專利名稱：用于監(jiān)測(cè)dna聚合酶鏈反應(yīng)的儀器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生化分析，更具體地說是涉及聚合酶鏈反應(yīng)過程中DNA的定量監(jiān)測(cè)。
背景聚合酶鏈反應(yīng)是一個(gè)放大或增加雙鏈脫氧核糖核酸(DNA)數(shù)量的方法。在PCR裝置中，一個(gè)熱循環(huán)塊上有一個(gè)或多個(gè)用于放置裝有反應(yīng)物懸浮液的小瓶的小孔，以DNA的“種子”樣品為起點(diǎn)開始反應(yīng)來(lái)生成更多的DNA。在水懸浮液的起始成份中，除了種子樣品外，還包含有所選擇的DNA引物鏈、DNA元件、酶及其他的化學(xué)制品。循環(huán)塊溫度在一個(gè)相對(duì)低溫的約為60℃的PCR反應(yīng)延伸段和一個(gè)約為95℃的高溫變性階段之間循環(huán)，在擴(kuò)展階段期間所有的DNA鏈已結(jié)合成了雙鏈，在變性階段期間DNA發(fā)生了變性或分解成單鏈。這樣每經(jīng)過一次循環(huán)，DNA量就翻番了，這就提供了從少量開始大量復(fù)制DNA的一種方法。例如在第4683202號(hào)的美國(guó)專利中就記載有PCR過程。
對(duì)PCR過程中DNA的生產(chǎn)已有了定量的測(cè)量方法以測(cè)量出開始的數(shù)量和生成的數(shù)量。在下列的文獻(xiàn)均記載有有關(guān)的測(cè)量和計(jì)算技術(shù)第5766889號(hào)美國(guó)專利(Atwood)；在Bio/Technologyvol.11,pp.1026-1030(1993年9月)上登載的由Russel Higuchi,etal.撰寫的題為“動(dòng)態(tài)PCR分析實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)DNA擴(kuò)增反應(yīng)”的文章；在Analytical Biochemistry Vol.245,pp.154-160(1997)登載的由Kirk M.Ririe,et al.撰寫的題為“通過分析聚合酶鏈反應(yīng)中的解鏈曲線區(qū)別產(chǎn)物”的文章。
在現(xiàn)有的測(cè)量技術(shù)中，已采用了微量熒光計(jì)(分光熒光計(jì))和帶有照明燈泡的視頻攝像機(jī)的簡(jiǎn)單裝置。這種裝置使用有雙鏈DNA時(shí)會(huì)發(fā)出熒光的染料。這些技術(shù)和儀器不是特別適合于用于反應(yīng)的常規(guī)測(cè)量的PCR裝置。也需要提高監(jiān)測(cè)和測(cè)量的精度?，F(xiàn)有的可以實(shí)時(shí)采集和分析PCR數(shù)據(jù)的儀器不具有所需要的動(dòng)態(tài)范圍；沒有內(nèi)置的校準(zhǔn)部件；不可以帶著樣品孔帽進(jìn)行操作；或者非常昂貴。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種新型的用于對(duì)PCR裝置中的DNA復(fù)制進(jìn)行定量監(jiān)測(cè)的光學(xué)儀器。其他的目的是提供具有下述特點(diǎn)的一種儀器動(dòng)態(tài)范圍得到改進(jìn)、可自動(dòng)選擇照射時(shí)間以擴(kuò)展動(dòng)態(tài)范圍、自動(dòng)進(jìn)行漂移校正、操作簡(jiǎn)單、相對(duì)低成本、易于針對(duì)不同的熒光染料而調(diào)整光學(xué)元件。
概述采用本文所述的一種用于監(jiān)測(cè)DNA聚合酶鏈反應(yīng)復(fù)制的光學(xué)儀器便可至少部分地實(shí)現(xiàn)前述的和其他的目的。復(fù)制是在一個(gè)反應(yīng)裝置中進(jìn)行的，所述反應(yīng)裝置包含一個(gè)至少有一個(gè)裝有反應(yīng)成份懸浮液小瓶的熱循環(huán)塊。反應(yīng)成份中包含一種與DNA存在成比例的熒光染料。
所述儀器包含一個(gè)光源、引導(dǎo)光束部件、光探測(cè)器和用于處理數(shù)據(jù)信號(hào)的部件。光源所發(fā)射的光源光束包含至少一個(gè)使染料以某一發(fā)射頻率發(fā)出熒光的基本激發(fā)頻率。設(shè)置的第一部件接收具有激發(fā)頻率的可成為激發(fā)光束的光源光束。設(shè)置基本聚焦部件來(lái)使激發(fā)光束聚焦到各個(gè)懸浮液中，以使基本染料發(fā)出具有發(fā)射頻率的發(fā)射光束，該光束的強(qiáng)度代表著各個(gè)懸浮液中的DNA的濃度。聚焦部件接收并透過發(fā)射光束。設(shè)置的第二部件接收來(lái)自聚焦部件的發(fā)射光束以便于進(jìn)一步使具有發(fā)射頻率的發(fā)射光束通過另一個(gè)將發(fā)射光束聚焦到探測(cè)器的聚焦部件處。探測(cè)器便產(chǎn)生了代表著發(fā)射光束進(jìn)而也代表著各個(gè)小瓶中的DNA濃度的基本信號(hào)。處理器可接收基本的數(shù)據(jù)信號(hào)并計(jì)算和顯示DNA的濃度。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，第一部件和第二部件共有一分光器，該分光器接收成為激發(fā)光束的光源光束，同時(shí)接收發(fā)射光束并使之通過而到達(dá)探測(cè)器。循環(huán)塊可包含多個(gè)小瓶，聚焦部件包含有多個(gè)相對(duì)應(yīng)的置于小瓶上方的小瓶透鏡以使發(fā)射光束中含有對(duì)應(yīng)于各個(gè)小瓶的獨(dú)立光束。聚焦部件還可進(jìn)一步包含有一個(gè)例如菲涅耳透鏡的物鏡，該物鏡與小瓶透鏡一起使激發(fā)光束聚焦到各個(gè)懸浮液中，還使各獨(dú)立光束通過而到達(dá)第二部件(分光器)。探測(cè)器最好包含一光感受器陣列以接收各獨(dú)立光束進(jìn)而產(chǎn)生相應(yīng)的數(shù)據(jù)信號(hào)，以便于處理部件計(jì)算出各個(gè)小瓶中的DNA濃度。
儀器還應(yīng)在光源和分光器間設(shè)置一個(gè)激發(fā)濾光器，而在分光器和探測(cè)器之間設(shè)置一個(gè)發(fā)射濾光器。分光器和濾光器與懸浮液中所選用的基本染料有關(guān)。在一個(gè)改進(jìn)的實(shí)施方案中，在一個(gè)濾光模塊中包含有分光器和濾光器，且該模塊可從空腔中移開而替換為另一個(gè)與另一種基本染料相應(yīng)的模塊。
作為參比，一熒光參比元件發(fā)出相應(yīng)于激發(fā)光束的參比光束。設(shè)置參比來(lái)接收來(lái)自第一部件的一部分激發(fā)光束。一部分參比光作為參比光束通過第二部件而到達(dá)探測(cè)器，以便于產(chǎn)生用于計(jì)算DNA濃度的參比信號(hào)。參比元件最好包含多個(gè)參比發(fā)射器，每個(gè)發(fā)射器所發(fā)射的參比光束具有相應(yīng)于激發(fā)光束的不同強(qiáng)度，以便于處理器對(duì)含有最大數(shù)據(jù)信號(hào)的參比組進(jìn)行篩選，所述的最大數(shù)據(jù)信號(hào)小于一個(gè)預(yù)先設(shè)定的最大值而該設(shè)定值又小于飽合極限。
