專利名稱：通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測血吸蟲病的方法和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)在人樣品中診斷血吸蟲病的方法和試劑盒。該方法以寄生蟲DNA的檢測為基礎(chǔ)，在低感染強(qiáng)度的情況中尤其有用，而寄生蟲學(xué)大便檢驗(yàn)(Kato-Katz)在這種情況中展示低靈敏度。
背景技術(shù)：
血吸蟲病是由感染血吸蟲屬(Schistosoma)寄生蟲引起的疾病，主要的感染物種是孟氏血吸蟲(Schistosoma mansoni)、日本血吸蟲(Schistosoma japonicum)、和埃及血吸蟲(Schistosoma haematobiom)。這種疾病的記錄已經(jīng)延續(xù)了4000年，而且仍然構(gòu)成公共健康的重要問題，在不發(fā)達(dá)國家中受影響的人數(shù)超過2億。孟氏血吸蟲流行于54個(gè)國家和南美洲、加勒比海、非洲、和東地中海地區(qū)。
這些蠕蟲(兩性吸蟲)通過尾蚴(幼蟲期)穿透皮膚感染人類，尾蚴是由不同物種的軟體動(dòng)物(中間宿主)排泄到水中的。遷移穿過皮膚后，孟氏血吸蟲的幼蟲橫貫肺到達(dá)肝門靜脈系，然后在胃腸道靜脈和血管叢中生存，在那里成熟和交配，隨后雌蟲在靜脈血管中每天產(chǎn)下大約300枚卵。
宿主對進(jìn)入組織的寄生蟲卵的免疫反應(yīng)在疾病傳播中占有重要地位。在有些情況中，它發(fā)展成急性臨床形式，具有強(qiáng)烈的血毒癥表現(xiàn)；而在大多數(shù)受害者中，是使人虛弱的慢性疾病，有可能具有嚴(yán)重的且常常是致命的并發(fā)癥。
在用于控制感染的措施中，治療被感染者、控制軟體動(dòng)物、改進(jìn)生活條件、和對危險(xiǎn)人群的鑒定及早期治療經(jīng)證明是最持續(xù)，但是絕非完全令人滿意。70年代后，隨著可大規(guī)模使用的藥物的出現(xiàn)，特異性治療開始在控制該疾病的所有計(jì)劃中起到至關(guān)緊要的作用。
診斷方法構(gòu)成了控制地方流行病計(jì)劃的原始手段。非常需要發(fā)展比現(xiàn)有技術(shù)更有效的技術(shù)。
可以通過顯微鏡確認(rèn)糞便或尿中寄生蟲卵的存在來進(jìn)行感染的診斷，這取決于物種。Kato-Katz法(N.Katz、A.Chaves、J.Pellegrino，1972，用于孟氏血吸蟲定量大便厚涂片技術(shù)的簡易裝置，Rev.Inst.Med.Trop. Paulo.14337-340)這一技術(shù)提供了效率、成本、和操作的最好條件；(WHO，1994，血吸蟲病的控制，技術(shù)報(bào)告系列(TechnicalReport Series)830，日內(nèi)瓦，第86頁)。然而，當(dāng)大便中蟲卵數(shù)量較少(諸如低流行和低感染強(qiáng)度的條件)時(shí)，還有當(dāng)必須監(jiān)測治療時(shí)，單一糞便樣品檢驗(yàn)的靈敏度降低，從而必須檢驗(yàn)較大數(shù)量的糞便。即時(shí)如此，有些受害者可能沒有得到診斷，也就不會(huì)接受治療。
血清學(xué)診斷構(gòu)成寄生蟲學(xué)檢驗(yàn)的另一方案，是除后者之外最為廣泛應(yīng)用的方法。通過這種方法，通過諸如間接免疫熒光反應(yīng)和ELISA(酶聯(lián)免疫吸收測定法)等技術(shù)檢測由感染孟氏血吸蟲產(chǎn)生的抗體。然而，這種技術(shù)也有缺點(diǎn)，即不能區(qū)分現(xiàn)時(shí)感染(active infection)和過時(shí)感染(past infection)。因此，在不存在現(xiàn)時(shí)感染時(shí)針對孟氏血吸蟲抗體的低特異性可以解釋為與其它寄生蟲的交叉反應(yīng)性(R.Corr a-Oliveira、L.M.S.Dusse、I.R.C.Viana、D.G.Colley、O.S.Carvalho、G.Gazzinelli，1988，針對血吸蟲抗原的人抗體應(yīng)答，Am J Trop Med Hyg38348-355)、單性感染的存在、與其它尾蚴的接觸、母體抗體的轉(zhuǎn)移、和先前成功治療后抗體的持續(xù)存在。
