一種在食管鱗癌顯著上調(diào)的基因的應用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種在食管鱗癌顯著上調(diào)的基因的應用，該基因為KRT80，實驗證明，KRT80基因在食管鱗癌組織中表達上調(diào)，KRT80基因的過表達能促進食管鱗癌細胞的生長，抑制KRT80基因的過表達可以抑制食管鱗癌細胞的過度增殖，促進食管鱗癌細胞的凋亡。鑒于此，KRT80可作為可能的靶標應用于臨床，用于食管鱗癌患者的診斷和治療。
【專利說明】
-種在食管鱗癌顯著上調(diào)的基因的應用
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領域，設及一種在食管鱗癌顯著上調(diào)的基因的應用，具體的 設及在食管鱗癌顯著上調(diào)的KRT80的應用。
【背景技術】
[0002] 食管癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率占全球腫瘤發(fā)病率的第八位， 死亡率占癌癥相關死亡率的第六位。根據(jù)組織病理類型分類，食管癌可分為兩種主要類型： 食管腺癌和食管鱗癌。它們的病因?qū)W因素、流行病學特點和地理分布存在很大的差異。食管 腺癌主要分布在西方國家，并且近20年來也表現(xiàn)出發(fā)病率上升的趨勢。其中的原因目前尚 不完全清楚，但也發(fā)現(xiàn)了一些主要的危險因素，包括男性、白色人種和慢性返流疾病家族史 等因素。相對而言，食管鱗癌主要分布于發(fā)展中國家，并且在中亞和里海地區(qū)的發(fā)病率非常 集中，運些地區(qū)被稱為"中亞食管癌帶"。
[0003] 食管鱗癌在所有食管癌病例中約占90%，而中國是食管鱗癌的高發(fā)地區(qū)，其中約 70%發(fā)生在中國。在過去Ξ十年中，食管鱗癌的診斷，分期和治療水平均有很大提高。然而， 食管鱗癌的長期預后仍然難言樂觀，五年生存率只有15%-25%。與其它已經(jīng)被廣泛研究的 腫瘤如乳腺癌、肺癌不同，人們對食管鱗癌的發(fā)病機制的認識仍然很有限，運給食管鱗癌的 早期診斷和治療帶來了很多困難。
[0004] 食管鱗癌已經(jīng)成為目前世界上嚴重威脅人類生命健康的疾病之一。與其他的惡性 腫瘤一樣，食管鱗癌的演進是一個復雜的病理過程，其一般演進模式為正常食管鱗癌上 皮一食管上皮基底細胞過度增生一不典型增生一原位癌一食管鱗癌。其不僅包括了正常細 胞的惡變，還包括了腫瘤細胞的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移。但是，到目前為止，食管鱗癌的發(fā)病機制 尚不十分清楚，而對于食管鱗癌的治療目前并行之有效的方法。因此，探討食管鱗癌的發(fā) 生、發(fā)展、浸潤和轉(zhuǎn)移的確切機制，尋找食管鱗癌診斷的分子標志物，對于更有效的預防和 治療食管鱗癌都具有重要的臨床意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了彌補現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種食管鱗癌的分子祀標，用 于食管鱗癌的診斷和治療。
[0006] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案：
[0007] 本發(fā)明提供了一種基因及其表達產(chǎn)物在制備診斷食管鱗癌的產(chǎn)品中的應用，，所 述基因為KRT80。
[000引進一步，所述產(chǎn)品包括通過RT-PCR、實時定量PCR、免疫檢測、原位雜交或忍片檢測 KRT80基因及其表達產(chǎn)物的表達水平W診斷食管鱗癌的產(chǎn)品。