探測(cè)器與其處理部件結(jié)合成一整體，累計(jì)在預(yù)定的照射時(shí)間內(nèi)發(fā)射光來(lái)的輸入，并產(chǎn)生一套數(shù)據(jù)信號(hào)，處理部件或探測(cè)器或二者的結(jié)合體對(duì)數(shù)據(jù)信號(hào)有一飽合極限。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，處理部件含有用于自動(dòng)完成照射時(shí)間調(diào)節(jié)的調(diào)整部件，通過這種調(diào)節(jié)可以使基本數(shù)據(jù)保持在一預(yù)定的工作范圍之內(nèi)，也就是使與之相應(yīng)的數(shù)據(jù)信號(hào)小于飽合極限，處理部件還含有用于校正基本數(shù)據(jù)使之與照射時(shí)間調(diào)節(jié)成比例的部件。處理器最好針對(duì)來(lái)自各個(gè)光感受器的數(shù)據(jù)信號(hào)計(jì)算出相應(yīng)的光接收數(shù)據(jù)，用調(diào)整元件來(lái)確定出最大的光接收數(shù)據(jù)，再確定該最大數(shù)據(jù)是小于、大于還是處在預(yù)定的工作范圍之內(nèi)，基于上述的判斷來(lái)確定是加大、減小還是維持照射時(shí)間以便于所實(shí)施的照射時(shí)間可以使隨后的光接收數(shù)據(jù)落在預(yù)定的工作范圍之內(nèi)。
附圖的簡(jiǎn)要說明

圖1是一本發(fā)明中所述的與聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)裝置有關(guān)的光學(xué)儀器的光路圖。
圖2是如圖1所示儀器在挪去其側(cè)面板后的透視圖。
圖3是圖2中所示模塊的分解透視圖。
圖4是圖1中所示光路中的一個(gè)參考元件的透視圖。
圖5表示的是利用圖1所示儀器獲得的數(shù)據(jù)計(jì)算DNA濃度的流程圖。
圖6表示的是一個(gè)用于確定在圖1所示儀器運(yùn)作中獲取數(shù)據(jù)的照射時(shí)間以及用于圖5所示流程中的計(jì)算的流程圖。
圖7是由圖1所示儀器以及PCR裝置運(yùn)行中所得的熒光對(duì)循環(huán)的延伸期數(shù)據(jù)圖。
圖8是一表示計(jì)算用于圖5所示流程圖中計(jì)算的附屬數(shù)據(jù)的流程圖。
圖9表示的是一個(gè)用于計(jì)算圖4所示的參考元件中的多個(gè)參考發(fā)射極部分間比值的流程圖。
詳細(xì)描述采用本發(fā)明中所述的光學(xué)儀器A或是將該光學(xué)儀器與通過聚合酶鏈反應(yīng)(“PCR”)來(lái)復(fù)制(“擴(kuò)增”)所選擇的DNA片段的反應(yīng)裝置B相結(jié)合使用。反應(yīng)裝置是常規(guī)裝置，且該裝置在不受用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)復(fù)制過程中DNA數(shù)量的儀器干擾的情況下應(yīng)能正常工作。在第5475610號(hào)和第5656493號(hào)的美國(guó)專利中記載有適用的反應(yīng)裝置。
采用的是常規(guī)反應(yīng)裝置(圖1中)，該反應(yīng)裝置有兩個(gè)主要部件即帶有用于放置至少一個(gè)小瓶1b的小孔1a的熱循環(huán)塊1，在所述的小瓶中盛放著反應(yīng)成份的懸浮液；以及通過一定的控溫程序來(lái)控制循環(huán)塊的循環(huán)溫度的熱循環(huán)控制器1c。水懸浮液樣品中的初始成份包括一份DNA的“種子”樣品，所選取的DNA引物鏈，DNA元件，酶以及其他的化學(xué)制劑。通過電學(xué)部件、液體或氣體冷卻劑、或它們的組合、或用以完成所述循環(huán)的其他部件按照一定的循環(huán)程序來(lái)對(duì)循環(huán)塊(一般是用鋁制成的)進(jìn)行加熱和冷卻。因此，小瓶中的懸浮液在兩個(gè)溫度段間循環(huán)以影響聚合酶鏈反應(yīng)。這兩個(gè)溫度段中，一個(gè)是相對(duì)低的約為60℃的PCR反應(yīng)的延伸階段，在這一溫度段DNA鏈已結(jié)合成了雙鏈；另一是約為95℃的高溫變性階段，在此溫度段內(nèi)DNA發(fā)生變性或分解成單鏈。
為了達(dá)到本目的，樣品中還含有熒光染料，該熒光染料可相應(yīng)地發(fā)出熒光且在雙鏈DNA出現(xiàn)時(shí)由于熒光染料鍵聯(lián)使得熒光發(fā)射加強(qiáng)，例如SYBR Green染料(購(gòu)自Molecular Probes,Inc.,Eugene，Oregon)在雙鏈DNA出現(xiàn)時(shí)就發(fā)出熒光。也可采用標(biāo)記“探針”的另一種熒光染料，該染料具有與所選取的DNA鏈部分的互補(bǔ)序列相類似的結(jié)構(gòu)。也可采用具有相似特性的其他染料。如這里以及權(quán)利要求中所說，詞語(yǔ)“標(biāo)記染料”指的是與雙鏈DNA相連接的類型劑、或探針類型、或與DNA相連接的其他類型的染料，以使所發(fā)熒光與DNA的數(shù)量成比例。樣品中還可含有其他的不活潑染料(不依賴于DNA)來(lái)作為下述的一種參照物。在一具有適當(dāng)激發(fā)頻率的光的照射下，染料通常以一低于激發(fā)光頻率的發(fā)射頻率來(lái)發(fā)出熒光。
在一整體塑料盤上成形出許多圓錐狀的小瓶，如以12乘8的陣列排列形成96個(gè)小瓶。該盤最好能從循環(huán)塊上移開以便于做準(zhǔn)備工作?？捎靡粠в行∑棵?d的整體塑料蓋放在或連在小瓶上以防止污染和蒸發(fā)損失。也可采用其他方法來(lái)達(dá)到這一目的，例如可在樣品表面上涂油，這種情況下就不需要使用瓶帽了。如使用瓶帽，該瓶帽對(duì)所用儀器中采用的光來(lái)說是透明的，而且瓶帽的凸面朝上。
監(jiān)測(cè)儀器安裝在裝有小瓶的循環(huán)塊上方。儀器可以移開或轉(zhuǎn)開以接近小瓶。在儀器底部有一壓盤2，該壓盤2放在瓶帽上，如果沒有瓶帽就直接放在小瓶上。壓盤最好用鋁制成，在壓盤上有一個(gè)陣列的孔2a，穿過這些孔與小瓶相連，每個(gè)孔的直徑大約與小瓶頂部直徑相等。如果有瓶帽，應(yīng)采用薄膜加熱器或其他的方法來(lái)充分加熱壓盤使保持其溫度，這是為了防止在瓶帽下面發(fā)生凝結(jié)而干擾小瓶?jī)?nèi)的DNA復(fù)制，例如可將使壓盤保持在一個(gè)溫度，該溫度略高于熱循環(huán)器所達(dá)到的最高的樣品溫度。
在每個(gè)小瓶的上方放置有一透鏡2b，使該透鏡的焦點(diǎn)近似聚焦在小瓶中的懸浮液中。在上述透鏡的上方有一物鏡3以形成一遠(yuǎn)心光路系統(tǒng)。物鏡最好是一個(gè)經(jīng)非球面校正的菲涅耳透鏡以使變形最小。為了校正照明與成像間的不一致性，可在物鏡上或接近物鏡處安裝一中灰光柵(neutral density pattern)(圖中未標(biāo)出)，例如使光在像場(chǎng)的中心變細(xì)。為了便于包裝可將一折向光學(xué)平面鏡以45°的傾斜角度安裝。這一點(diǎn)可以被忽略，也可以使用其他類似的折向光學(xué)器件。物鏡和/或小瓶透鏡均可以由兩個(gè)或更多個(gè)透鏡組成以達(dá)到所要求的聚焦作用，這里所說的“透鏡”包含上述的透鏡組合。
用于提供光束20的光源11可以例如是一個(gè)100瓦的鹵素?zé)?。最好將光源安裝在一橢圓形反射器11a的焦距處，這樣可以使所需區(qū)域內(nèi)光束均勻。該反射器最好應(yīng)具有二向色性，也就是說大體上可使可見光反射而使紅外光透過，以限制來(lái)自其他光學(xué)部件和儀器過熱所產(chǎn)生的紅外光。還可通過設(shè)在光路中的一熱反射平面鏡13來(lái)進(jìn)一步輔助完成上述功能。一個(gè)機(jī)械或電學(xué)光閘12可以遮住光束以獲得暗數(shù)據(jù)。對(duì)光源的類型并沒有限制，也可以采用例如投影燈或激光等帶有適當(dāng)光學(xué)器件的其他類型的光源。
設(shè)置一分光器6來(lái)接收光束20。在該實(shí)施方案中使用的是二向色性的反射器，以使該以45°的傾斜角度安裝的反射器所反射的光具有一定的激發(fā)頻率以使標(biāo)記染料以某一發(fā)射頻率發(fā)出熒光，而透過該反射器的光正具有這一發(fā)射頻率。這一常規(guī)的光學(xué)裝置一般是利用光干涉層來(lái)達(dá)到一定的頻率特性。