孟氏血吸蟲的另一種診斷方案是檢測由寄生蟲釋放的抗原物質(zhì)，從而能夠區(qū)分過時(shí)感染和現(xiàn)時(shí)感染，并消除抗體診斷的非特異性問題。然而，尋找循環(huán)抗原存在其它缺點(diǎn)，諸如對輕微感染的低靈敏度、高成本、難以操作、和對單克隆抗體生成的依賴(N.DE Jonge、A.L.T.Rabello、F.W.Krijger、P.G.Kremsner、R.S.Rocha、N.Katz、和A.M.Deelder，1991，血吸蟲循環(huán)陽性和陰性抗原在來自巴西的血吸蟲病患者血清中的水平，Trans.R.Soc.Trop.Med.Hyg.85756-759)。
隨著聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的出現(xiàn)，有可能擴(kuò)增致病生物體的DNA，從而能夠由最初的微小數(shù)量獲得足以達(dá)到檢測點(diǎn)的巨大數(shù)量。因此，PCR已經(jīng)作為有效的方法用于多種多樣的感染診斷中。
EP 550 883描述了使用PCR檢測糞便中是否存在原生動(dòng)物G.lambliaDNA的實(shí)驗(yàn)。該方法使用G.lamblia的18S RNA基因序列作為靶序列。此外，申請人設(shè)計(jì)了與G.lamblia的核糖體18S RNA靶序列區(qū)充分互補(bǔ)的寡核苷酸引物。
WO 94/04681涉及作為PCR引物用于檢測編碼隱孢子蟲(Cryptosporidium sp.)壁(wall)蛋白質(zhì)的DNA序列以及由此作為試劑盒用于診斷該屬寄生蟲的特異寡核苷酸的開發(fā)。除上述范例以外，還可能引用WO 93/03167，它申請的是用于分離、儲(chǔ)存、和切割DNA的過程，能夠以適當(dāng)形式提供DNA用于經(jīng)特定連續(xù)過程的擴(kuò)增，諸如PCR。該方法具體用于檢測由具有多聯(lián)體閉合環(huán)狀動(dòng)質(zhì)DNA的微生物引起的寄生蟲病，諸如T.cruzi、利什曼原蟲(Leishmania sp.)、P.falciparum、P.vivax、和P.malariae。
在關(guān)于血吸蟲的研究中，PCR已經(jīng)被用于確定尾蚴的性別(R.B.Gasser、G.Morahan、和G.F.Mitchell，1991，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進(jìn)行孟氏血吸蟲幼蟲期的性別辨識，分子和生化寄生蟲學(xué)(Molecularand Biochemical Parasitology)47255-258)；用于克隆和測序特異基因(P.Francis和Q.Bickl，1992，孟氏血吸蟲21.7kDa疫苗-顯性抗原基因的克隆揭示了Elf手樣基序，分子和生化寄生蟲學(xué)(Mol.Bioch.Parasitol.)50215-224；D.Kiang、A.M.Karim、P.T.LoVerde，1996，孟氏血吸蟲p50(一種親免素)編碼基因的克隆，基因(Gene)170137-140)，這是為了確定血吸蟲種品系的種群遺傳變異性(E.Dias Neto、C.P.Souza、D.Rollinson、N.Katz、和A.J.G.Simpson，1993，多態(tài)DNA的隨機(jī)擴(kuò)增能夠鑒定血吸蟲屬的品系和物種，分子和生化寄生蟲學(xué)(Mol.Bioch.Parasitol.)57(1)83-88；A.J.Simpson、E.Dias