[0009]其中，所述用RT-PCR診斷食管鱗癌的產(chǎn)品至少包括一對特異擴增KRT80基因的引 物;所述用實時定量PCR診斷食管鱗癌的產(chǎn)品至少包括一對特異擴增KRT80基因的引物;所 述用免疫檢測診斷食管鱗癌的產(chǎn)品包括:與KRT80蛋白特異性結(jié)合的抗體;所述用原位雜交 診斷食管鱗癌的產(chǎn)品包括:與KRT80基因的核酸序列雜交的探針;所述用忍片診斷食管鱗癌 的產(chǎn)品包括:蛋白忍片和基因忍片;其中，蛋白忍片包括與KRT80蛋白特異性結(jié)合的抗體，基 因忍片包括與KRT80基因的核酸序列雜交的探針。
[0010] 進一步，所述用實時定量PCR診斷管鱗癌的產(chǎn)品至少包括的一對特異擴增KRT80基 因的引物序列如沈Q ID NO.3和沈Q ID NO.4所示。
[0011] 本發(fā)明提供了一種診斷食管鱗癌的產(chǎn)品，所述產(chǎn)品能夠通過檢測樣本中KRT80基 因的表達水平來診斷食管鱗癌。
[0012] 其中，所述"樣本'包括細胞、組織、臟器、體液(血液、淋己液等）、消化液、咳疲、肺 胞支氣管清洗液、尿、糞便等。優(yōu)選的，所述樣本為組織、血液。在本發(fā)明的【具體實施方式】中， 所述樣本為組織。
[0013] 進一步，所述產(chǎn)品包括忍片、或試劑盒；其中，所述忍片包括基因忍片、蛋白質(zhì)忍 片;所述基因忍片包括固相載體W及固定在固相載體的寡核巧酸探針，所述寡核巧酸探針 包括用于檢測KRT80基因轉(zhuǎn)錄水平的針對KRT80基因的寡核巧酸探針;所述蛋白質(zhì)忍片包括 固相載體W及固定在固相載體的KRT80蛋白的特異性抗體;所述試劑盒包括基因檢測試劑 盒和蛋白免疫檢測試劑盒;所述基因檢測試劑盒包括用于檢測KRT80基因轉(zhuǎn)錄水平的試劑； 所述蛋白免疫檢測試劑盒包括KRT80蛋白的特異性抗體。
[0014] 進一步，所述試劑包括針對KRT80基因的引物和/或探針。
[0015] 本發(fā)明所述的基因忍片或基因檢測試劑盒可用于檢測包括KRT80基因在內(nèi)的多個 基因（例如，與食管鱗癌相關的多個基因）的表達水平。所述蛋白忍片或蛋白免疫檢測試劑 盒可用于檢測包括KRT80蛋白在內(nèi)的多個蛋白質(zhì)（例如與食管鱗癌相關的多個蛋白質(zhì)）的表 達水平。將食管鱗癌的多個標志物同時進行檢測，可大大提高食管鱗癌診斷的準確率。
[0016] 本發(fā)明提供了 KRT80基因及其表達產(chǎn)物在制備治療食管鱗癌的藥物組合物中的應 用。
[0017]進一步，所述藥物組合物包括KRT80基因和/或其表達產(chǎn)物的抑制劑。所述抑制劑 包括抑制KRT80基因表達的物質(zhì)、抑制KRT80基因表達產(chǎn)物穩(wěn)定性的物質(zhì)、和/或抑制KRT80 基因表達產(chǎn)物活性的物質(zhì)。
[0018] 進一步，所述抑制劑是針對KRT80基因的siRNA、針對KRT80蛋白的抗體;優(yōu)選的，所 述抑制劑為siRNA。
[0019] 在本發(fā)明的【具體實施方式】中，所述針對KRT80基因的siRNA的序列如沈Q IDN0.9和 沈Q ID NO. 10所示。
[0020] 本發(fā)明還提供了一種治療食管鱗癌的藥物組合物，所述藥物包含KRT80基因和/或 其表達產(chǎn)物抑制劑。所述抑制劑包括抑制KRT80基因表達的物質(zhì)、抑制KRT80基因表達產(chǎn)物 穩(wěn)定性的物質(zhì)、和/或抑制KRT80基因表達產(chǎn)物活性的物質(zhì)。
[0021] 進一步，上述的藥物組合物還包括藥學上可接受的載體，運類載體包括(但并不限 于）：稀釋劑、賦形劑如乳糖、氯化鋼、葡萄糖、尿素、淀粉、水等、填充劑如淀粉、薦糖等;粘合 劑如單糖漿、葡萄糖溶液、淀粉溶液、纖維素衍生物、藻酸鹽、明膠和聚乙締化咯燒酬;濕潤 劑如甘油；崩解劑如干淀粉、海藻酸鋼、海帶多糖粉末、瓊脂粉末、碳酸巧和碳酸氨鋼;吸收 促進劑季錠化合物、十二烷基硫酸鋼等;表面活性劑如聚氧化乙締山梨聚糖脂肪酸醋、十二 烷基硫酸鋼、硬脂酸單甘油醋、十六燒醇等;致濕劑如甘油、淀粉等;吸附載體如淀粉、乳糖、 斑脫±、硅膠、高嶺±和皂粘±等;潤滑劑如滑石粉、硬脂酸巧和儀、聚乙二醇、棚酸粉末等。