放置分光器以使其將來(lái)自光源的光束反射到折疊式平面鏡上。從分光器反射的光源光束就成為了大體具有激發(fā)頻率的激發(fā)光束22。激發(fā)光束經(jīng)物鏡3聚焦后作為獨(dú)立光束24通過小瓶(孔)透鏡2b進(jìn)入小瓶的中心部。因此引發(fā)標(biāo)引染料以某一發(fā)射頻率發(fā)射光。所發(fā)射的光作為發(fā)射光束以獨(dú)立光束26的形式向上傳輸，經(jīng)折疊式平面鏡5反射到分光器6，發(fā)射光束透過分光器后到達(dá)探測(cè)器10。
小瓶透鏡2b和物鏡3構(gòu)成了一基本聚焦部件用于使激發(fā)光束和發(fā)射光束聚焦。另一方面，也可以忽略物鏡以使聚焦部件僅僅由小瓶透鏡2b組成。另外，也可忽略小瓶透鏡以使僅僅由物鏡組中的一個(gè)接物鏡組成的聚焦部件將個(gè)體發(fā)射光束聚焦到探測(cè)器上。
另外，還可通過適當(dāng)?shù)刂匦虏贾霉庠礋艉吞綔y(cè)器，以使透過分光器6的光源光束作為激發(fā)光束，而分光器反射的是發(fā)射光束。而且，也可采用更適合于分光器的其他角度而不一定是45°，例如采用一可使反射和透射更垂直的角度。更廣義地說，分光器是將光路分成了激發(fā)光光路和發(fā)射光光路，因此其他能達(dá)到此目的光路都可以被采用。人們還希望到達(dá)探測(cè)器的光源光束最少，而二向色性裝置就有助于達(dá)到此目的。也可以使用非二向色性的分光器，但其工作效率將比較低，這是由于較多的光源光束可能到達(dá)探測(cè)器，或可能以錯(cuò)誤的方向被反射或傳輸而丟失。
為了更好地過濾光源光束，在光源11和分光器6之間放置一激發(fā)濾光器7。這一濾光器可使具有激發(fā)頻率的光束通過，且大體上能擋住具有發(fā)射頻率的光束。類似地，在分光器和探測(cè)器之間放置了一發(fā)射濾光器8，具體地說是放置在分光器和一個(gè)置于探測(cè)器之前的監(jiān)測(cè)透鏡9之間。這一濾光器可使具有發(fā)射頻率的光束通過，且大體上能擋住具有激發(fā)頻率的光束。雖然應(yīng)優(yōu)先采用探測(cè)透鏡，但也可用一聚焦反射器來(lái)代替該監(jiān)測(cè)透鏡?？蓪⑦@樣的一個(gè)發(fā)射聚焦部件(探測(cè)透鏡或反射器)放置在分光器之后(如圖所示)或之前且可在發(fā)射濾光器的任一側(cè)，另外也可將其結(jié)合到基本聚焦部件中去。例如，物鏡可以是接物鏡而將發(fā)射光束聚焦到探測(cè)器上。
合適的濾光器是常規(guī)的采用光學(xué)干涉膜的光學(xué)帶通濾光器，分別具有一個(gè)最適合于熒光染料激發(fā)頻率或其發(fā)射頻率的通頻帶。每個(gè)濾光器對(duì)其他頻率(非通帶)應(yīng)具有非常高的衰減率，以防止由反射和散射光形成的“偽”像。例如，對(duì)于SYBR Green染料，激發(fā)濾光器的通頻帶應(yīng)以與約485nm波長(zhǎng)相對(duì)應(yīng)的頻率為中心，發(fā)射濾光器的通頻帶應(yīng)以與約555nm波長(zhǎng)相對(duì)應(yīng)的頻率為中心。分光器應(yīng)在上述兩個(gè)頻率之間以產(chǎn)生由反射到傳輸?shù)霓D(zhuǎn)變，例如，約為510nm，以使小于這個(gè)波長(zhǎng)的光被反射而大于這個(gè)波長(zhǎng)的光通過。
更廣義地說，激發(fā)濾光器和分光器一起構(gòu)成了用于接收光源光束以形成一具有激發(fā)頻率的激發(fā)光束的第一部件，發(fā)射濾光器和分光器一起構(gòu)成了用于接收來(lái)自聚焦部件的發(fā)射光束以使具有發(fā)射頻率的發(fā)射光束通過而到達(dá)探測(cè)器的第二部件。如上所述，分光器也可以使透過的光源光束作為激發(fā)光束，而將發(fā)射光束反射到探測(cè)器。另一方面，也可以略掉濾光器，由分光器來(lái)代表第一部件來(lái)從光源光束中形成激發(fā)光束，且由分光器來(lái)代表第二部件以使發(fā)射光束通過而到達(dá)探測(cè)器。
在另一布置中，也可以略掉分光器，第一部件由適于激發(fā)頻率的激發(fā)濾光器構(gòu)成，第二部件由適于發(fā)射頻率的第二濾光器構(gòu)成，光源和探測(cè)器并排放置以使激發(fā)光束光路與發(fā)射光束光路角度稍有不同。實(shí)際上，如果使用一個(gè)或多個(gè)折疊式平面鏡，光源和探測(cè)器就不必并排放置了。因此，只要能獲得這里所述效果的光路布置都被認(rèn)為是等同的。但是，最好使用分光器以使通過物鏡的激發(fā)光束和發(fā)射光束具有相同的光學(xué)路徑。
分光器6，激發(fā)濾光器7和發(fā)射濾光器8最好固定在模塊30(圖2所示)中，該模塊與給懸浮液所選的基本染料有關(guān)。模塊可從儀器A的空腔32中移開，這個(gè)模塊便可以用含有不同的分光器和濾光器與另一種所選的基本染料相關(guān)的另一個(gè)模塊來(lái)代替。該儀器包含一個(gè)燈泡子腔33和一個(gè)照相子腔35。
在一個(gè)例子(如圖3所示)中，各個(gè)模塊包含一個(gè)帶有法蘭36的裝配塊34，因而可用一個(gè)螺釘38將法蘭固定到空腔上的。使用一個(gè)框架40和螺釘42將分光器6以45℃的傾斜角度安裝在裝配塊上。發(fā)射濾光器8固定在裝配塊上(如，可用粘結(jié)劑)類似地將激發(fā)濾光器7裝配到一個(gè)裝配元件44上，再用螺釘46將所述裝配元件安裝到裝配塊上。組件裝好后，用一螺接的側(cè)板47將儀器封閉起來(lái)。定位釘(未示出)確?？梢灾貜?fù)裝配。替代組件含有相同的裝配塊和有關(guān)元件，以及更換了的分光器和濾光器。
探測(cè)透鏡9(如圖1中所示)與小瓶透鏡2b和物鏡3一起使個(gè)體光束聚焦到了探測(cè)器10上。這些透鏡應(yīng)具有大孔徑、低變形和最小暈映。
探測(cè)器最好是一陣列型探測(cè)器，例如電荷射入裝置(CID)或最好為電荷耦合裝置(CCD)。含有CCD探測(cè)器、探測(cè)透鏡和與探測(cè)器有關(guān)的電子器件的常規(guī)視頻攝像機(jī)應(yīng)該都適用，例如Electrim model1000L，這種型號(hào)具有751個(gè)有效水平像素和242(非交錯(cuò)的)個(gè)有效垂直像素。這種攝像機(jī)包含有一直接與計(jì)算機(jī)ISA總線接口的電路板。并不要求攝像機(jī)含有幀接收器電路系統(tǒng)。實(shí)際上，可以采用任何其他的數(shù)字成像裝置或子系統(tǒng)，只要該裝置或子系統(tǒng)能夠攝取用于在計(jì)算機(jī)中進(jìn)行后期處理的靜止或定格圖像即可。
如果有許多個(gè)小瓶，那么最好選用帶有許多光感受器(像素)的探測(cè)器以做到對(duì)各個(gè)小瓶分別監(jiān)測(cè)。另外，也可使用帶有單個(gè)光感受器的掃描裝置，例如通過掃描折向平面鏡以及對(duì)探測(cè)器采用小孔徑掃描。如果只有一個(gè)小瓶，也可使用諸如光電倍增管一類的簡(jiǎn)單裝置。CCD接收所選取合成階段的光，且在模/數(shù)轉(zhuǎn)換之后讀出在這一階段的累積水平上的數(shù)字信號(hào)數(shù)據(jù)。利用一電子光柵便可對(duì)合成進(jìn)行有效控制，還希望有一畫面?zhèn)魉碗娐?。?duì)于各個(gè)像素點(diǎn)都生成有相應(yīng)的信號(hào)數(shù)據(jù)，其中包含那些接收來(lái)自小瓶的個(gè)體被發(fā)射光束的像素。
儀器最好包含一熒光參比元件4，該元件發(fā)射響應(yīng)于激發(fā)光束的參比光束。參比元件最好由多個(gè)參比發(fā)射器組成，例如由6個(gè)組成，每個(gè)發(fā)射出一個(gè)響應(yīng)于激發(fā)光束的具有不同強(qiáng)度的參比光束。上述強(qiáng)度的范圍應(yīng)近似于小瓶中標(biāo)引染料所預(yù)計(jì)具有的強(qiáng)度范圍；例如可以約2.5的系數(shù)按亮度大小分成幾部分。
設(shè)置這一參比元件來(lái)接收來(lái)自分光器的一部分激發(fā)光束。一個(gè)理想的放置位置是在臨近物鏡處，以使與該元件有關(guān)的光路接近于與小瓶有關(guān)的光路。大部分參比光透過分光器作為到探測(cè)器的參比光束。探測(cè)器像素接收發(fā)射光束以產(chǎn)生與數(shù)據(jù)信號(hào)一起用于DNA的濃度計(jì)算的參比信號(hào)。
