一種用于檢測(cè)乙型肝炎病毒cccDNA的定性和絕對(duì)定量試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，尤其涉及一種有效檢測(cè)乙型肝炎病毒DNA以及乙型肝炎病毒共價(jià)閉合環(huán)狀DNA的定性試劑盒和絕對(duì)定量試劑盒及其方法。
【背景技術(shù)】
[0002]聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(polymerase chain react1n，簡稱PCR)又稱體外酶促基因擴(kuò)增。由Mullis發(fā)明于1983年，它以敏感，特異，快速的核酸分析技術(shù)而著稱，是分子生物學(xué)技術(shù)的一項(xiàng)突破。其基本原理為，模擬于DNA的自然復(fù)制過程，引物按照堿基配對(duì)與DNA模板互補(bǔ)結(jié)合以后，在DNA多聚酶的作用下，按照堿基配對(duì)的原則(A、T，C、G)，從引物開始合成與模板DNA互補(bǔ)的DNA鏈。經(jīng)變性，退火，延伸等一次循環(huán)，DNA鏈數(shù)量增加一倍。傳統(tǒng)的PCR是基于瓊脂糖凝膠電泳的方法對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行終點(diǎn)分析的一種半定量、定性方法，其主要的優(yōu)點(diǎn)是簡便易行，而且成本低廉。在PCR定量技術(shù)中，常用的實(shí)時(shí)熒光定量PCR是通過反應(yīng)過程中熒光信號(hào)的累積來反應(yīng)產(chǎn)物的量，但是熒光定量PCR需要標(biāo)準(zhǔn)品做參照，只是一種相對(duì)定量的方法，而且擴(kuò)增效率的改變也會(huì)影響熒光定量PCR的結(jié)果。而數(shù)字PCR即Digital PCR,它是一種核酸分子絕對(duì)定量技術(shù)，能夠高敏感的對(duì)目的DNA進(jìn)行精確定量。數(shù)字PCR可讓你能夠直接數(shù)出目的DNA分子的拷貝數(shù)。數(shù)字PCR是建立于傳統(tǒng)的PCR和熒光探針的使用基礎(chǔ)之上，且不需要建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，也不需要標(biāo)準(zhǔn)品做參照就能夠高靈敏的對(duì)核苷酸進(jìn)行絕對(duì)定量。其主要原理是將一個(gè)PCR體系分散成20000個(gè)油包水的微滴，通過普通PCR的擴(kuò)增后，具有熒光信號(hào)的微滴視為陽性，不具有熒光信號(hào)的微滴視為陰性，再通過泊松分布對(duì)陽性微滴和陰性微滴進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析從而對(duì)檢測(cè)樣品中目的DNA分子進(jìn)行絕對(duì)精確定量。
[0003]乙型肝炎病毒嚴(yán)重危害人類健康，在人體內(nèi)其主要的復(fù)制/生活過程為:乙型肝炎病毒(HBV)與肝表面受體結(jié)合，胞質(zhì)內(nèi)脫病毒衣殼，其松弛的不完全閉合的環(huán)狀DNA(rcDNA)進(jìn)入細(xì)胞核，在宿主和病毒DNA聚合酶作用下，以負(fù)鏈DNA為模板，延長修補(bǔ)DNA裂隙區(qū)，完成正鏈兩端連接而形成雙鏈完整的cccDNA，cccDNA轉(zhuǎn)錄形成4種病毒mRNA，mRNA翻譯形成病毒蛋白并逆轉(zhuǎn)錄形成單鏈DNA，再以負(fù)鏈DNA作為模板，通過病毒DNA聚合酶的作用，合成正鏈DNA，與負(fù)鏈DNA—起組成新的rcDNA。后者再通過病毒表面蛋白(衣殼蛋白)包裝形成具備感染能力的病毒顆粒并釋放到細(xì)胞外。
[0004]可見cccDNA是乙肝病毒前基因組RNA復(fù)制的原始模板，雖然其含量較少，每個(gè)肝細(xì)胞內(nèi)只有約5?50個(gè)拷貝，但對(duì)乙肝病毒的復(fù)制以及感染狀態(tài)的建立具有十分重要的意義，現(xiàn)有的核苷類似物抗病毒藥物并不能有效的清除cccDNA，體內(nèi)一旦存在cccDNA，HBV就有可能再次復(fù)制，導(dǎo)致乙肝復(fù)發(fā)。因此其是HBV持續(xù)感染和抗病毒藥物停用后病情反復(fù)的關(guān)鍵因素，只有清除了細(xì)胞核內(nèi)的cccDNA，才能徹底消除乙肝患者病毒攜帶狀態(tài)，是抗病毒治療的目標(biāo)。由于細(xì)胞內(nèi)cccDNA含量較少，檢測(cè)上相對(duì)困難。
