本發(fā)明涉及的是一種生物納米材料領域的技術，具體是一種在稀土上轉換納米材料表面修飾蛋白質的方法。
背景技術：
上轉換納米材料(Upconversion Nanoparticles，簡稱UCN)，如Yb、Tm、Ho或其他稀土元素摻雜的NaLnF4納米顆粒(Ln為鑭系元素)，是一類吸收長波長(紅外光)、低能量光子，發(fā)射短波長(可見光)、高能量光子的新型熒光納米材料。與傳統的下轉換納米材料如量子點，納米金等對比，UCN具有許多獨特的優(yōu)點，如優(yōu)異的光學穩(wěn)定性、高化學穩(wěn)定性、低毒性，另外在近紅外光激發(fā)下具有組織穿透能力深、對生物組織無損傷、近乎零背景熒光干擾、成像靈敏度高等諸多優(yōu)點，在生物醫(yī)學中有著廣泛的應用前景，如生物標記、細胞成像、病變檢測、DNA檢測、生物傳感等。
然而，通過現有方法獲得的純UCN表面沒有可以利用的基團，使生物活性分子無法直接固定于UCN表面，限制了生物相容性、毒性等生物化學性質的改善，并限制其在生物醫(yī)學領域的應用。因此對UCN的表面進行蛋白質修飾是其在生物醫(yī)用領域應用的重要需求之一。
現有憑借表面靜電吸附生物活性分子的方法，也有對UCN表面通過SiO2層包裹后再通過硅烷偶聯劑的偶聯作用進行修飾的方法。這些方法或穩(wěn)定性、重現性不高，或過程繁瑣、效率不高。
技術實現要素：
本發(fā)明針對現有技術連接過程復雜、修飾效率較低等缺陷，提出一種上轉換納米材料的表面修飾方法，能簡便、高效地在上轉換納米材料表面通過直接硅烷化的方式進一步耦聯蛋白質生物活性分子。
本發(fā)明是通過以下技術方案實現的：
本發(fā)明涉及一種上轉換納米材料的表面直接硅烷化方法，通過向分散于溶劑中的UCN滴加硅烷偶聯劑并充分反應后得到表面包覆SiO2殼及修飾有氨基的UCN。
所述的上轉換納米材料UCN包括但不限于：NaYF4、NaLnF4等摻雜稀土元素的上轉換納米材料。
所述的溶劑，采用但不限于環(huán)己烷。
所述的溶劑中優(yōu)選加有表面活性劑且pH值為8～9。
所述的表面活性劑采用壬基酚聚醚類表面活性劑，優(yōu)選采用CO-520，通過氨水調節(jié)堿性環(huán)境。
所述的硅烷偶聯劑采用三烷氧基型硅烷偶聯劑，優(yōu)選采用APTS，制備得到修飾有氨基的SiO2殼層，不僅可以有效改善UCN的生物相容性等化學性質，而且為進一步的表面修飾耦聯蛋白質分子做了基礎。
所述的表面包覆SiO2殼及修飾有氨基的UCN，具體通過以下方式制備：
1)稱量UCN粉末分散于10～1000mL環(huán)己烷中，相應的質量與體積比為1:1，超聲8～12min分散均勻；
2)加入壬基酚聚醚類表面活性劑，超聲8～12min后室溫磁力攪拌1～1.5h；
3)加入氨水，調節(jié)溶液體系的pH值為8～9后室溫磁力攪拌20～40min；
4)緩慢滴加三烷氧基型硅烷偶聯劑于反應溶液體系中，攪拌36～52h；
5)取出反應產物，采用離心方法(9000r/min，6min)，加入無水乙醇(乙醇與產物溶液體積比至少大于1:1)沉淀并用超純水清洗3～4遍，收集沉淀物真空冷凍干燥16～32h即可得到表面包覆SiO2殼及修飾有氨基的上轉換納米材料。
本發(fā)明涉及一種UCN表面修飾蛋白質生物活性分子的方法，將上述表面包覆SiO2殼及修飾有氨基的UCN分散于溶劑中得到納米粒子分散液，并將蛋白質生物活性分子分散于緩沖液中得到蛋白質溶液，然后將納米粒子分散液與蛋白質溶液混合后加入NHS和EDC作為催化劑并充分反應得到表面修飾蛋白質的上轉換納米材料。
所述的納米粒子分散液與蛋白質溶液的溶質質量比優(yōu)選為1:2。
所述的溶劑，優(yōu)選采用去離子水。
所述的緩沖液，優(yōu)選采用PBS緩沖液。
所述的蛋白質生物活性分子，包括但不限于：HER-2抗體、血清蛋白、酶等蛋白質分子等。