參比元件4(如圖4中所示)最好包含一成形熒光帶4a和一裝配在熒光帶上的中密度濾光器4b，在這兩者之間可選擇地性留有一空間4h，以使一部分激發(fā)光束和參比光束通過中密度濾光器后變細(xì)。中密度濾光器具有一密度系列4c以適應(yīng)于發(fā)射不同強(qiáng)度參比光束的多個(gè)參比發(fā)射器(段)。一個(gè)加熱帶4d和一個(gè)用以使加熱平緩的鋁帶4g裝配在一槽4e內(nèi)的底部，熒光帶裝配在位于加熱帶之上的鋁帶上。為了防止熱量損失，最好用一透明的有機(jī)玻璃窗(在圖中未標(biāo)以便于顯示密度變化的濾光器)將該裝置遮蓋住。為了有助于保持定量的熒光，通過控制加熱帶而抵消掉循環(huán)塊的熱循環(huán)及其他因素對(duì)熒光帶的影響而使熒光帶維持在一恒定溫度。上述設(shè)置是由于大多數(shù)熒光物質(zhì)的熒光性與溫度呈反比變化。
計(jì)算機(jī)處理器14(圖1)可以是普通的PC機(jī)。計(jì)算程序也是例如用“C”編成的常規(guī)程序。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說能夠較容易地獲得適合于本發(fā)明的程序。處理器選擇性地處理像素所接收的來(lái)自小瓶和參比發(fā)射器的光信號(hào)，而忽略掉背景光。因此，所述程序最好包含用于確定像素有意義區(qū)域的掩模，例如可采用在等審中的于98年7月14日申請(qǐng)的申請(qǐng)序列號(hào)為60092785的屬于本受讓人的臨時(shí)性專利申請(qǐng)中公開的內(nèi)容?？赡芄鈱W(xué)元件的機(jī)械排列對(duì)于協(xié)力將光束聚焦到所編程序定義的有意義區(qū)域內(nèi)來(lái)說也是必要的。模擬數(shù)據(jù)信號(hào)經(jīng)過模/數(shù)(A/D)轉(zhuǎn)換器15后輸入到處理器，所以模/數(shù)轉(zhuǎn)換器被認(rèn)為是處理器的一部分。通過探測(cè)器或A/D來(lái)禁止達(dá)到飽合水平，或者最好使CCD動(dòng)態(tài)范圍與A/D的動(dòng)態(tài)范圍相匹配。一個(gè)合適的范圍是8比特的精度(256級(jí))，設(shè)定CCD放大器的偏移量以使CCD(光閘12被閉合)的暗信號(hào)輸出落在A/D范圍之內(nèi)。處理器按選定的照射時(shí)間給探測(cè)器發(fā)指令以保持輸出落在動(dòng)態(tài)范圍之內(nèi)。
在一個(gè)典型例子中，對(duì)熱循環(huán)中DNA反應(yīng)復(fù)制序列的每個(gè)循環(huán)，一般為40至50個(gè)循環(huán)從多個(gè)小瓶(如96個(gè)有意義區(qū))和參比發(fā)射器部分采集熒光數(shù)據(jù)，對(duì)約為60℃的PCR反應(yīng)延伸階段的每個(gè)熱循環(huán)周期采集兩組數(shù)據(jù)，在所述延伸階段所有的DNA鏈結(jié)合成雙鏈。一組數(shù)據(jù)是正常的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)50(與下述的參比數(shù)據(jù)一起)，另一組是機(jī)械光閘閉合時(shí)的暗信號(hào)數(shù)據(jù)51這兩組數(shù)字?jǐn)?shù)據(jù)50、51分別是由來(lái)自探測(cè)器的兩組模擬數(shù)據(jù)信號(hào)48、49經(jīng)A/D15轉(zhuǎn)換而得到。55中從基礎(chǔ)數(shù)據(jù)中減去暗數(shù)據(jù)而得到暗校正數(shù)據(jù)57。在一簡(jiǎn)單步驟中實(shí)行的是像素與像素相減。另外，也可以從相應(yīng)的熒光總數(shù)中減去各個(gè)有意義區(qū)域的總的暗數(shù)據(jù)。在另一例子中，為了增加有效的動(dòng)態(tài)范圍，在每次照射期間最好采集例如4或8等多個(gè)照射量。這可以通過對(duì)每個(gè)像素采集多個(gè)正常照射數(shù)據(jù)和暗信號(hào)數(shù)據(jù)，分別從正常數(shù)據(jù)中減去相應(yīng)的暗數(shù)據(jù)，然后將相減所得的數(shù)據(jù)相加以得到基礎(chǔ)數(shù)據(jù)來(lái)實(shí)現(xiàn)。這樣可以提高圖像數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)有效性且可增加有效動(dòng)態(tài)范圍。
同時(shí)采集來(lái)自例如有6個(gè)部分的參比帶和96個(gè)小瓶共有102個(gè)有意義區(qū)域的數(shù)據(jù)。這種處理方法可以自動(dòng)調(diào)節(jié)照射時(shí)間以使數(shù)據(jù)信號(hào)保持在一個(gè)預(yù)定工作范圍內(nèi)，該范圍小于DNA復(fù)制期間的飽合極限例如為飽合度的35％-70％。對(duì)DNA濃度的計(jì)算包含與所調(diào)節(jié)的照射時(shí)間(圖6)成比例的校正量。通過將合計(jì)在每個(gè)有意義區(qū)域(ROI)內(nèi)的像素?cái)?shù)而得到在一預(yù)定照射時(shí)間54內(nèi)的來(lái)自每次照射52、53的信號(hào)數(shù)據(jù)50、51。
為了能調(diào)整時(shí)間，從對(duì)應(yīng)的數(shù)據(jù)信號(hào)50中搜尋出58最大的信號(hào)數(shù)據(jù)56，該數(shù)據(jù)是從一個(gè)或多個(gè)例如三個(gè)讀取記錄最高的相鄰像素中選出。通過一次比較62以確定所述的最大信號(hào)數(shù)據(jù)是小于、大于還是落在所選擇的工作范圍之內(nèi)。根據(jù)上述比較結(jié)果，對(duì)照射時(shí)間進(jìn)行增加、減少或維持原值的調(diào)整64，以獲得隨后的照射時(shí)間66。也要對(duì)參比時(shí)間68進(jìn)行選擇，例如可以是一個(gè)起始時(shí)間或是一個(gè)固定的標(biāo)準(zhǔn)時(shí)間如為1024ms。經(jīng)校正后的暗數(shù)據(jù)57經(jīng)除以實(shí)際照射時(shí)間與參比時(shí)間的比值的時(shí)間校正后69得到校正后的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)71。開始的幾個(gè)周期可能超出范圍，之后應(yīng)獲得一有用的熒光曲線(圖7)。
對(duì)于參比發(fā)射器，從接收來(lái)自參比帶4(圖1與圖4)的光束的像素中生成參比數(shù)據(jù)信號(hào)73，再經(jīng)A/D15轉(zhuǎn)換后得到參比數(shù)據(jù)72。來(lái)自一具體參比部分4c圖4的參比數(shù)據(jù)74經(jīng)過如下篩選76，具有最大信號(hào)強(qiáng)度的數(shù)據(jù)小于一個(gè)預(yù)定的最大值77，而該最大值又小于飽合極限，例如為該極限的70％。也對(duì)下一個(gè)調(diào)光器部分進(jìn)行了篩選75，經(jīng)篩選后的參比數(shù)據(jù)74包含來(lái)自這一部分的數(shù)據(jù)。從參比數(shù)據(jù)74中減去78暗數(shù)據(jù)51，經(jīng)暗校正后的數(shù)據(jù)80經(jīng)照射時(shí)間54調(diào)整84而得到調(diào)整后的參比數(shù)據(jù)82。