[0022] 本發(fā)明的藥物組合物可W使用不同的添加劑進行制備，例如緩沖劑、穩(wěn)定劑、抑菌 劑、等滲劑、馨合劑、pH控制劑及表面活性劑。
[0023] 緩沖劑可W包括棚酸、憐酸、乙酸、巧樣酸、谷氨酸及相應的鹽(它們的堿金屬或堿 性稀±金屬鹽，例如鋼鹽、鐘鹽、巧鹽及儀鹽）。等滲劑包括氯化鐘、氯化鋼、糖及甘油。馨合 劑包括乙二胺四乙酸鋼及巧樣酸。抑菌劑包括但不限于有效濃度(例如<l%w/v)的節(jié)醇、苯 酪、間甲酪、氯下醇、對徑基苯甲酸甲醋和/或?qū)交郊姿岜住７€(wěn)定劑包括人類血清蛋 白、1^-氨基酸、糖及纖維素衍生物。1^-氨基酸還可W包括甘氨酸、半脫氨酸及谷氨酸中的任 意一個。糖類包括單糖，例如葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖等;糖醇，例如甘露醇、纖維醇、木 糖醇等;二糖，例如薦糖、麥芽糖、乳糖等;多聚糖，例如葡聚糖、徑丙基淀粉、硫化軟骨素、透 明質(zhì)酸等及它們的衍生物。纖維素衍生物包括甲基纖維素、乙基纖維素、徑乙基纖維素、徑 丙基纖維素、徑丙甲基纖維素及徑甲基纖維素鋼。表面活性劑包括離子或非離子表面活性 劑，例如聚氧化乙締烷基醋、山梨聚糖單酷基醋、脂肪酸甘油醋。
[0024] 本發(fā)明的藥物還可包括藥學上可接受的涂層材料包括(但不限于），快速分解涂層 材料、染色劑、腸溶性聚合物、增塑劑、水溶性聚合物、水不溶性聚合物、染料、色素、其他崩 散劑。常見快速分解涂層材料包括0PADRY;腸溶性聚合物包括甲基內(nèi)締酸聚合物、憐徑丙甲 基纖維素苯二甲酸醋、徑丙甲基纖維素乙酸醋、徑丙甲基纖維素班巧酸醋、徑甲乙基纖維 素、乙酷憐苯二甲酸纖維素;增塑劑包括聚乙二醇(PEG)、丙二醇等。
[0025] 本發(fā)明所述藥物組合物可口服給藥、非胃腸道給藥、通過吸入噴霧給藥、局部給 藥、直腸給藥、鼻給藥、頰給藥、陰道給藥或通過植入的膽藥裝置給藥。優(yōu)選口服給藥或注射 給藥。本發(fā)明藥物組合物可含有任何常用的無毒可藥用載體、輔料或賦形劑。在某些情況 下，藥用酸、堿或緩沖劑可用來調(diào)節(jié)制劑的pHW提高所配制的化合物或其給藥劑型的穩(wěn)定 性。本文所用術語非胃腸道包括皮下、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、關節(jié)內(nèi)、動脈內(nèi)、滑膜內(nèi)、胸骨內(nèi)、 鞠內(nèi)、損傷部位內(nèi)、和煩內(nèi)注射或輸注技術。只要能達到目標組織，本發(fā)明所述藥物組合物 可W通過任何途徑給予受體。
[0026] 本發(fā)明藥物組合物可任何口服劑型的形式口服給藥，包括但不限于膠囊、片 劑、乳劑和水懸浮液、分散劑和溶液。對于日服片劑，常用載體包括乳糖和玉米淀粉。一般還 加入潤滑劑例如硬脂酸儀。為了 W膠囊形式口服給藥，適用的稀釋劑包括乳糖和無水玉米 淀粉。當口服施用水懸浮液和/或乳液時，可將活性組分懸浮或溶解在油相中，并與乳化劑 和/或懸浮劑合并。如果需要的話，可加入一些甜味劑和/或矯味劑和/或著色劑。適當時，可 將用于口服給藥的劑量單位制劑包微囊。例如，通過在聚合物、蠟等中將顆粒物質(zhì)包衣或包 埋，也可制備所述制劑已延長或維持釋放。本發(fā)明的藥物組合物可W用于補充內(nèi)源性的 KRT80蛋白的缺失或不足，通過提高KRT80蛋白的表達或增強KRT80蛋白的功能，從而治療因 KRT80蛋白減少導致的食管鱗癌。
[0027] 本發(fā)明的藥物還可與其他治療食管鱗癌的藥物聯(lián)用，其他治療性化合物可W與主 要的活性成分同時給藥，甚至在同一組合物中同時給藥。還可單獨的組合物或與主要 的活性成分不同的劑量形式單獨給予其它治療性化合物。主要成分的部分劑量可W與其它 治療性化合物同時給藥，而其它劑量可W單獨給藥。在治療過程中，可W根據(jù)癥狀的嚴重程 度、復發(fā)的頻率和治療方案的生理應答，調(diào)整本發(fā)明藥物組合物的劑量。
