現(xiàn)較易鑒別。
[0003] 目前臨床上抗SS-A抗體IgG的檢測有的膜條免疫法和酶聯(lián)免疫吸附法。膜條免疫 法應(yīng)用的是膜條顯色技術(shù)，其特點為固定幾個項目在同一膜條測定，一般通過手工或者半 自動膜條儀進行實驗操作，最終通過肉眼進行定性判定，該技術(shù)靈敏度低，反應(yīng)時間長，檢 測項目只能固定搭配組合，靈活性差。酶聯(lián)免疫吸附法的靈敏度在膜條免疫法基礎(chǔ)上有所 提升，但仍然較低，并且線性范圍窄，重復(fù)性差，反應(yīng)時間也較長，仍然不能很好滿足臨床的 應(yīng)用。
[0004] 磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析法，較W前的膜條免疫法和酶聯(lián)免疫吸附法，在檢測靈 敏度、檢測范圍、檢測時間及自動化操作上有了大大提高，且沒有污染，臨床應(yīng)用廣。目前， 使用磁微?；瘜W(xué)發(fā)光分析法在抗SS-A抗體IgG免疫分析產(chǎn)品的應(yīng)用仍未見。
[0005] 中國專利CN103105489A公開了檢測自身免疫性疾病抗體的免疫印跡試劑盒及其 制備方法，設(shè)及一種檢測多種自身免疫性疾病相關(guān)抗體的免疫印跡試劑盒，解決目前尚無 用于多種自身免疫性疾病體檢篩查的免疫印跡產(chǎn)品技術(shù)上的不足:在所述的硝酸纖維素膜 或尼龍膜上含有:分別由(130魁、5111/1^\〇^、554、558、640、1〔4、14-24、了6、4魁-]\12共10種中 的至少兩種天然或重組抗原包被而成的兩條W上平行的檢測線，1條高濃度質(zhì)控帶，1條中 濃度質(zhì)控帶及1條低濃度質(zhì)控帶。該專利公開的是一種膜條免疫法，更能說明膜條免疫法存 在的靈敏度較低、線性范圍窄、重復(fù)性差和反應(yīng)時間長的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，本發(fā)明提供一種使用磁微粒化學(xué)發(fā)光定量檢測抗 SS-A抗體IgG的試劑盒，能夠低成本制備得到，且能夠?qū)崿F(xiàn)抗SS-A抗體IgG準確和高精確地 定量測定。
[0007] 本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：一種使用磁微粒化學(xué)發(fā)光定量檢測抗SS-A 抗體IgG的試劑盒，所述試劑盒包括:Anti-SS-AIgG校準品、Anti-SS-AIgG試劑1號、Anti-SS-AIgG試劑2號、Anti-SS-AIgG磁分離試劑、Anti-SS-AIgG質(zhì)控品和清洗液。
[000引所述Anti-SS-AIgG校準品包括6個液體校準瓶，所述液體校準瓶內(nèi)目標濃度分別 為0、5、20、50、100、200抓/mL的Anti-SS-AIgG和牛血清白蛋白的Tris緩沖液；
[0009] 所述Anti-SS-AIgG試劑1號為1個含有生物素標記的SS-A抗原和牛血清白蛋白的 化is緩沖液的瓶；
[0010] 所述Anti-SS-AIgG試劑2號為1個含有堿性憐酸酶標記的羊抗人多克隆抗體和牛 血清白蛋白的化is緩沖液的瓶；
[0011] 所述Anti-SS-AIgG磁分離試劑為1個含有鏈霉親和素標記的磁微粒和牛血清白 蛋白的化is緩沖液瓶；
[0012] 所述Anti-SS-AIgG質(zhì)控品包括2個質(zhì)控瓶，所述質(zhì)控瓶內(nèi)的濃度的范圍分別為： 16-24抓/mL和80-120抓/mL。
[001引所述試劑盒檢測原理為將待測樣品、所述Anti-SS-AIgG試劑巧混合溫育，樣品 中的抗SS-A抗體IgG與SS-A抗原特異性結(jié)合，再加入所述Anti-SS-AIgG磁分離試劑，抗SS-A抗體IgG與SS-A抗原的免疫復(fù)合物被吸附到磁微粒表面，洗涂去除未結(jié)合的抗體和雜質(zhì)， 加入Anti-SS-AIgG試劑2號并混合溫育。堿性憐酸酶標記(ALP)的羊抗人IgG抗體與已經(jīng)結(jié) 合在磁珠上的抗SS-A抗體IgG特異性結(jié)合。洗涂去除未結(jié)合的抗體和雜質(zhì)后加入化學(xué)發(fā)光 底物，ALP催化底物發(fā)光，測定相對發(fā)光強度(RLU)。在一定范圍內(nèi)化U與樣品中抗SS-A抗體 IgG濃度呈正比，通過RLU就可W從標準曲線上計算出待測樣品的抗SS-A抗體IgG含量。
[0014]本發(fā)明采取的又一技術(shù)方案是：一種抗SS-A抗體IgG的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光定量檢測 試劑盒的制備方法，所述試劑盒的制備方法包括W下步驟：
[001引步驟1.制備所述Anti-SS-AIgG校準品包括:Anti-SS-AIgG校準品稀釋液配制步 驟和Anti-SS-AIgG校準品配制步驟：
[0016]所述Anti-SS-AIgG校準品稀釋液的配制步驟包括：