數(shù)據(jù)82包含對(duì)最高部分進(jìn)行暗校正后的數(shù)據(jù)82’和對(duì)下一個(gè)調(diào)光器部分進(jìn)行暗校正后的數(shù)據(jù)82”(圖9)。各個(gè)部分間的亮度比在數(shù)據(jù)采集的過程中被計(jì)算89和建立起來(lái)。采集各個(gè)時(shí)間數(shù)據(jù)，計(jì)算最高部分和下一個(gè)調(diào)光器部分間的比值。由于在繼續(xù)的數(shù)據(jù)采集過程中會(huì)選出不同的最優(yōu)部分，這樣便可匯編出一個(gè)比值表85。另外，也可預(yù)先采集計(jì)算出這些比值。調(diào)整后的參比數(shù)82’(來(lái)自圖5的數(shù)據(jù)82)與初始參比數(shù)據(jù)90或從比值表85中得到的，其它選定的此前的DNA復(fù)制(PCR)序列的參比數(shù)據(jù)的比值進(jìn)行實(shí)時(shí)歸一化86，以計(jì)算歸一化參比數(shù)據(jù)88。利用歸一化后的參比數(shù)據(jù)和校正的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)71再經(jīng)歸一化運(yùn)算后得到偏移歸一化基礎(chǔ)數(shù)據(jù)94，所進(jìn)行的歸一化運(yùn)算就是用基礎(chǔ)數(shù)據(jù)除以歸一化后的參比數(shù)據(jù)。這就對(duì)儀器在監(jiān)測(cè)過程中的偏移進(jìn)行了校正。利用一已存儲(chǔ)的校準(zhǔn)因子99便可計(jì)算98出DNA濃度96，通過用已知的標(biāo)準(zhǔn)DNA濃度以確定出一條與趨勢(shì)曲線(圖7)的起始周期的起始濃度有關(guān)的直線的斜率和截距便可確定出校準(zhǔn)因子99了，具體可參見上述的由Higuchi撰寫的文章以及第5766889號(hào)美國(guó)專利。(將在下文中對(duì)進(jìn)一步的歸一化處理118、120和基線校正122-130進(jìn)行討論。)一個(gè)典型PCR序列的延伸階段的數(shù)據(jù)如圖7所示，圖7中繪出了各個(gè)PCR循環(huán)中的數(shù)據(jù)。如需要，還可利用包含帶有相同染料和用化學(xué)方法防止發(fā)生放大的DNA的樣品小瓶來(lái)實(shí)現(xiàn)歸一化處理，以對(duì)染料漂白或其他的樣品化學(xué)制劑所造成的影響進(jìn)行校正。
另外，樣品還可包含一種或多種類型的用作“不活潑”參比物的染料分子，所述的“不活潑”參比染料具有與DNA結(jié)合染料相同波長(zhǎng)范圍的熒光。例如，這種參比染料可用標(biāo)有Rhodamine和Fluorescein染料衍生物的核酸系列物制成。一種合適的參比劑是購(gòu)自Perkin-Elmer Applied Biosystems的Rox染料。這些不活潑染料分子不參加PCR反應(yīng)，因此它們的熒光實(shí)際上不受DNA的影響而是在反應(yīng)過程中維持一個(gè)恒定值。通過在至少一個(gè)小瓶、最好是在每個(gè)小瓶的成份中放置一標(biāo)準(zhǔn)濃度的不活潑染料，就可以利用不活潑染料的熒光來(lái)對(duì)DNA結(jié)合染料的熒光進(jìn)行歸一化處理。
光源光束中包含一附屬的激發(fā)頻率，以使不活潑染料在這一附屬頻率發(fā)射熒光，因此對(duì)著探測(cè)器就發(fā)射有一附屬光束并產(chǎn)生有相對(duì)應(yīng)的附屬數(shù)據(jù)信號(hào)。處理器接收附屬數(shù)據(jù)信號(hào)以計(jì)算出代表標(biāo)準(zhǔn)濃度的附屬數(shù)據(jù)。利用這些數(shù)據(jù)來(lái)對(duì)基礎(chǔ)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化，以使經(jīng)與照射時(shí)間成比例的校正運(yùn)算以及對(duì)漂移進(jìn)行了歸一后的DNA濃度相對(duì)于不活潑染料的標(biāo)準(zhǔn)濃度也具有歸一性。在這一例子中，最好使附屬激發(fā)頻率與基礎(chǔ)激發(fā)頻率相等，不活潑染料發(fā)出熒光以便所發(fā)射的附屬光束大體上也具有發(fā)射頻率。在熱循環(huán)塊循環(huán)的各個(gè)擴(kuò)展階段產(chǎn)生基礎(chǔ)數(shù)據(jù)信號(hào)，這些階段正是DNA再結(jié)合且相應(yīng)的基礎(chǔ)染料發(fā)射量最大的時(shí)候。而在DNA變性且相應(yīng)地基礎(chǔ)染料發(fā)射量最小的熱循環(huán)塊的每個(gè)變性階段產(chǎn)生附屬數(shù)據(jù)信號(hào)。因此，基礎(chǔ)階段的數(shù)據(jù)信號(hào)實(shí)際上代表了DNA的濃度，而附屬階段的數(shù)據(jù)信號(hào)實(shí)際上代表了不活潑染料的標(biāo)準(zhǔn)濃度。
對(duì)小瓶樣品和參比帶采集暗數(shù)據(jù)和正常數(shù)據(jù)，從正常熒光數(shù)據(jù)中減去暗數(shù)據(jù)。在大約60℃的PCR反應(yīng)的擴(kuò)展階段采集到了暗和正常數(shù)據(jù)組，在這一階段中所有的DNA鏈已結(jié)合成了雙鏈。在這一階段，來(lái)自DNA結(jié)合染料的熒光最強(qiáng)，這一熒光與來(lái)自不活潑參比分子的弱得多的熒光相疊加。在高溫(約95℃)變性階段采集到了分離的暗和正常數(shù)據(jù)組，在這一階段DNA發(fā)生了變性或解鏈為單鏈。在這一階段，DNA結(jié)合染料所發(fā)出的熒光最弱，幾乎為零，這是因?yàn)镈NA不是雙鏈的，而所用染料發(fā)出的熒光量隨著溫度的升高有一個(gè)很大的衰減。因此，變性階段圖像實(shí)際上包含發(fā)自不活潑參比分子的參比熒光。在用測(cè)定的與溫度的關(guān)系校正之后的暗校正參比(變性)數(shù)據(jù)組可以從暗校正DNA結(jié)合染料數(shù)據(jù)組中減去，或者可以被認(rèn)為對(duì)正常數(shù)據(jù)組來(lái)說沒有意義。另外，可能希望對(duì)標(biāo)有不活潑參比染料的分子獨(dú)立成像，對(duì)于各個(gè)PCR周期，可另外使用一個(gè)可以濾掉由DNA結(jié)合染料所發(fā)射的光束而可以通過由不活潑參比染料所發(fā)射的光束的光學(xué)帶通濾光器。這些數(shù)據(jù)在功能上等同于變性數(shù)據(jù)。
對(duì)于變性階段的處理如圖8所示，以與獲取基礎(chǔ)數(shù)據(jù)同樣的方式，即通過正常照射52’和閉合光柵53’來(lái)分別獲得正常和暗數(shù)據(jù)信號(hào)102、104。照射時(shí)間106可以與序列中相臨近的一個(gè)延伸階段的照射時(shí)間相同，或者根據(jù)前一個(gè)變性階段(見與圖7相關(guān)的描述)來(lái)確定，或者可以是為序列中的所有變性階段所預(yù)定的一個(gè)合適的時(shí)間。A/D15將信號(hào)轉(zhuǎn)換成附屬數(shù)據(jù)108和暗數(shù)據(jù)110。從附屬數(shù)據(jù)中減去55’暗數(shù)據(jù)而得暗校正數(shù)據(jù)112，再進(jìn)一步用參比時(shí)間114和實(shí)際照射時(shí)間106對(duì)其進(jìn)行校正69’而獲得校正后的附屬數(shù)據(jù)116。
在延伸階段，通過除以一個(gè)為變性階段校正附屬數(shù)據(jù)116而選擇的循環(huán)數(shù)(如10)的平均值而對(duì)經(jīng)漂移歸一化后的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)94再進(jìn)行歸一化118，以生成進(jìn)一步歸一化后的熒光數(shù)據(jù)或進(jìn)一步歸一化數(shù)據(jù)120，這一歸一化處理將消除樣品孔的不一致性所帶來(lái)的影響?？梢杂醚h(huán)比循環(huán)來(lái)代替平均值。另外，可以在漂移歸一化之前或之后將附屬數(shù)據(jù)應(yīng)用到校正后的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)71上。對(duì)基線樣品進(jìn)行選擇122和平均124后生成基線數(shù)據(jù)126。用基線數(shù)據(jù)除以128進(jìn)一步歸一化數(shù)據(jù)120而得到經(jīng)基線校正的數(shù)據(jù)130。選擇基線樣品以使其在PCR趨勢(shì)超過圖7中所示曲線的近似水平基線部分之前。例如，所選的基線周期可以是6個(gè)周期至15個(gè)周期。在進(jìn)一步歸一化118之后，使用進(jìn)一步歸一化數(shù)據(jù)118來(lái)計(jì)算98出DNA濃度96。