所述的表面修飾蛋白質的上轉換納米材料，具體通過以下方法制備得到：
a)稱量上述表面包覆SiO2殼及修飾有氨基的UCN和蛋白質，將UCN分散于1～1000mL超純水中配制UCN分散溶液，將蛋白質生物活性分子溶于4～1000mL的濃度為10mM的PBS緩沖溶液(pH7.4)中。
b)按照溶質質量比為1:2的比例量取上述納米粒子分散液和蛋白質溶液并混合，然后加入足量N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)及1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)溶液作為催化劑；將混合溶液體系室溫攪拌3～5小時；
c)取出反應物，采用離心方法(9000r/min，6min)，加入超純水清洗3～4次，收集沉淀物分散于超純水中或真空冷凍干燥后冷藏保存，即得到表面修飾蛋白質的上轉換納米材料。
本發(fā)明涉及一種通過上述方法制備得到的表面修飾有蛋白質生物活性分子的UCN的應用，將其作為特異性靶向標記物，應用于生物醫(yī)學影像、重大疾病治療或體外生物檢測中。
技術效果
與現有技術相比，本發(fā)明的技術效果包括：
1.室溫即可進行，制備方法過程優(yōu)化簡便，生產周期短；
2.重復性、穩(wěn)定性高；
3.表面耦聯蛋白質分子的適用范圍廣泛，如抗體、血清蛋白、酶等蛋白質分子類型，可針對需求選擇特異性蛋白質分子進行表面修飾，拓展了本發(fā)明在生物醫(yī)學領域的應用范圍等。
具體實施方式
實施例1
本實施例包括以下步驟：
1)稱取1000mgNaYF4：Yb，Tm@NaGdF4上轉換納米顆粒，分散于1000mL環(huán)己烷中，超聲處理8～12min使其分散均勻。
2)加入50mL的CO-520，超聲處理8～12min，室溫磁力攪拌1.5h。加入10mL氨水調節(jié)混合體系pH為8.5-9，室溫磁力攪拌30min。
3)逐滴加入4mLAPTS(邊攪拌邊滴加)，室溫磁力攪拌48h。取出反應后混合液采用離心方法(9000r/min，6min)，加入無水乙醇產生沉淀，并用超純水清洗3次。真空冷凍干燥24h，得到白色粉末，即為包覆連有氨基的SiO2殼的上轉換納米材料。
4)稱取UCN@SiO2-NH2 5mg，分散于1mL超純水中，超聲均勻。
5)稱取10mgHER2抗體，溶于4mLPBS緩沖溶液(pH7.4)中。
6)將兩溶液混合，并加入2.0mM的NHS和EDC溶液各3mL，室溫磁力攪拌4h。
7)取出反應后溶液，采用離心方法(9000r/min，6min)，加入超純水清洗3次，真空冷凍干燥24h，得到白色粉末，即為表面修飾HER2抗體的上轉換納米材料。
實施例2
本實施例包括以下步驟：
1)稱取100mgNaYF4：Er，Ho@NaGdF4上轉換納米顆粒，分散于100mL環(huán)己烷中，超聲處理8～12min使其分散均勻。
2)加入5mL的CO-520，超聲處理8～12min，室溫磁力攪拌1.5h。
3)加入1mL氨水調節(jié)混合體系pH為8.5-9，室溫磁力攪拌30min。
4)逐滴加入400μLAPTS(邊攪拌邊滴加)，室溫磁力攪拌48h。取出反應后混合液采用離心方法(9000r/min，6min)，加入無水乙醇產生沉淀，并用超純水清洗3次。真空冷凍干燥24h，得到白色粉末，即為包覆連有氨基的SiO2殼的上轉換納米材料。
5)稱取UCN@SiO2-NH2 30mg，分散于6mL超純水中，超聲均勻。
6)稱取60mgHER2抗體，溶于24mLPBS緩沖溶液(pH7.4)中。
7)將兩溶液混合，并加入2.0mM的NHS和EDC溶液各18mL，室溫磁力攪拌4h。取出反應后溶液，采用離心方法(9000r/min，6min)，加入超純水清洗3次，真空冷凍干燥24h，得到白色粉末，即為表面修飾HER2抗體的上轉換納米材料。