Neto、T.H.Vidigal、H.B.Pena、O.S.Carvalho、和S.D.Pena，1995，血吸蟲的DNA多態(tài)性及其蝸牛宿主，Mem.Inst.Oswaldo Cruz.90(2)211-213)；以及用于開發(fā)和應(yīng)用產(chǎn)生表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)的技術(shù)(E.DiasNeto、R.Harrop、R.Correia-Oliveira、S.D.J.Pena、R.A.Wilson、和A.J.G.Simpson，1996，血吸蟲基因組計(jì)劃RNA任意引發(fā)的PCR能夠加速表達(dá)序列標(biāo)簽的生成，Mem.Inst.Oswaldo Cruz.91(5)655-657；E.Dias Neto、R.Harrop、R.Corr Oliveira、R.A.Wilson、S.D.J.Pena、和A.J.G.Simpson，1997，由通過任意引發(fā)RT-PCR產(chǎn)生的cDNA構(gòu)建的小型文庫用于由納克量的mRNA有效產(chǎn)生EST的標(biāo)準(zhǔn)化文庫的候選方案，基因(Gene)186135-142)。最近，Hamburger等人(J.Hamburger、X.Yu-Xin、R.M.Ramzy、J.Jourdane、和A.Ruppel，1998，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)用于監(jiān)測水的孟氏血吸蟲感染情況的開發(fā)和評價(jià)，Am.J.Trop.Med.Hyg.59(3)468-473)開發(fā)了用于監(jiān)測天然水的孟氏血吸蟲感染情況的基于PCR檢驗(yàn)。
本發(fā)明中描述的引物是根據(jù)

圖1所示最初由Hamburger等人(J.Hamburger、T.Turetski、I.Kapeller、和R.Deresiewicz，1991，孟氏血吸蟲基因組中由物種特異性探針識別的高度重復(fù)DNA短序列，分子和生化寄生蟲學(xué)(Mol.Bioch.Parasitol.)4473-80)描述的孟氏血吸蟲序列設(shè)計(jì)的。在目視檢查最初序列后進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，從而避免在每種起始物內(nèi)或在兩種引物間存在互補(bǔ)區(qū)。為了促進(jìn)對降解DNA分子的擴(kuò)增(糞便或體液中存在的游離DNA預(yù)計(jì)如此)，選擇引物，以使擴(kuò)增短序列。同樣，對本發(fā)明所有階段嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)化，以使對化學(xué)上復(fù)雜的生物學(xué)樣品(諸如糞便和血清)發(fā)揮令人滿意的功能。
至今尚未涉及PCR作為人血吸蟲病診斷方法的應(yīng)用。
同樣的，尋找快速且有效、在低感染強(qiáng)度的情況中尤其有效的血吸蟲屬之種寄生蟲檢測方法顯然尚未成功。因此，為了達(dá)到這一目的，采用了使用與孟氏血吸蟲基因組的特異且高度重復(fù)序列互補(bǔ)的引物進(jìn)行PCR的策略。
發(fā)明概述本發(fā)明的目的是通過PCR檢測生物學(xué)樣品中的血吸蟲屬之種(Schistosoma sp.)。
本發(fā)明的第一個(gè)實(shí)施方案涉及用于通過PCR擴(kuò)增血吸蟲種DNA序列來診斷血吸蟲的方法。本發(fā)明的方法表征為下列階段(a)收集待測樣品；(b)由階段(a)中獲得的樣品提取血吸蟲屬之種的DNA；(c)使用由SEQ ID NO1所示最初序列構(gòu)建的特異引物擴(kuò)增階段(b)中提取的血吸蟲DNA的某一區(qū)域；(d)通過電泳分離階段(c)的擴(kuò)增產(chǎn)物，隨后使用適當(dāng)染色方法進(jìn)行檢測。