[0028] 本發(fā)明所述的藥物組合物也可W脂質(zhì)體輸送系統(tǒng)形式給藥，如小單層囊泡、大單 層囊泡和多層囊泡。脂質(zhì)體可有多種憐脂形成，如膽醬醇、硬脂基胺或憐脂酷膽堿。
[0029] 本發(fā)明藥物組合物可W局部給藥的藥物組合物，可W配制成軟膏、乳膏劑、混懸 劑、洗劑、散劑、溶液劑、糊劑、凝膠劑、噴霧劑、氣霧劑或油劑。
[0030] 本發(fā)明所述攜帶基因的載體是本領域已知的各種載體，如市售的載體、包括質(zhì)粒、 粘粒、隧菌體、病毒等。
[0031] 在本發(fā)明中，"探針"指能與另一分子的特定序列或亞序列或其它部分結(jié)合的分 子。除非另有指出，術語"探針"通常指能通過互補堿基配對與另一多核巧酸(往往稱為"祀 多核巧酸"）結(jié)合的多核巧酸探針。根據(jù)雜交條件的嚴謹性，探針能和與該探針缺乏完全序 列互補性的祀多核巧酸結(jié)合。探針可作直接或間接的標記，其范圍包括引物。雜交方式，包 括，但不限于:溶液相、固相、混合相或原位雜交測定法。
[0032] 所述探針具有與祀點基因的特定的堿基序列互補的堿基序列。運里，所謂"互補"， 只要是雜交即可，可W不是完全互補。運些多核巧酸通常相對于該特定的堿基序列具有 80 % W上、優(yōu)選90 % W上、更優(yōu)選95 % W上、特別優(yōu)選100 %的同源性。運些探針可W是DNA， 也可W是RNA，另外，可W為在其一部分或全部中核巧酸通過PNA(Polyamide nucleic acid,膚核酸）、LNA(注冊商標，locked nucleic acid，&ridged Nucleic Acid,交聯(lián)化核 酸）、ENA(注冊商標，2' -0,4' -C-Ethylene-bridged nucleic acids)、GNA(Glycerol nucleic acid,甘油核酸）、TNA(T虹eose nucleic acid,蘇糖核酸)等人工核酸置換得到的 多核巧酸。
[0033] 本發(fā)明中所述KRT80蛋白的特異性抗體包括單克隆抗體、多克隆抗體、多特異性抗 體(例如雙特異性抗體）、及抗體片段、組合抗體等，只要它們展現(xiàn)出期望的生物學活性。
[0034] 本發(fā)明中"單克隆抗體"指從一群基本上同質(zhì)的抗體獲得的抗體，即構成群體的各 個抗體相同和/或結(jié)合相同表位，除了生產(chǎn)單克隆抗體的過程中可能產(chǎn)生的可能變體外，此 類變體一般W極小量存在。此類單克隆抗體典型的包括包含結(jié)合祀物的多膚序列的抗體， 其中祀物結(jié)合多膚序列是通過包括從眾多多膚序列中選擇單一祀物結(jié)合多膚序列在內(nèi)的 過程得到的。
[0035] 克隆抗體在本發(fā)明中明確包括"嵌合"抗體，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與衍生 自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類別或亞類的抗體中的相應序列相同或同源，而鏈的剩余部分 與衍生自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類別或亞類的抗體中的相應序列相同或同源，W及此類 抗體的片段，只要它們展現(xiàn)出期望的生物學活性。
[0036] "完整抗體"在本發(fā)明中指包含兩個抗原結(jié)合區(qū)及化區(qū)的抗體。優(yōu)選的是，完整抗 體具有功能性Fc區(qū)。
[0037] "抗體片段"包含完整抗體的一部分，優(yōu)選包含其抗原結(jié)合區(qū)。抗體片段的例子包 括化b Jab/、F(ab/ )2和Fv片段;雙抗體;線性抗體;單鏈抗體分子;及由抗體片段形成的多 特異性抗體。
[0038] 本領域技術人員將認識到，本發(fā)明的實用性并不局限于對本發(fā)明的標志物基因的 任何特定變體的基因表達進行定量。作為非限制性的實例，標志物基因可具有SEQ ID NO.1 或SEQ ID NO.2指定的編碼序列或氨基酸序列。在一些實施方案中，其具有與所列的序列至 少85%相同或相似的cDNA序列或氨基酸序列，諸如上述所列的序列至少90%、91 %、92%、 93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%相同或相似的cDNA序列或氨基酸序列。