實施例3
本實施例包括以下步驟：
1)稱取10mgNaYF4：Yb，Tm@NaGdF4上轉換納米顆粒，分散于10mL環(huán)己烷中，超聲處理8～12min使其分散均勻。
2)加入500μL的CO-520，超聲處理8～12min，室溫磁力攪拌1.5h。
3)加入100μL氨水調節(jié)混合體系pH為8.5-9，室溫磁力攪拌30min。逐滴加入40μLAPTS(邊攪拌邊滴加)，室溫磁力攪拌48h。
4)取出反應后混合液采用離心方法(9000r/min，6min)，加入無水乙醇產生沉淀，并用超純水清洗3次。真空冷凍干燥24h，得到白色粉末，即為包覆連有氨基的SiO2殼的上轉換納米材料。
5)稱取UCN@SiO2-NH2 5mg，分散于1mL超純水中，超聲均勻。
6)稱取10mg牛血清蛋白，溶于4mLPBS緩沖溶液(pH7.4)中。
7)將兩溶液混合，并加入2.0mM的NHS和EDC溶液各3mL，室溫磁力攪拌4h。取出反應后溶液，采用離心方法(9000r/min，6min)，加入超純水清洗3次，真空冷凍干燥24h，得到白色粉末，即為表面修飾HER2抗體的上轉換納米材料。
實施例4
本實施例包括以下步驟：
1)稱取100mgNaYF4：Yb，Tm@NaGdF4上轉換納米顆粒，分散于100mL環(huán)己烷中，超聲處理8～12min使其分散均勻。
2)加入5mL的CO-520，超聲處理8～12min，室溫磁力攪拌1.5h。
3)加入1mL氨水調節(jié)混合體系pH為8.5-9，室溫磁力攪拌30min。
4)逐滴加入400μLAPTS(邊攪拌邊滴加)，室溫磁力攪拌48h。取出反應后混合液采用離心方法(9000r/min，6min)，加入無水乙醇產生沉淀，并用超純水清洗3次。真空冷凍干燥24h，得到白色粉末，即為包覆連有氨基的SiO2殼的上轉換納米材料。
5)稱取UCN@SiO2-NH2 50mg，分散于100mL超純水中，超聲均勻。
6)稱取100mgHER2抗體，溶于400mLPBS緩沖溶液(pH7.4)中。
7)將兩溶液混合，并加入2.0mM的NHS和EDC溶液各300mL，室溫磁力攪拌4h。取出反應后溶液，采用離心方法(9000r/min，6min)，加入超純水清洗3次，真空冷凍干燥24h，得到白色粉末，即為表面修飾HER2抗體的上轉換納米材料。
實施例5
本實施例包括以下步驟：
1)稱取100mgNaYF4：Yb，Tm@NaGdF4上轉換納米顆粒，分散于100mL環(huán)己烷中，超聲處理8～12min使其分散均勻。
2)加入5mL的CO-520，超聲處理8～12min，室溫磁力攪拌1.5h。
3)加入1mL氨水調節(jié)混合體系pH為8.5-9，室溫磁力攪拌30min。逐滴加入400μLAPTS(邊攪拌邊滴加)，室溫磁力攪拌48h。
4)取出反應后混合液采用離心方法(9000r/min，6min)，加入無水乙醇產生沉淀，并用超純水清洗3次。真空冷凍干燥24h，得到白色粉末，即為包覆連有氨基的SiO2殼的上轉換納米材料。
5)稱取UCN@SiO2-NH2 50mg，分散于1000mL超純水中，超聲均勻。
6)稱取100mgHER2抗體，溶于4000mLPBS緩沖溶液(pH7.4)中。將兩溶液混合，并加入2.0mM的NHS和EDC溶液各3000mL，室溫磁力攪拌4h。
7)取出反應后溶液，采用離心方法(9000r/min，6min)，加入超純水清洗3次，真空冷凍干燥24h，得到白色粉末，即為表面修飾HER2抗體的上轉換納米材料。
上述具體實施可由本領域技術人員在不背離本發(fā)明原理和宗旨的前提下以不同的方式對其進行局部調整，本發(fā)明的保護范圍以權利要求書為準且不由上述具體實施所限，在其范圍內的各個實現方案均受本發(fā)明之約束。