在第二個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明致力于用于檢測血吸蟲的診斷試劑盒?；镜脑噭┖邪M(jìn)行PCR技術(shù)的所有必需試劑，即用于PCR擴(kuò)增的特異引物、核苷酸、和適當(dāng)緩沖液。試劑盒可以任選的包含數(shù)量足以用于擴(kuò)增的Taq聚合酶、作為反應(yīng)陽性對照的標(biāo)準(zhǔn)DNA、制備擴(kuò)增物用于電泳的緩沖液、以及為使用者準(zhǔn)備的方案和指導(dǎo)手冊。
圖的簡述圖1顯示了孟氏血吸蟲重復(fù)單元的DNA序列。粗體指示本發(fā)明所述特異引物的位置。
圖2證明了PCR檢測孟氏血吸蟲DNA的靈敏度。
圖3顯示了本發(fā)明PCR技術(shù)擴(kuò)增血吸蟲多種物種DNA的能力，包括在世界上具有臨床-流行病重要性的3個(gè)物種孟氏血吸蟲、日本血吸蟲、和埃及血吸蟲。
圖4顯示了本發(fā)明PCR的特異性。
圖5比較了本發(fā)明PCR與寄生蟲學(xué)檢驗(yàn)用于診斷人糞便中孟氏血吸蟲的靈敏度。
圖6顯示了通過PCR對受感染患者糞便樣品中孟氏血吸蟲DNA的檢測。
圖7顯示了通過PCR對人血清樣品中孟氏血吸蟲DNA的檢測。
發(fā)明詳述為了便于對本發(fā)明的理解，下文列出了本文中所用一些術(shù)語易于接受的定義1.引物單鏈合成寡核苷酸，常常成對用于與DNA片段互補(bǔ)鏈的雜交。在PCR中，DNA聚合酶使用引物/DNA模板復(fù)合物內(nèi)端作為合成起始點(diǎn)。
2.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)包括若干循環(huán)的變性、與引物一起退火、和用熱穩(wěn)定DNA聚合酶(如TaqDNA聚合酶)延伸的技術(shù)，用于擴(kuò)增DNA靶序列。US 4 683 195和US 4 683 202描述了用于擴(kuò)增核酸的PCR方法。
不恰當(dāng)選擇的引物可能產(chǎn)生多種非期望效果，諸如不能擴(kuò)增、在多個(gè)位點(diǎn)擴(kuò)增、形成引物二聚體等等，使得擴(kuò)增反應(yīng)不提供信息。
本發(fā)明的目的是如下實(shí)現(xiàn)的通過PCR擴(kuò)增血吸蟲屬之種基因組的特異區(qū)，然后通過電泳分離擴(kuò)增產(chǎn)物，最后進(jìn)行適當(dāng)染色技術(shù)使得凝膠中的DNA適當(dāng)顯影。適當(dāng)?shù)娜旧夹g(shù)包括(但不限于)銀染、放射性同位素、和聯(lián)合使用酶與底物，從而能夠檢測卻無上述非期望效果。
本發(fā)明的方法可用于檢測不具有寄生蟲而含足夠完整可經(jīng)PCR擴(kuò)增的細(xì)胞或DNA的任何生物學(xué)樣品中的血吸蟲屬DNA。有些樣品，諸如糞便和尿，需要進(jìn)行某種處理，由此破裂寄生蟲細(xì)胞中可能包裹DNA的膜或包膜，將DNA釋放到溶液中。其它樣品，如受感染人群的血清，早已包含游離分子，因而不需要這種處理。通?？梢酝ㄟ^使用特殊化學(xué)物質(zhì)(諸如去污劑和離液鹽)或者通過使用物理和機(jī)械方法(諸如誘導(dǎo)滲透壓和超聲波處理)來破裂膜。破裂細(xì)胞膜后，必須將DNA與其它細(xì)胞分子分開，這也可以通過物理化學(xué)方法來進(jìn)行，諸如乙醇沉淀或使用硅基質(zhì)。
一旦游離于溶液，即可以在PCR擴(kuò)增后檢測樣品中的DNA。必須優(yōu)選采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)純化DNA，以除去可能抑制擴(kuò)增反應(yīng)的物質(zhì)。