[0039] 在本發(fā)明的上下文中，KRT80基因表達產(chǎn)物包括人KRT80蛋白W及KRT80蛋白的部 分膚。所述KRT80蛋白的部分膚含有與食管鱗癌病相關的功能域。
[0040] "KRT80蛋白"包括KRT80蛋白W及KRT80蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物 包括KRT80蛋白保守性變異蛋白質(zhì)、或其活性片段，或其活性衍生物或其突變體。突變體包 括等位變異體、天然突變體、誘導突變體、其氨基酸序列通過缺失、替代、增加和/或插入發(fā) 生變異的突變體、在高或低的嚴緊條件下能與人KRT80的DNA雜交的DNA所編碼的蛋白質(zhì)。
[0041] 通常，一個蛋白質(zhì)中一個或多個氨基酸的修飾不會影響蛋白質(zhì)的功能。本領域技 術人員會認可改變單個氨基酸或小百分比的氨基酸或?qū)Π被嵝蛄械膫€別添加、缺失、插 入、替換是保守修飾，其中蛋白質(zhì)的改變產(chǎn)生具有相似功能的蛋白質(zhì)。提供功能相似的氨基 酸的保守替換表是本領域公知的。
[0042] 氨基酸序列的修飾可W源自自發(fā)突變或遺傳后修飾，也可W人工誘導天然基因產(chǎn) 生。通過添加一個氨基酸或多個氨基酸殘基修飾的蛋白質(zhì)的例子是KRT80蛋白的融合蛋白。 對于與KRT80蛋白融合的膚或者蛋白質(zhì)沒有限制，只要所得的融合蛋白保留KRT80蛋白的生 物學活性即可。
[0043] 在本發(fā)明中，所述RNA干擾(RNA interference，RNAi)是指在進化過程中高度保守 的、由雙鏈RNA(doub 1 e-stranded RNA，dsRNA)誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。使 用RNAi技術可W特異性剔除或關閉特定基因的表達，該技術已被廣泛用于探索基因功能和 傳染性疾病及惡性腫瘤的基因治療領域。W細胞為基礎的RNAi篩選在功能基因?qū)W研究方面 具有許多優(yōu)勢，主要表現(xiàn)在大多數(shù)細胞類型都能使用RNAi方法，并且相對較容易下調(diào)或沉 默任何目的基因的表達。
[0044] 在本發(fā)明中，術語"宿主細胞"包括原核細胞和真核細胞。常用的原核宿主細胞的 例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞、昆蟲細胞和哺乳動物 細胞。較佳地，該宿主細胞是真核細胞，如C冊細胞、COS細胞等。
[0045] 在本發(fā)明中，術語"治療"是指包括但不限于治愈，減緩(減少)祀定的病理狀況或 病癥或防止復發(fā)。包括但不限于，（1)抑制作用，在一定程度上抑制疾病進展，其包括減緩W 及完全抑制；（2)減少疾病發(fā)作和/或癥狀的數(shù)量；（3)減少病灶尺寸；（4)抑制（即減少、減緩 或完全阻止)疾病細胞滲透到相鄰的周邊器官和/或組織；（5)抑制（即減少、減緩或完全阻 止)疾病傳播；（6)在一定程度上緩解與疾病相關聯(lián)的一種或多種癥狀；（7)治療后增加無病 表現(xiàn)的時間長度；（8)在治療后的給定時間點減少死亡率;和/或(9)治療后無副作用。本發(fā) 明的優(yōu)點和有益效果：
[0046] 本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了與食管鱗癌發(fā)生發(fā)展相關的分子標志物一KRT80,通過檢測受 試者食管組織中KRT80的表達，可W判斷受試者是否患有食管鱗癌。
[0047] 本發(fā)明提供了治療食管鱗癌的分子祀標，通過祀向于分子標志物來治療疾病具有 敏感性和特異性。
[004引本發(fā)明對食管鱗癌的機制研究提供了一定的理論基礎。