從歸一化的延伸期數(shù)據(jù)中減去這些相同基線樣品的趨勢(shì)(例如，最小二乘回歸線)而得到具有零值平直基線的數(shù)據(jù)。然后利用已建立的或其他所期望的PCR方法對(duì)這一數(shù)據(jù)組進(jìn)行處理而計(jì)算出DNA起始復(fù)制的數(shù)量。一個(gè)簡(jiǎn)單的方法是推斷出發(fā)生從平直到上升轉(zhuǎn)變時(shí)的拐點(diǎn)。另一種較復(fù)雜的方法在前述的第5766889號(hào)美國(guó)專利中有記載。
這些數(shù)據(jù)還可有不同的用途，例如用于反應(yīng)的最化監(jiān)測(cè)或確定復(fù)制DNA的濃度，或用于起始量的確定。儀器也可以被用來(lái)(經(jīng)過或沒有經(jīng)過歸一化和其他校正)簡(jiǎn)單地顯示在一連續(xù)時(shí)間內(nèi)復(fù)制是正在進(jìn)行還是已經(jīng)發(fā)生了。
盡管在上面已結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)描述，但在本發(fā)明的實(shí)質(zhì)內(nèi)容和所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)技術(shù)方案還可進(jìn)行各種不同的改變和變形，這對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說是顯而易見的。因此，本發(fā)明只限定為所附的權(quán)利要求書或等同于它們的內(nèi)容。
權(quán)利要求
1．一種用于監(jiān)測(cè)在一個(gè)反應(yīng)裝置中進(jìn)行的復(fù)制DNA的聚合酶鏈反應(yīng)的光學(xué)儀器，所述反應(yīng)裝置包含一個(gè)至少設(shè)置有一個(gè)裝有反應(yīng)成份懸浮液的小瓶的熱循環(huán)塊，反應(yīng)成份中包含一種熒光基本染料，該染料所發(fā)熒光與DNA的存在成比例，所述儀器包含一個(gè)光源，光源所發(fā)射的光源光束包含至少一個(gè)使基本染料以某一發(fā)射頻率發(fā)出熒光的基本激發(fā)頻率；第一部件，用來(lái)接收具有激發(fā)頻率的可成為激發(fā)光束的光源光束；基本聚焦部件，用來(lái)使激發(fā)光束聚焦到各個(gè)懸浮液中，以使基本染料發(fā)出具有發(fā)射頻率的發(fā)射光束，該光束的強(qiáng)度代表著各個(gè)懸浮液中的DNA的濃度，這一聚焦部件可接收和透過發(fā)射光束；第二部件，用來(lái)接收來(lái)自聚焦部件的發(fā)射光束以便于進(jìn)一步使具有發(fā)射頻率的發(fā)射光束通過；發(fā)射聚焦部件，用來(lái)聚焦發(fā)射光束；探測(cè)器，用來(lái)接收來(lái)自第二部件和發(fā)射聚焦部件的發(fā)射光束以使發(fā)射光束聚焦到探測(cè)器上，探測(cè)器便產(chǎn)生了代表著發(fā)射光束進(jìn)而也代表著相應(yīng)的各個(gè)小瓶中的DNA濃度的基本數(shù)據(jù)信號(hào)；處理部件利用接收到的基本數(shù)據(jù)信號(hào)計(jì)算出基本信號(hào)數(shù)據(jù)和相應(yīng)的DNA濃度。
2．如權(quán)利要求1所述的儀器，其特征在于第一和第二部件共有一分光器，所述分光器接收成為激發(fā)光束的光源光束，也接收發(fā)射光束且使具有發(fā)射頻率的發(fā)射光束通過而到達(dá)探測(cè)器。
3．如權(quán)利要求2所述的儀器，其特征在于所設(shè)置的分光器反射具有激發(fā)頻率的光而透過具有發(fā)射頻率的光。
4．如權(quán)利要求1所述的儀器，其特征在于循環(huán)塊上設(shè)置有多個(gè)小瓶，聚焦部件包含有相應(yīng)的置于各個(gè)小瓶上方的多個(gè)小瓶透鏡以使發(fā)射光束中包含與各個(gè)小瓶相關(guān)的獨(dú)立光束，探測(cè)器包含一光感受器陣列，所述的光感受器接收獨(dú)立光束而生成相應(yīng)的數(shù)據(jù)信號(hào)，以便處理部件可計(jì)算出各個(gè)小瓶中的DNA濃度。
5．如權(quán)利要求4所述的儀器，其特征在于小瓶帶有透明的瓶帽，儀器還包含一壓盤，所述壓盤上有與小瓶透鏡排成一列的小孔以便使獨(dú)立光束和所通過的激發(fā)光束中的有關(guān)部分通過，在壓盤上設(shè)置小孔是為了配合放置瓶帽，還包含有用于充分加熱壓盤的加熱部件，以防止在瓶帽下發(fā)生凝結(jié)而干擾小瓶中DNA的復(fù)制。
6．如權(quán)利要求4所述的儀器，其特征在于聚焦部件還包含一物鏡，所述物鏡與小瓶透鏡一起使激發(fā)光束聚焦到各個(gè)懸浮液中，還使獨(dú)立光束通過而到達(dá)第二部件。
7．如權(quán)利要求6所述的儀器，其特征在于所述物鏡是一個(gè)經(jīng)非球面校正的菲涅耳透鏡。
8．如權(quán)利要求6所述的儀器，其特征在于發(fā)射聚焦部件包含一置于第二部件和探測(cè)器之間的探測(cè)器透鏡，探測(cè)器透鏡與小瓶透鏡和物鏡一起使獨(dú)立光束聚焦到探測(cè)器上。
9．如權(quán)利要求8所述的儀器，還包含一發(fā)射與激發(fā)光束相應(yīng)的參比光的熒光參比發(fā)射器，發(fā)射聚焦部件將至少一部分的參比光作為參比光束聚焦到探測(cè)器上，探測(cè)器進(jìn)一步接收參比光束以產(chǎn)生一參比信號(hào)，而處理部件中包含有用于接收參比信號(hào)以計(jì)算出參比數(shù)據(jù)的元件，以及對(duì)DNA復(fù)制反應(yīng)中的某一選定的點(diǎn)用參比數(shù)據(jù)來(lái)對(duì)其對(duì)應(yīng)的基本數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化的部件，以此來(lái)校正儀器在監(jiān)測(cè)過程中所發(fā)生的漂移。
10．如權(quán)利要求9所述的儀器，其特征在于參比元件包含多個(gè)參比發(fā)射器，各個(gè)發(fā)射器發(fā)射與激發(fā)光束相應(yīng)的具有不同強(qiáng)度的參比光束，發(fā)射聚焦部件將各參比發(fā)射器所發(fā)射的各個(gè)參比光束聚焦到探測(cè)器，探測(cè)器則接收各個(gè)參比光束而對(duì)于各個(gè)參比發(fā)射器生成一組參比信號(hào)，處理部件中包含接收參比信號(hào)而計(jì)算出相應(yīng)各組的參比數(shù)據(jù)的部件，以及從各組中選出小于預(yù)定最大值的最大信號(hào)數(shù)據(jù)的參比數(shù)據(jù)的選擇部件，使用所選定的參比數(shù)據(jù)來(lái)對(duì)基本數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化。
11．如權(quán)利要求1所述的儀器，其特征在于第一部件還包含激發(fā)濾光器，第二部件還包含發(fā)射濾光器，第一和第二部件共有一分光器，激發(fā)濾光器置于光源與分光器之間，發(fā)射濾光器置于分光器與探測(cè)器之間，激發(fā)濾光器透過具有激發(fā)頻率的光而大體上擋住具有發(fā)射頻率的光，發(fā)射濾光器則透過具有發(fā)射頻率的光而大體上擋住具有激發(fā)頻率的光，激發(fā)濾光器和分光器共同接收光源光束而產(chǎn)生出激發(fā)光束，發(fā)射濾光器與分光器共同接收發(fā)射光束以使具有發(fā)射頻率的發(fā)射光束透過而到達(dá)探測(cè)器。