提取后，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)選擇性擴(kuò)增DNA。通過PCR，血吸蟲屬之種的基因組的特異序列選擇性拷貝了數(shù)以百萬次，從而能夠檢測寄生蟲DNA。反應(yīng)是順序過程，需要至少兩種引物--與寄生蟲DNA互補(bǔ)的DNA短序列，它們通過酶延伸，呈現(xiàn)該DNA的忠實(shí)拷貝。加入大量的引物以及其它必需試劑后，可獲得數(shù)百萬拷貝的寄生蟲DNA。此處PCR所用引物是根據(jù)SEQ ID NO1和圖1所示孟氏血吸蟲基因組高度重復(fù)最初序列特別為本發(fā)明設(shè)計(jì)的。必須理解，可以構(gòu)建核苷酸序列與SEQ ID NO2和SEQ IDNO3功能等同的其它引物。若相應(yīng)的生物聚合物在用法或目的上起著相同功能，而本身并不相同，則這些序列稱為等同(物)。等同序列可以是變異的結(jié)果，同樣可以是序列中的任何修飾，無論是自發(fā)的還是誘導(dǎo)的，無論是核苷酸的替換和/或刪除和/或插入還是序列一端的延長和/或縮短。基因工程技術(shù)可以產(chǎn)生非天然變異。
構(gòu)建的引物對中的每一種引物優(yōu)選與待擴(kuò)增的血吸蟲屬之種基因組特異序列側(cè)翼的不同鏈序列實(shí)質(zhì)性互補(bǔ)。因此，每對引物中的一種引物與有義序列部分足夠互補(bǔ)從而能與其發(fā)生雜交，而每對引物中的另一種引物與反義的相同序列不同部分足夠互補(bǔ)從而能與其發(fā)生雜交。盡管引物序列沒必要反映模板的準(zhǔn)確序列，但3’端序列與準(zhǔn)確序列越接近，則聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)匹配階段中的連接就越好。
可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的任何適當(dāng)方法制備引物，包括例如克隆并消化適當(dāng)序列和直接化學(xué)合成。
PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物是一種DNA片段或不同大小的一系列DNA片段，它們可以通過電泳分離，隨后通過適當(dāng)染色技術(shù)將凝膠中的DNA適當(dāng)顯影。由于PCR的高度特異性，可以根據(jù)特定大小區(qū)分?jǐn)U增的寄生蟲DNA與其它擴(kuò)增產(chǎn)物。如此，在大多數(shù)情況中，可以簡單的通過目視分析擴(kuò)增產(chǎn)物，即根據(jù)是否存在大小符合寄生蟲的片段來確定是否存在感染。在本發(fā)明中，PCR被用于擴(kuò)增并顯現(xiàn)孟氏血吸蟲中最初描述的特異DNA片段，以及擴(kuò)增其它血吸蟲物種的特異區(qū)，由此得出結(jié)論，最初在孟氏血吸蟲中查實(shí)并在SEQ ID NO1中描述的DNA重復(fù)和特異區(qū)與所有其它血吸蟲物種是共有的。
使用表1所示特別構(gòu)建用于本發(fā)明的引物，或者能夠擴(kuò)增孟氏血吸蟲序列或其它血吸蟲物種同源序列的功能等同序列，通過PCR進(jìn)行血吸蟲屬之種基因組特異區(qū)的擴(kuò)增。
表1.用于擴(kuò)增血吸蟲屬之種基因組高度重復(fù)區(qū)的PCR反應(yīng)的引物
本發(fā)明的試劑盒包含能夠檢測由血吸蟲屬蠕蟲引起的任何感染的所有必需試劑。試劑盒包含表1所示針對血吸蟲種基因組特異區(qū)的特異引物或功能等同序列，此外，還提供常用于PCR技術(shù)的試劑和添加劑，如適當(dāng)?shù)暮塑账?，諸如dGTP(脫氧鳥苷三磷酸)、dATP(脫氧腺苷三磷酸)、dCTP(脫氧胞苷三磷酸)、和dTTP(胸苷三磷酸)；適當(dāng)?shù)木彌_液，如10-20mM Tris-HCl/50-60mM KCl/1.5-2.0mM MgCl2/pH8.0-8.5；優(yōu)選有Taq DNA聚合酶。還提供一定量的DNA作為反應(yīng)陽性對照，以及包含檢驗(yàn)方案和預(yù)期結(jié)果示意圖的指導(dǎo)手冊。