【附圖說明】
[0049]圖1顯示利用QPCR檢測KRT80基因在食管鱗癌組織中的表達情況；
[0050] 圖2顯示利用QPCR檢測KRT80基因在食管細胞中的表達情況；
[0化1 ] 圖3顯示利用QPCR檢測siRNA對KRT80基因表達的影響；
[0052] 圖4顯示軟瓊脂克隆形成實驗檢測KRT80表達對細胞增殖的影響；
[0053] 圖5顯示利用transwell小室檢測KRT80基因?qū)κ彻荀[癌細胞侵襲的影響。
[0054] 具體的實施方式
[0055] 下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步詳細的說明。W下實施例僅用于說明本 發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條 件，例如Sambrook等人，分子克?。簩嶒炇沂謨?New York:Cold Spring化rborLaboratoiy Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0056] 實施例1篩選與食管鱗癌相關的基因標志物
[0化7] 1、樣品收集
[005引各收集6例周圍正常食管粘膜組織和食管鱗癌組織，患者均知情同意，上述所有標 本的取得均通過組織倫理委員會的同意。
[0059] 2、RNA樣品的制備(利用QIAGEN的組織RNA提取試劑盒進行操作）
[0060] 取出凍存于液氮中的組織樣本，把組織樣本放入已預冷的研鉢中進行研磨，按照 試劑盒中的說明書提取分離RNA。具體如下：
[0061] 1)加入 Trizol，室溫放置 5min;
[0062] 2)加入氯仿0.2ml，用力振蕩離屯、管，充分混勻，室溫下放置5-lOmin;
[0063] 3)1200化pm離屯、15min，將上層水相移到另一新的離屯、管中（注意不要吸到兩層水 相之間的蛋白物質(zhì)），加入等體積的-20°C預冷的異丙醇，充分顛倒混勻，置于冰上lOmin;
[0064] 4)12000rpm高速離15min后小屯、棄掉上清液，按Iml/ml Trizol的比例加入75% DEPC乙醇洗涂沉淀(4°C保存），洗涂沉淀物，振蕩混勻，4°C，12000巧m離屯、5min;
[0065] 5)棄去乙醇液體，室溫下放置5min，加入DEPC水溶解沉淀；
[0066] 6)用Nano化OP2000紫外分光光度計測量RNA純度及濃度，凍存于-70°C冰箱。
[0067] 3、逆轉(zhuǎn)錄和標記
[0068] 用Low RNA I叩ut Linear Amplification Kit將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，同時用切3 分別標記實驗組和對照組。
[0069] 4、雜交
[0070] 基因忍片采用Aglient公司的人全基因組表達譜忍片，每張忍片包括45015個寡核 巧酸，其中有43376個人基因探針和1639個實驗控制探針。按忍片使用說明書的步驟進行， 溫度在65°C，經(jīng)17h lOr/min滾動雜交，37°C洗片。
[0071] 5、數(shù)據(jù)處理
[0072] 雜交后忍片用Agilent掃描儀掃描，分辨率為5皿，掃描儀自動W100%和10%PMT 各掃描1次，2次結(jié)果Agilent軟件自動合并。掃描圖像數(shù)據(jù)采用FeatureExtraction進行處 理分析，得到的原始數(shù)據(jù)應用Bioconductor程序包進行后續(xù)數(shù)據(jù)處理。最后Ratio值為實驗 組和對照組。差異基因篩選標準:ratio>4為上調(diào)基因，ratio《0.25為下調(diào)基因。
[007；3] 6、結(jié)果
[0074] 與正常食管粘膜組織相比，KRT80基因在食管鱗癌組織中的表達量顯著上調(diào)。
[0075] 實施例2QPCR測序驗證KRT80基因的差異表達
[0076] 1、對KRT80基因差異表達進行大樣本QPC閲金證。按照實施例1中的樣本收集方式選 擇正常食管組織和食管鱗癌組織各50例。