12．如權(quán)利要求11所述的儀器，還包含一容納有光源、探測(cè)器、聚焦部件和濾波模塊的空腔，其特征在于分光器、激發(fā)濾光器和發(fā)射濾光器固定在模塊上，且與懸浮液所選用的基本染料有關(guān)，模塊可從空腔中移開而用另一個(gè)與另一種選用的基本染料相關(guān)的模塊來(lái)代替這一模塊。
13．如權(quán)利要求1所述的儀器，其特征在于光源包含一個(gè)鹵素?zé)艉鸵粰E圓形反光器，該反光器臨近于鹵素?zé)舳c第一部件相對(duì)，燈泡置于橢圓形反光器的焦距處以使光源光束從橢圓形反光器處反射，橢圓形反光器大體上反射可見光而透過紅外光。
14．如權(quán)利要求1所述的儀器，還包含一發(fā)射與激發(fā)光束相應(yīng)的參比光的熒光參比發(fā)射器，發(fā)射聚焦部件將至少一部分的參比光作為參比光束聚焦到探測(cè)器上，探測(cè)器接收參比光束以產(chǎn)生一參比信號(hào)，而處理部件中包含有用于接收參比信號(hào)以計(jì)算出參比數(shù)據(jù)的部件，以及對(duì)DNA復(fù)制反應(yīng)中的某一選定的點(diǎn)用參比數(shù)據(jù)來(lái)對(duì)其對(duì)應(yīng)的基本數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化的部件，以此來(lái)校正儀器在監(jiān)測(cè)過程中所發(fā)生的漂移。
15．如權(quán)利要求14所述的儀器，其特征在于參比元件包含多個(gè)參比發(fā)射器，各個(gè)發(fā)射器發(fā)射與激發(fā)光束相應(yīng)的具有不同強(qiáng)度的參比光束，發(fā)射聚焦部件將各參比發(fā)射器所發(fā)射的各個(gè)參比光束聚焦到探測(cè)器，探測(cè)器則接收各個(gè)參比光束而對(duì)于各個(gè)參比發(fā)射器生成一組參比信號(hào)，處理部件中包含接收參比信號(hào)而計(jì)算出相應(yīng)各組的參比數(shù)據(jù)的部件，以及從各組中選出小于預(yù)定最大值的最大信號(hào)數(shù)據(jù)的參比數(shù)據(jù)的選擇部件，使用所選定的參比數(shù)據(jù)來(lái)對(duì)基本數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化。
16．如權(quán)利要求15所述的儀器，其特征在于參比元件包含一成形熒光帶和一裝配于熒光帶上的中密度濾光器，以使參比光束和一部分的激發(fā)光束通過中密度濾光器后變細(xì)，中密度濾光器具有一系列的密度以適應(yīng)各自發(fā)射參比光束的多個(gè)參比發(fā)射器。
17．如權(quán)利要求16所述的儀器，還包含有將參比元件大體維持在一恒溫的保溫部件。
18．如權(quán)利要求17所述的儀器，其特征在于保溫部件包含一安裝在熒光帶下面的加熱帶，和用于控制加熱帶加熱的部件。
19．如權(quán)利要求1所述的儀器，還包含多個(gè)熒光參比發(fā)射器，各個(gè)發(fā)射器發(fā)射與激發(fā)光束相應(yīng)的具有不同強(qiáng)度的參比光束，發(fā)射聚焦部件將各參比發(fā)射器所發(fā)射的各個(gè)參比光束聚焦到探測(cè)器，探測(cè)器則接收各個(gè)參比光束而對(duì)于各個(gè)參比發(fā)射器生成一組參比信號(hào)，處理部件中包含接收參比信號(hào)而計(jì)算出相應(yīng)各組的參比數(shù)據(jù)的部件，以及從各組中選出小于預(yù)定最大值的最大信號(hào)數(shù)據(jù)的參比數(shù)據(jù)的選擇部件，以及對(duì)DNA復(fù)制反應(yīng)中的某一選定的點(diǎn)用參比數(shù)據(jù)來(lái)對(duì)其對(duì)應(yīng)的基本數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化的部件，以此來(lái)校正儀器在監(jiān)測(cè)過程中所發(fā)生的漂移。
20．如權(quán)利要求1所述的儀器，其特征在于各組數(shù)據(jù)信號(hào)按照復(fù)制順序依次生成，處理部件或探測(cè)器或兩者的結(jié)合體對(duì)各組中的數(shù)據(jù)信號(hào)有一個(gè)飽合極限值，探測(cè)器與處理部件結(jié)合成一體工作使探測(cè)器累積對(duì)應(yīng)于在一預(yù)選照射時(shí)間內(nèi)的發(fā)射光束輸入而生成各組數(shù)據(jù)信號(hào)，處理部件包含調(diào)整部件，該調(diào)整部件用于實(shí)現(xiàn)照射時(shí)間的自動(dòng)調(diào)整以使基本數(shù)據(jù)保持在一預(yù)定工作范圍內(nèi)即使相對(duì)應(yīng)的數(shù)據(jù)信號(hào)小于飽合極限，以及用于校正基本數(shù)據(jù)使之與所調(diào)整的照射時(shí)間成比例。
21．如權(quán)利要求20所述的儀器，其特征在于探測(cè)器包含一接收發(fā)射光束以生成在一相關(guān)照射時(shí)間內(nèi)的相應(yīng)數(shù)據(jù)信號(hào)的光感受器陣列，針對(duì)各個(gè)光感受器有一預(yù)定的工作范圍，處理部件還包含根據(jù)各光感受器所生成的數(shù)據(jù)信號(hào)而計(jì)算出光感受器數(shù)據(jù)的部件，調(diào)整部件還包含用于確定出最大光接收數(shù)據(jù)的部件，用于確定該最大數(shù)據(jù)是小于、大于還是處在預(yù)定的工作范圍之內(nèi)的部件，以及根據(jù)上述的判斷來(lái)確定是加大、減小還是維持照射時(shí)間以便于所實(shí)施的照射時(shí)間可以使隨后的光接收數(shù)據(jù)落在預(yù)定的工作范圍之內(nèi)的部件。
22．如權(quán)利要求1所述的儀器，還包含多個(gè)熒光參比發(fā)射器，各個(gè)發(fā)射器發(fā)射與激發(fā)光束相應(yīng)的具有不同強(qiáng)度的參比光束，發(fā)射聚焦部件將各參比發(fā)射器所發(fā)射的各個(gè)參比光束聚焦到探測(cè)器，探測(cè)器則接收各個(gè)參比光束而對(duì)于各個(gè)參比發(fā)射器生成一組參比信號(hào)，處理部件中包含接收參比信號(hào)而計(jì)算出相應(yīng)各組的參比數(shù)據(jù)的部件，以及從各組中選出小于預(yù)定最大值的最大信號(hào)數(shù)據(jù)的參比數(shù)據(jù)的選擇部件，以及對(duì)DNA復(fù)制反應(yīng)中的某一選定的點(diǎn)用參比數(shù)據(jù)來(lái)對(duì)其對(duì)應(yīng)的基本數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化的部件，以此來(lái)校正儀器在監(jiān)測(cè)過程中所發(fā)生的漂移。
23．如權(quán)利要求20所述的儀器，其特征在于小瓶?jī)?nèi)的成份還包含一標(biāo)準(zhǔn)濃度的熒光不活潑染料，該染料所發(fā)熒光大體上不受DNA的影響，光源光束包含一使不活潑染料以附屬發(fā)射頻率發(fā)射熒光的附屬激發(fā)頻率，所發(fā)射的附屬發(fā)射光束通過第二部件而聚焦到探測(cè)器上以產(chǎn)生相應(yīng)的附屬數(shù)據(jù)信號(hào)，處理部件還包含用于接收附屬數(shù)據(jù)信號(hào)以計(jì)算出附屬數(shù)據(jù)的部件，用于染料歸一化基本數(shù)據(jù)的部件，由此使所計(jì)算出的DNA濃度相對(duì)于不活潑染料的標(biāo)準(zhǔn)濃度進(jìn)行了歸一化。