實(shí)施例本發(fā)明通過參考下列實(shí)施例詳細(xì)描述。必須理解，本發(fā)明不限于這些實(shí)施例，還包括發(fā)明功能范圍內(nèi)的變更和修改。實(shí)施例1破裂孟氏血吸蟲卵由先前感染了100枚孟氏血吸蟲尾蚴的小鼠的肝臟提取蟲卵，并在0.9％鹽溶液中保存于-20℃直至使用(Pellegrino和Siqueira，1956，Rev.Bras.Malar.8589)。為了破裂蟲卵，將10μl含100,000枚蟲卵/ml的鹽溶液與90μl蒸餾水混和，并將終溶液在機(jī)械混和儀中搖動(dòng)5分鐘。將包含破裂蟲卵的這一混和物直接用于提取DNA。實(shí)施例2通過修改后的Steiner法(J.J.Steiner、C.J.Polkemba、R.G.Fjellstrom、和L.F.Elliott，1995，用于PCR和RAPD分析的快速單管基因組DNA提取方法，核酸研究(Nucleic Acids Research)23(13)2569-2570)提取DNA將100μl破裂蟲卵溶液用200μl含10mM Tris-堿pH8.0/270mM EDTApH8.0/1％十二烷基硫酸鈉(SDS)/1％聚乙烯聚聚吡咯烷酮(PVPP)的緩沖液稀釋。將此混和物于95℃溫育20分鐘，在溫育的第一個(gè)10分鐘后快速手動(dòng)搖動(dòng)一次；然后于室溫以8000xg離心10分鐘。用乙醇沉淀表面層中所含DNA，除去上清，并將沉淀于37℃溫育15分鐘以蒸發(fā)殘余乙醇，然后重懸于TE緩沖液(10mM Tris pH8.0/1mM EDTA pH8.0)。通過于260nm讀取的光密度對DNA量化，并保存于-20℃直至用于PCR。實(shí)施例3通過使用表1所示特異引物的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增簡而言之，將1μl提取的DNA在含PCR緩沖液(20mM Tris-HClpH8.0/50mM KCl/1.5mM MgCl2)、200μM dNTP(脫氧核苷酸)、0.5μM每種引物、和0.75U Taq聚合酶，總體積10μl的反應(yīng)管中進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)包括將雙鏈寄生蟲DNA于95℃變性45秒鐘和于63℃與引物退火30秒鐘。在35個(gè)連續(xù)循環(huán)中依次重復(fù)這兩步。在第一個(gè)循環(huán)中，變性步驟延長5分鐘，以確保完全變性；而在最后一個(gè)循環(huán)時(shí)，添加一步，于72℃溫育2分鐘，以結(jié)束剩余退火引物的延伸。
圖2顯示了由孟氏血吸蟲DNA擴(kuò)增獲得的電泳圖型，以及檢測這種DNA所能獲得的最大靈敏度。M道是分子量標(biāo)準(zhǔn)；1-5道依次是20、10、5、1、和0.5fg DNA。PCR反應(yīng)能夠檢測少至1fg孟氏血吸蟲DNA。圖3顯示了用相同引物、在與用于孟氏血吸蟲的相同PCR條件中，由其它5種血吸蟲擴(kuò)增DNA后獲得的電泳圖型。M道分子量標(biāo)準(zhǔn)；1道孟氏血吸蟲；2道埃及血吸蟲；3道日本血吸蟲(來自菲律賓的品系)；4道日本血吸蟲(來自日本的品系)；5道羊血吸蟲(S.matthei)；6道牛血吸蟲(S.bovis)；7道S.leipperi；8道陰性對照。PCR反應(yīng)能夠擴(kuò)增檢驗(yàn)的血吸蟲所有物種的DNA。圖4顯示了同樣是在用于孟氏血吸蟲的相同條件下擴(kuò)增其它屬蠕蟲DNA的嘗試。