[0077] 2、RNA提取步驟如實施例1所述。
[007引 3、逆轉(zhuǎn)錄：
[00巧]1)反應體系：
[0080]
[0081] 2)逆轉(zhuǎn)錄反應條件
[0082] 按照RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0中逆轉(zhuǎn)錄反應條件進行。
[0083] 42°C~55°C60min，99°C2min，5°C5min。
[0084] 3)聚合酶鏈反應
[0085] 1)引物設計
[00化]根據(jù)Genebank中KRT80基因和GAPDH基因的編碼序列設計QPCR擴增引物，由博邁德 生物公司合成。具體引物序列如下：
[0087] KRT80 基因：
[008引正向引物為5'-GGAGAAGGTTGAGGAGTT-3'（沈Q ID N0.3);
[0089] 反向引物為5'-GCTGAACAAAGGTGAACT-3'（沈Q ID N0.4)。
[0090] 管家基因 GAPDH的引物序列為：
[0091] 正向引物：5'-CTCTGGTAAAGTGGATATTGT-3'（SEQ ID N0.5)
[0092] 反向引物:5'-GGTGGAATCATATTGGAACA-3'（沈Q ID N0.6)
[0093] 2)按照表1配制PCR反應體系：
[0094] 表1PCR反應體系
[00 巧]_
[0096] 3)PCR反應條件：95°C lOmin，（95°C 15s，60°C45s) X 30個循環(huán)。WSYBR Green作為 巧光標記物，在Li曲t切cler巧光定量PCR儀上進行PCR反應，通過融解曲線分析和電泳確 定目的條帶，Δ Δ CT法進行相對定量。
[0097] 5、統(tǒng)計學方法
[0098] 實驗都是按照重復3次來完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是W平均值±標準差的方式來表示， 采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件來進行統(tǒng)計分析的，兩者之間的差異采用t檢驗，認為當P<0.05時具 有統(tǒng)計學意義。
[0099] 6、結(jié)果
[0100] 結(jié)果如圖1所示，與周圍正常食管粘膜組織相比，KRT80基因在食管鱗癌組織中表 達上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義(P<〇. 05)，同RNA-S巧結(jié)果一致。
[0101] 實施例3KRT80基因在食管癌細胞系中的差異表達
[0102] 1、細胞培養(yǎng)
[0103] 人食管鱗癌細胞株KYSE 150、KYSE450購自中科院腫瘤研究所，正常食管上皮細胞 株化t-la購自于廣州吉尼歐公司。W含10%胎牛血清和1%ΡΛ的培養(yǎng)基DMEM在37°C、5% C〇2、相對濕度為90 %的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2-3天換液1次，使用0.25 %含抓ΤΑ的膜蛋白酶常規(guī) 消化傳代。
[0104] 2、細胞總RNA的提取
[0105] 1)膜酶消化貼壁細胞，吹打獲得的細胞經(jīng)離屯、、重懸、清洗后，W1640培養(yǎng)基（10% 小牛血清)重懸；
[0106] 2)將重懸的細胞轉(zhuǎn)移至6孔板(/孔），添加培養(yǎng)基至2ml/孔，輕搖6孔板使細胞均勻 重懸；
[0107] 3)細胞貼壁生長4她，去培養(yǎng)基；
[0108] 4) W 1ml化izol試劑裂解細胞，反復吹打6孔板壁，盡量使細胞完全裂解；
[0109] 5)轉(zhuǎn)移細胞裂解液至1.5ml DEPC處理過的EP管中，置于冰上。加入0.2ml氯仿，剩 余操作步驟同組織中RNA提取過程。
[0110] 3、逆轉(zhuǎn)錄
[0111] 具體步驟同實施例2.