[0005]國內(nèi)外對(duì)于cccDNA定量檢測(cè)的方法有很多，基本上都是利用cccDNA兩條鏈均是完整的，而rcDNA存在缺口這個(gè)區(qū)別，通過熒光定量PCR來實(shí)現(xiàn)。
[0006]1、巢式聚合酶鏈反應(yīng)也稱套式PCR。
[0007]由于使用了兩對(duì)引物并且進(jìn)行了兩輪擴(kuò)增反應(yīng)，第一對(duì)引物跨越環(huán)狀HBV-DNA的DRU DR2重復(fù)序列旁的兩個(gè)缺刻，第二次PCR以一次PCR產(chǎn)物為模板擴(kuò)增rcDNA缺口內(nèi)部區(qū)域。其引物設(shè)計(jì)的原理也是基于cccDNA與rcDNA結(jié)構(gòu)的不同，因此，cccDNA能夠被擴(kuò)增，而rcDNA則不能擴(kuò)增。董慶鳴等[董慶鳴，魏紅山，莊輝，等.套式聚合酶鏈反應(yīng)法(nPCR)檢測(cè)血清中HBV cccDNA[J].中國醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志，2005，6 (3): 168-170.]用該法檢測(cè)HBV cccDNA標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照質(zhì)粒，結(jié)果表明該法可以檢測(cè)到5 X 15拷貝/L HBVcccDNA，但是兩步法在取樣時(shí)容易產(chǎn)生誤差，且容易產(chǎn)生污染，并且耗時(shí)較長，較繁瑣。
[0008]2、嵌合引物兩步法熒光定量PCR。
[0009]Shao 等[SHAO JB, CHEN Z, NI WQ, et al.A quantitative method to detect HBVcccDNA by chimeric primer and real-time polymerase chain react1n[J].J VirolMethods, 2003, 112(1-2):45-52.]根據(jù)非cccDNA形式的HBV基因組存在缺口，設(shè)計(jì)由兩段序列構(gòu)成的嵌合引物。其3'端的12個(gè)堿基與正鏈(1604?1615)互補(bǔ)，結(jié)合位點(diǎn)為負(fù)鏈缺口上游DR2缺口下游，5'端的一段與人類免疫缺陷病毒的部分基因序列一致而與HBV基因組無同源性。首先用該嵌和引物對(duì)模板DNA進(jìn)行15個(gè)循環(huán)的單鏈延伸，在該反應(yīng)過程中，cccDNA因?yàn)檎溚暾?，引物能夠順利延伸形成一條新生鏈；而HBV DNA的其他形式，如rcDNA,由于DR2區(qū)存在缺口，引物的延伸停止于DR2區(qū)，不能產(chǎn)生單鏈延伸產(chǎn)物。新生鏈形成以后，設(shè)計(jì)另一對(duì)引物，一個(gè)與嵌合性引物的片段B雜交，另一個(gè)與正鏈DR2后的序列互補(bǔ)，這樣可以保證只能檢測(cè)單鏈延伸反應(yīng)的產(chǎn)物而不能直接檢測(cè)HBV基因。此方法檢測(cè)肝組織樣本陽性結(jié)果為15-1O6拷貝/ml。但存在的問題是第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物如果不經(jīng)過純化直接充當(dāng)模板，則會(huì)因?yàn)槌煞謴?fù)雜而直接影響第二輪擴(kuò)增的效率，如果純化則會(huì)影響準(zhǔn)確性。
[0010]3、入侵檢查
[0011]針對(duì)目標(biāo)DNA設(shè)計(jì)兩種探針，一種稱為初始探針，另一種稱為入侵探針，初始探針的5端有I段寡核苷酸序列不與目標(biāo)DNA互補(bǔ)，入侵探針的3端的單個(gè)堿基不與目標(biāo)DNA互補(bǔ)，flap核酸內(nèi)切酶I將初始探針5端不與目標(biāo)DNA互補(bǔ)的那段寡核苷酸序列剪切下來，此段寡核苷酸序列與具有發(fā)光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的熒光共振能量轉(zhuǎn)移探針結(jié)合，從而產(chǎn)生熒光信號(hào)。Wong等6根據(jù)此原理，設(shè)計(jì)了與正鏈上游、負(fù)鏈下游HBV直接重復(fù)序列2區(qū)結(jié)合的入侵探針，由于cccDNA正鏈、負(fù)鏈均完整，故產(chǎn)生2種熒光信號(hào)，但rc DNA正鏈含有缺口，故只能產(chǎn)生I種熒光信號(hào)，可根據(jù)DNA產(chǎn)生的熒光信號(hào)區(qū)分cCCDNA、rCDNA。此方法雖然特異性較高，但反應(yīng)體系成分較復(fù)雜，反應(yīng)效率難以控制。所需時(shí)間較長，除了變性、熱啟動(dòng)處理還需在64°C條件下循環(huán)反應(yīng)240min。