M道分子量標(biāo)準(zhǔn)；1道陽性對照(孟氏血吸蟲DNA)；2道，人蛔蟲(Ascarislumbricoides)；3道Ancilostoma duodenales；4道豬帶絳蟲(Taeniasolium)；5道Trichiuris trichiuria。當(dāng)使用其它屬蠕蟲DNA時(shí)，看不見擴(kuò)增產(chǎn)物。因此，本發(fā)明所述PCR對于血吸蟲屬是特異的。實(shí)施例4檢測患者糞便樣品中的孟氏血吸蟲DNA在這些實(shí)驗(yàn)中，以實(shí)施例1所述方式破裂受感染糞便(天然或人工)中包含的蟲卵。然后通過實(shí)施例2所述用于由純的孟氏血吸蟲卵提取DNA的相同技術(shù)由糞便提取DNA。
提取后，將1μl孟氏血吸蟲DNA(稀釋100倍)如實(shí)施例3所述用相同引物、在相同條件下進(jìn)行擴(kuò)增。圖5顯示了人工感染了寄生蟲卵的糞便中孟氏血吸蟲DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物。簡而言之，將100mg患者糞便樣品(每克含216枚蟲卵)與900mg陰性糞便混和，形成具有預(yù)定濃度(每克大約20枚蟲卵)的樣品。將此過程再重復(fù)兩次，產(chǎn)生每克含大約2和0.2枚蟲卵的糞便樣品。然后通過Kato-Katz法對每種樣品的一部分進(jìn)行分析，并通過本發(fā)明PCR對每種樣品的一部分檢測寄生蟲DNA，由此比較兩種方法的靈敏度。M道分子量標(biāo)準(zhǔn)；1道陽性對照(0.1ng孟氏血吸蟲卵DNA)；2-5道依次是每克糞便含200、48、4.8、和0.48枚蟲卵的糞便樣品的擴(kuò)增DNA。PCR能夠檢測少至每克含大約4.8枚蟲卵的樣品中的孟氏血吸蟲DNA；而Kato-Katz法的靈敏度是每克48枚蟲卵，低10倍。
圖6顯示了先前通過Kato-Katz法測定具有多種濃度寄生蟲的患者糞便中孟氏血吸蟲DNA的擴(kuò)增結(jié)果。M道分子量標(biāo)準(zhǔn)；1道陽性對照；2-9道依次是每克含0.96、0.168、432、600、96.912、和72枚蟲卵的人糞便樣品。PCR結(jié)果符合寄生蟲學(xué)檢驗(yàn)在所有樣品中獲得的結(jié)果。實(shí)施例5檢測患者血清中的孟氏血吸蟲對于4份血清樣品，每份樣品取100μl，采用Glass-maxDNA分離旋轉(zhuǎn)柱系統(tǒng)(Life Technologies)，參照制造商的說明書，純化DNA。然后將2μl此DNA用于上述相同條件的PCR擴(kuò)增。所用人血清先前通過Kato-Katz法進(jìn)行了檢驗(yàn)，2份樣品陽性，2份樣品陰性。
圖7顯示了擴(kuò)增結(jié)果。M道分子量標(biāo)準(zhǔn)；1道陽性對照；2-5道依次是每克糞便含0、96、0、和216枚蟲卵的人的血清。
序列表1)一般信息I.a)申請人Fundac Oswaldo CruzI.b)地址Av.Brasil，4365，Castelo Mourisco，sala 05，Manguinhos-21045-900-Rio de Janeiro-RJII)發(fā)明題目“通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測血吸蟲病的方法和試劑盒”III)序列數(shù)目3IV)計(jì)算機(jī)可讀形式IV.a)介質(zhì)類型磁盤-3.5英寸IV.b)計(jì)算機(jī)IBM兼容機(jī)IV.c)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS2)序列的一般信息I.a)序列編號SEQ ID NO1II)序列特征II.a)長度120II.b)類型核酸II.c)鏈型雙鏈II.d)拓?fù)鋵W(xué)線性III)基因組定位III.a)圖譜定位no mapa...