[0017] 加800mL純化水和11.2g的Trk到容器中，攬拌混合均勻，再加8.5g的氯化鋼和2mL 的Proclin300，攬拌至完全溶解，將抑值調(diào)為7.0-7.5，加40g的牛血清白蛋白到容器中，攬 拌至完全溶解，再將pH值調(diào)為7.0-7.5,用純化水定容至1L，使用0.2皿濾器過濾，將獲得的 所述校準品稀釋液保存在2-8°C待用；
[001引所述Anti-SS-AIgG校準品的配制步驟包括：
[0019] 用上述Anti-SS-AIgG校準品稀釋液將抗SS-A抗體IgG分別配制為0、5、20、50、 100、200抓/mL共6個濃度點；
[0020] 步驟2.制備所述Anti-SS-AIgG試劑1號包括:Anti-SS-AIgG試劑1號稀釋液配制 步驟和Anti-SS-AIgG試劑1號配制步驟：
[0021] 所述Anti-SS-AIgG試劑1號稀釋液的配制步驟：
[0022] 力日800血純化水、12.1g的Tris和5.8g的化C1于1L容器中，攬拌至完全溶解，再加入 2mL的Proclin300，攬拌至完全溶解，再加入5g的牛血清白蛋白，攬拌至完全溶解，將抑值調(diào) 為7.0-7.5,用純化水定容至1L，使用0.2WI1濾器過濾，將獲得的所述試劑1號稀釋液保存在 2-8°C待用；
[0023] 所述Anti-SS-AIgG試劑1號的配制步驟：
[0024] 用0.2mol/L的抑9.0碳酸鹽緩沖液配制0.5mg/mL的生物素溶液，按照SS-A抗原與 生物素溶液質(zhì)量比為10:1的比例在SS-A抗原溶液中加入到上述0.5mg/mL的生物素溶液，混 合均勻，室溫靜置1她，反應(yīng)生成SS-A抗原-生物素連接物的反應(yīng)液，將得到的SS-A抗原-生 物素連接物反應(yīng)液通過G-25凝膠柱進行分離，除去未反應(yīng)的生物素，得到SS-A抗原-生物素 連接物，再用所述試劑1號稀釋液將SS-A抗原-生物素連接物稀釋到0.1-0.化g/mL，得到所 述的試劑1號；
[00巧]步驟3.制備所述Anti-SS-AIgG試劑2號包括:Anti-SS-AIgG試劑2號稀釋液配制 步驟和Anti-SS-AIgG試劑2號的配制步驟：
[0026] 所述Anti-SS-AIgG試劑2號稀釋液的配制步驟：
[0027] 力日800mL純化水、6.06g的4-徑乙基贓嗦乙橫和8.5g的化C1到容器中，攬拌至完全 溶解，再加入5g的牛血清白蛋白、O.lg的化Cl2、0.2血的Proclin300和O.lg的MgCl2,攬拌至 完全溶解，將抑值調(diào)為7.5-8.0,用純化水定容至1L，使用0.2皿濾器過濾，將獲得的所述試 劑2號稀釋液保存在2-8°C待用；
[002引所述Anti-SS-AIgG試劑2號的配制步驟：
[0029] 將Img的羊抗人抗體和2-4化的lOmg/mL的偶聯(lián)劑為2-亞胺四氨嚷吩溶液，室溫靜 置20min，加入0.Imol/L的甘氨酸溶液10化，室溫靜置5min，用G-25凝膠柱除鹽，收集活化后 抗體，將活化后的抗體保存在2-8°C備用，取1.5mg的堿性憐酸酶，加入5mg/mL的4-(N-馬來 酷亞胺基甲基)環(huán)己燒-1-簇酸班巧酷亞胺醋溶液10-2化L，室溫靜置30min，用G-25凝膠柱 除鹽，收集活化后堿性憐酸酶，將活化后的堿性憐酸酶保存在2-8°C備用，再將上述活化的 羊抗人抗體與活化的堿性憐酸酶混合，在2-8°C條件下靜置12-24h，用Supperdex200凝膠純 化柱純化，獲得羊抗人抗體-堿性憐酸酶連接物濃溶液，置于2-8°C保存?zhèn)溆?，將羊抗人?體-堿性憐酸酶連接物濃溶液用所述試劑2號稀釋液稀釋到0.02-0.lyg/mL，得到所述的試 劑2號；
[0030] 步驟4.制備所述Anti-SS-AIgG磁分離試劑包括:Anti-SS-AIgG磁分離試劑稀釋 液配制步驟和Anti-SS-AIgG磁分離試劑配制步驟：
[0031] 所述Anti-SS-AIgG磁分離試劑稀釋液配制步驟：
[0032] 力日800血純化水、12.1g的Tris和8.5g的化C1到容器中，攬拌至完全溶解，再加5g的 牛血清白蛋白、50mL的新生牛血清和0.2mL的Proclin300，攬拌至完全溶解，將pH值調(diào)為 7.9-8.1，用純化水定容至1L，使用0.2μπι濾器過濾，將獲得的所述磁分離試劑稀釋液保存在 2-8°C待用；
[0033] 所述Anti-SS-AIgG磁分離試劑配制步驟：
[0034] 取100111旨磁微粒，磁分離去上清，取用0.025111〇1/1^如巧直為4.5-6的2-嗎嘟乙橫酸 緩沖液10血重懸，室溫下混勻2~化，加入0.5-1 .OmL新配制的濃度為lOmg/血的碳二亞胺和 N-徑基硫代班巧酷亞胺的嗎嘟乙橫酸緩沖液，室溫振蕩混懸30-60min，使磁珠充分活化，磁 分離，去上清，用0. 〇25mol/L的抑值為4.5-6的2-嗎嘟乙橫酸緩沖液10血重懸，加入4-8mg的 鏈霉親和素，室溫混懸16-2化，再進行磁分離，去上清，用百分比濃度0.5%的牛血清白蛋 白，百分比濃度0.5%脫脂奶粉和百分比濃度0.05%吐溫-