24．如權(quán)利要求23所述的儀器，其特征在于附屬激發(fā)頻率等同于基本激發(fā)頻率，不活潑染料所發(fā)出的附屬光束大體上具有發(fā)射頻率，在當(dāng)DNA再結(jié)合時(shí)的熱循環(huán)塊的循環(huán)延伸階段期間產(chǎn)生了基本數(shù)據(jù)信號(hào)，相應(yīng)地該階段內(nèi)的基本染料發(fā)射最強(qiáng)，而在當(dāng)DNA發(fā)生變性時(shí)的熱循環(huán)塊的循環(huán)變性階段期間產(chǎn)生了附屬數(shù)據(jù)信號(hào)，相應(yīng)地該階段內(nèi)的基本染料發(fā)射最弱，因此擴(kuò)展階段的數(shù)據(jù)信號(hào)大體上代表了DNA濃度，而變性階段的數(shù)據(jù)信號(hào)大體上代表了不活潑染料的標(biāo)準(zhǔn)濃度。
25．如權(quán)利要求1所述的儀器，其特征在于小瓶?jī)?nèi)的成份還包含一標(biāo)準(zhǔn)濃度的熒光不活潑染料，該染料所發(fā)熒光大體上不受DNA的影響，光源光束包含一使不活潑染料以附屬發(fā)射頻率發(fā)射熒光的附屬激發(fā)頻率，所發(fā)射的附屬發(fā)射光束通過第二部件而聚焦到探測(cè)器上以產(chǎn)生相應(yīng)的附屬數(shù)據(jù)信號(hào)，處理部件還包含用于接收附屬數(shù)據(jù)信號(hào)以計(jì)算出附屬數(shù)據(jù)的部件，用于染料歸一化基本數(shù)據(jù)的部件，由此使所計(jì)算出的DNA濃度相對(duì)于不活潑染料的標(biāo)準(zhǔn)濃度進(jìn)行了歸一化。
26．如權(quán)利要求25所述的儀器，其特征在于附屬激發(fā)頻率等于基本激發(fā)頻率，不活潑染料所發(fā)出的附屬光束大體上具有發(fā)射頻率，在當(dāng)DNA再結(jié)合時(shí)的熱循環(huán)塊的循環(huán)擴(kuò)展階段期間產(chǎn)生了基本數(shù)據(jù)信號(hào)，相應(yīng)地該階段內(nèi)的基本染料發(fā)射最強(qiáng)，而在當(dāng)DNA發(fā)生變性時(shí)的熱循環(huán)塊的循環(huán)變性階段期間產(chǎn)生了附屬數(shù)據(jù)信號(hào)，相應(yīng)地該階段內(nèi)的基本染料發(fā)射最弱，因此擴(kuò)展階段的數(shù)據(jù)信號(hào)大體上代表了DNA濃度，而變性階段的數(shù)據(jù)信號(hào)大體上代表了不活潑染料的標(biāo)準(zhǔn)濃度。
27．一個(gè)用于復(fù)制DNA且對(duì)復(fù)制進(jìn)行監(jiān)測(cè)的系統(tǒng)，包含一用于DNA復(fù)制的聚合酶鏈反應(yīng)裝置，一用于監(jiān)測(cè)復(fù)制期間DNA存在的光學(xué)儀器，所述反應(yīng)裝置包含一個(gè)至少有一個(gè)裝有反應(yīng)成份懸浮液小瓶的熱循環(huán)塊，反應(yīng)成份中包含一種所發(fā)熒光與DNA存在成比例的熒光染料，還包含用于對(duì)循環(huán)塊進(jìn)而對(duì)懸浮液實(shí)現(xiàn)熱循環(huán)以便于發(fā)生聚合酶鏈反應(yīng)的部件；所述儀器包含一個(gè)光源，光源所發(fā)射的光源光束包含至少一個(gè)使染料以某一發(fā)射頻率發(fā)出熒光的激發(fā)頻率；設(shè)置的第一部件來(lái)接收具有激發(fā)頻率的可成為激發(fā)光束的光源光束且透過激發(fā)光束而到達(dá)聚焦部件，設(shè)置聚焦部件來(lái)使激發(fā)光束聚焦到各個(gè)懸浮液中以使染料發(fā)出具有發(fā)射頻率的發(fā)射光束，且使發(fā)射光束透過而到達(dá)第二部件，設(shè)置第二部件以進(jìn)一步使發(fā)射光束通過而到達(dá)探測(cè)器，設(shè)置探測(cè)器來(lái)接收來(lái)自第二部件的發(fā)射光束以產(chǎn)生代表發(fā)射光束進(jìn)而代表DNA濃度的數(shù)據(jù)信號(hào)；處理部件利用接收到的數(shù)據(jù)信號(hào)計(jì)算并顯示出DNA濃度。
28．如權(quán)利要求27所述的系統(tǒng)，其特征在于第一和第二部件共有一分光器，所述分光器接收成為激發(fā)光束的光源光束，也接收發(fā)射光束且使具有發(fā)射頻率的發(fā)射光束通過而到達(dá)探測(cè)器。
29．一種用于監(jiān)測(cè)在一反應(yīng)裝置進(jìn)行的復(fù)制DNA的聚合酶鏈反應(yīng)的光學(xué)儀器中的濾光模塊，所述反應(yīng)裝置包含一個(gè)至少有一個(gè)裝有反應(yīng)成份懸浮液小瓶的熱循環(huán)塊，反應(yīng)成份中包含一種所發(fā)熒光與DNA存在成比例的熒光染料，所述光學(xué)儀器包含一個(gè)空腔，一個(gè)設(shè)置在空腔中的光源，該光源所發(fā)射的光源光束包含至少一個(gè)使染料以某一發(fā)射頻率發(fā)出熒光的激發(fā)頻率，一個(gè)設(shè)置在空腔中的聚焦部件，該聚焦部件使激發(fā)光束聚焦到各個(gè)懸浮液中以使染料發(fā)出具有發(fā)射頻率的發(fā)射光束，一個(gè)設(shè)置在空腔中的探測(cè)器，該探測(cè)器接收發(fā)射光束以產(chǎn)生代表發(fā)射光束進(jìn)而代表DNA濃度的數(shù)據(jù)信號(hào)，和一利用接收到的數(shù)據(jù)信號(hào)計(jì)算并顯示出DNA濃度的處理部件；其中模塊包含一個(gè)支持框架，所述儀器可容納該框架并使之與儀器成為一體；一個(gè)固定在支持框架中的分光器，以便于在模塊插入后分光器接收光源光束以產(chǎn)生激發(fā)光束，接收并使發(fā)射光束透過而到達(dá)探測(cè)器；一個(gè)可以透過具有激發(fā)頻率的光而大體上擋住具有發(fā)射頻率光的激發(fā)濾光器，該激發(fā)濾光器固定在支持框架中，以便于在插入模塊后該激發(fā)濾光器置于光源與分光器之間；一個(gè)可以透過具有發(fā)射頻率的光而大體上擋住具有激發(fā)頻率光的發(fā)射濾光器，該發(fā)射濾光器固定在支持框架中，以便于在插入模塊后該發(fā)射濾光器置于分光器與探測(cè)器之間；分光器、激發(fā)濾光器和發(fā)射濾光器、及由此而成的模塊，與懸浮液所選用的染劑有關(guān)，且模塊可從空腔中移開以用另一個(gè)與另一種選用的染料相關(guān)的模塊來(lái)代替這一模塊。
30．如權(quán)利要求29所述的模塊，其特征在于分光器反射具有激發(fā)頻率的光而透過具有發(fā)射頻率的光。
全文摘要
一種光學(xué)儀器用于監(jiān)測(cè)在一個(gè)反應(yīng)裝置中進(jìn)行的DNA的PCR復(fù)制,所述反應(yīng)裝置包含一個(gè)設(shè)置有裝有反應(yīng)成分的小瓶的熱循環(huán)塊,所述反應(yīng)成分中包含一種在雙鏈DNA存在時(shí)會(huì)發(fā)出熒光的染料。激發(fā)光束通過分光器而到達(dá)小瓶使染料發(fā)出熒光。來(lái)自染料的發(fā)射光束通過分光器而到達(dá)CCD探測(cè)器,一個(gè)處理器據(jù)此計(jì)算出DNA濃度。含有多個(gè)參比發(fā)射器的參比帶發(fā)射出具有不同強(qiáng)度的參比光束,處理器從中選出一個(gè)最合適的發(fā)射器用來(lái)補(bǔ)償漂移。自動(dòng)調(diào)節(jié)照射時(shí)間使之保持在CCD和處理器的最佳動(dòng)態(tài)范圍之內(nèi)。分光器和與之有關(guān)的濾光器組成的模塊與所選用的染料有關(guān),而且可根據(jù)不同的染料進(jìn)行替換。
文檔編號(hào)B01L7/00GK1309766SQ99806199
公開日2001年8月22日 申請(qǐng)日期1999年5月17日 優(yōu)先權(quán)日1998年5月16日
發(fā)明者M·R·干比尼, J·G·阿特伍德, E·F·楊, E·J·拉卡托斯, A·L·塞羅內(nèi) 申請(qǐng)人:Pe公司(Ny)