GATCTGAATC CGACCAACCG TTCTATGAAA ATCGTTGTATCTAGACTTAG GCTGGTTGGC AAGATACTTT TAGCAACATACTCCGAAACC ACTGGACGGA TTTTTATGAT GTTTGTTTTAGAGGCTTTGG TGACCTGCCT AAAAATACTA CAAACAAAATGATTATTTGC GAGAGCGTGG GCGTTAATAT AAAACAAGAACTAATAAACG CTCTCGCACC CGCAATTATA TTTTGTTCTTI.a)序列編號SEQ ID NO2II)序列特征II.a)長度20II.b)類型核酸II.c)鏈型單鏈II.d)拓?fù)鋵W(xué)線性，正向III)基因組定位III.a)圖譜定位...GATCTGAATCCGACCAACCGI.a)序列編號SEQ ID NO3II)序列特征II.a)長度20II.b)類型核酸II.c)鏈型單鏈II.d)拓?fù)鋵W(xué)線性，反向III)基因組定位III.a)圖譜定位...ATATTAACGCCCACGCTCTC
權(quán)利要求
1.用于通過檢測生物學(xué)樣品中SEQ ID NO1所示血吸蟲屬DNA特異區(qū)來診斷血吸蟲屬寄生蟲感染的方法，包括下列階段(a)收集待測樣品；(b)由階段(a)中獲得的樣品提取血吸蟲屬之種DNA；(c)使用由SEQ ID NO1所示孟氏血吸蟲最初序列構(gòu)建的特異引物通過PCR擴(kuò)增階段(b)中提取的血吸蟲屬之種的DNA特異區(qū)；(d)通過電泳分離階段(c)的擴(kuò)增產(chǎn)物，隨后通過適當(dāng)技術(shù)進(jìn)行檢測。
2.權(quán)利要求1的方法，其中階段(c)中所用引物包括序列SEQ ID NO2與SEQ ID NO3或者能夠擴(kuò)增血吸蟲屬之種DNA特異區(qū)的功能等同序列。
3.權(quán)利要求1的方法，其中通過電泳在聚丙烯酰胺凝膠中分離階段(d)的擴(kuò)增產(chǎn)物并通過銀染或其它檢測系統(tǒng)進(jìn)行檢測。
4.包含序列SEQ ID NO2或SEQ ID NO3或者其功能等同序列的寡核苷酸引物。
5.權(quán)利要求4的引物，其包含序列SEQ ID NO2或SEQ ID NO3。
6.用于診斷血吸蟲屬之種感染的試劑盒，其包含由SEQ ID NO1所示孟氏血吸蟲最初序列構(gòu)建的特異引物和進(jìn)行PCR的所有必需試劑。
7.權(quán)利要求6的試劑盒，其中特異引物包含SEQ ID NO2與SEQ ID NO3或者能夠擴(kuò)增血吸蟲屬之種DNA特異區(qū)的功能等同序列。
8.權(quán)利要求7的試劑盒，其中還具有為使用者提供的方案和指導(dǎo)手冊。
全文摘要
本發(fā)明的目的是通過PCR檢測生物學(xué)樣品中的血吸蟲屬之種。本發(fā)明的第一個(gè)實(shí)施方案涉及用于診斷血吸蟲病的方法,即通過PCR擴(kuò)增血吸蟲屬之種DNA序列,然后通過電泳分離擴(kuò)增產(chǎn)物,最后通過適當(dāng)技術(shù)進(jìn)行檢測。在第二個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明致力于用于檢測血吸蟲病的診斷試劑盒?；镜脑噭┖邪M(jìn)行PCR技術(shù)的所有必需試劑,即用于PCR擴(kuò)增的特異引物、核苷酸、和適當(dāng)緩沖液。試劑盒可以任選的包含數(shù)量足以用于擴(kuò)增的Taq聚合酶、作為反應(yīng)陽性對照的標(biāo)準(zhǔn)DNA、制備擴(kuò)增物質(zhì)用于電泳的緩沖液、以及為使用者提供的方案和指導(dǎo)手冊。
文檔編號C12N15/09GK1366553SQ0180081
公開日2002年8月28日 申請日期2001年4月4日 優(yōu)先權(quán)日2000年4月4日
發(fā)明者A·L·特勒斯拉貝羅, E·迪阿斯奈托, L·A·龐特斯 申請人:奧斯瓦爾多克魯茲基金會(huì)