[0012]4、Light Cycler?實(shí)時(shí)定量 PCR 方法。
[0013]Singh 等[Singh M, Dicaire A, Wakil AE, Luscombe C，Sacks SK.Quantitat1nof hepatitis B virus (HBV) covalently closed circular DNA (cccDNA)in the liverof HBV-1nfected patients by LightCycler real-time PCR.J Virol Methods 2004 ；118:159-167.]研宄的利用Light Cycler?實(shí)時(shí)定量PCR儀檢測(cè)HBV感染患者肝臟組織中cccDNA的方法。其引物設(shè)計(jì)是跨越了 rcDNA的空隙區(qū)，并且采用雙探針體系。其特點(diǎn)是為了消除rcDNA非特異性擴(kuò)增對(duì)結(jié)果的干擾，除了設(shè)計(jì)特異性引物和探針外，還應(yīng)用了 Plasmid-Safe?ATP-Dependent DNase 降解 rcDNA。該方法特異性較好，使用了 LightCycler?實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)體系，檢測(cè)結(jié)果相對(duì)穩(wěn)定可靠，其敏感性為10 1拷貝/mg。但是該方法的探針合成、儀器設(shè)備及耗材成本均較高，限制臨床應(yīng)用。
[0014]5、實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)方法
[0015]He 等[He ML, Wu J, Chen Y, Lin MC, Lau GK, Kung HF.A new and sensitivemethod for the quantificat1n of HBV cccDNA by real-time PCR.B1chem B1physRes Commun 2002 ;295:1102-1107.]根據(jù)cccDNA與rcDNA在結(jié)構(gòu)和生化特性上的不同，建立了實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增法。他們將具有發(fā)光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的TaqMan探針設(shè)計(jì)于負(fù)鏈缺口的下游，與負(fù)鏈互補(bǔ)。在上游引物的引導(dǎo)下，若負(fù)鏈?zhǔn)峭暾?，Taq酶則到達(dá)Taq-Man探針?biāo)Y(jié)合的位點(diǎn)，利用其5' —3'的外切酶活性將探針切斷，從而3'端的淬滅基團(tuán)失去對(duì)5'端發(fā)光基團(tuán)的抑制作用，產(chǎn)生熒光信號(hào)。相反，若負(fù)鏈含有缺口，由于上游引物引發(fā)的鏈延伸不能通過負(fù)鏈缺口，故不能產(chǎn)生熒光信號(hào)。這樣，cccDNA和rcDNA得以區(qū)分開來。其定量檢測(cè)的線性范圍是I X 12?I X 10 7拷貝/L。該方法對(duì)比分析了 HBV基因庫中150條已知A-G基因亞型的序列，根據(jù)保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物，能檢測(cè)A、B、C、F、G基因型，故該方法可用于90%亞太地區(qū)的乙肝病人cccDNA的檢測(cè)。目前認(rèn)為該法是臨床肝穿刺標(biāo)本中cccDNA定量的金標(biāo)準(zhǔn)，但此方法特異性較低。
[0016]目前，有專利中提及的cccDNA的檢測(cè)方法是基于HE等發(fā)明的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)方法，此方法是針對(duì)HBV負(fù)鏈缺口設(shè)計(jì)的引物探針進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)cccDNA，但在此方法情況下，也會(huì)產(chǎn)生rcDNA產(chǎn)物，特異性較差且熒光定量PCR技術(shù)去標(biāo)準(zhǔn)品作為參照，只是一個(gè)相對(duì)定量技術(shù)，并不能夠進(jìn)行絕對(duì)定量，靈敏度也相對(duì)較低。且目前對(duì)cccDNA進(jìn)行定性