[0112] 4、統(tǒng)計學方法
[0113] 實驗都是按照重復3次來完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是W平均值±標準差的方式來表示， 采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件來進行統(tǒng)計分析的，兩者之間的差異采用t檢驗，認為當P<0.05時具 有統(tǒng)計學意義。
[0114] 5、結(jié)果
[0115] 結(jié)果如圖2所示，與食管上皮細胞相比，KRT80基因在食管鱗癌細胞KYSE150、 KYSE450中表達均上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，同RNA-S巧結(jié)果一致。
[0116] 實施例4KRT80基因的沉默
[0117] 1、細胞培養(yǎng)
[011引人食管鱗癌細胞株KYSE 150，W含10%胎牛血清和1%ΡΛ的培養(yǎng)基DMEM在37°C、 5 % C02、相對濕度為90 %的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2-3天換液1次，使用0.25 %含EDTA的膜蛋白酶常 規(guī)消化傳代。
[0119] 2、siRNA 設計
[0120] 針對KRT80基因的siRNA序列：
[0121 ]陰性對照siRNA序列(siRNA-NC):
[0122] 正義鏈為5'-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3'（沈Q ID N0.7)，
[0123] 反義鏈為5'-ACGUGACACGUUCGGAGAA-3'（沈Q ID N0.8);
[0124] siRNAl-KRT80：
[0125] 正義鏈為5'-AUCUAAUGCAGUCUAGAAGAG-3'（沈Q ID N0.9)，
[0126] 反義鏈為5'-CUUCUAGACUGCAUUAGAUUC-3'（SEQ ID NO.IO);
[0127] siRNA2-KRT80：
[012引 正義鏈為5'-UGACAUUUCGGUGAUUUUGAU-3'（沈Q ID N0.11)，
[0129] 反義鏈為5'-CAAAAUCACCGAAAUGUCAGA-3'（沈Q ID N0.12);
[0130] 將細胞按5 X ΙΟ5/孔接種到六孔細胞培養(yǎng)板中，在37°C、5%C〇2培養(yǎng)箱中細胞培養(yǎng) 2 4 h，在無雙抗、含10 % F B S的D Μ E Μ培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)染按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑2 0 0 0 (購自于 Invi trogen公司）的說明書轉(zhuǎn)染，實驗分為對照組化YSE 150)陰性對照組(siRNA-NC)和實 驗組（20nM) (SiRNAl-KRT80、siRNA2-KRT80、），其中陰性對照組SiRNA與KRT80基因的序列無 同源性，濃度為20nM/孔，同時分別進行轉(zhuǎn)染。
[0131] 3、QPCR檢測KRT80基因的轉(zhuǎn)錄水平
[0132] 3.1細胞總RNA的提取
[0133] 具體步驟同實施例3。
[0134] 3.2逆轉(zhuǎn)錄步驟同實施例2。
[0135] 3.3QPCR擴增步驟同實施例2。
[0136] 4、統(tǒng)計學方法
[0137] 實驗都是按照重復3次來完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是W平均值±標準差的方式來表示， 采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件來進行統(tǒng)計分析的，干擾KRT80基因表達組與對照組之間的差異采 用t檢驗，認為當P<0.05時具有統(tǒng)計學意義。
[013引5、結(jié)果
[0139] 結(jié)果如圖 3顯示，相比KYSE 150、轉(zhuǎn)染空載siRNA-NC、siRNA2-KRT80組，siRNAl- KRT80組能夠顯著降低KRT80基因的表達，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
[0140] 實施例5KRT80基因?qū)κ彻荀[癌細胞調(diào)亡的影響
[0141] 使用流式細胞儀檢測KRT80基因?qū)毎{(diào)亡的影響。
[0142] 1、細胞培養(yǎng)步驟同實施例3。
[0143] 2、細胞轉(zhuǎn)染步驟同實施例3。
[0144] 3、步驟
[0145] 細胞轉(zhuǎn)染72h后，使用預冷PBS洗涂細胞，然后用0.25%膜酶消化細胞，中止消化， 將離屯、收集的細胞使用PBS重懸，將細胞定量為IX 106個/ml,取20化1上述細胞懸液放置到 E卵endorf管中，加入10μ1 Annexin-V-FITC混勻，室溫暗處解育染色15min，上機前5min加 入lOmg/L艦化丙錠(PI)染色扣1。未轉(zhuǎn)染SiRNA的細胞分別用Annexin-V-門TC和PI染色用于 標準定量。用FACS流式細胞儀進行雙色巧光細胞流式計數(shù)，觀察調(diào)亡細胞百分比。
[0146] 3、統(tǒng)計學方法
[0147] 實驗都是按照重復3次來完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是W平均值±標準差的方式來表示， 采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件來進行統(tǒng)計分析的，兩者之間的差異采用的t檢驗，認為當P<0.05時 具有統(tǒng)計學意義。
[014引4、結(jié)果：
[0149] 轉(zhuǎn)染siRNAl-KRT80組的細胞調(diào)亡率為（17.31±0.015)%，轉(zhuǎn)染siRNA-NC空載體組 的細胞調(diào)亡率為（6.27±0.009) %，上述差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05)，上述結(jié)果表明， KRT80基因的過表達抑制食管鱗癌細胞的調(diào)亡。
[0150] 實施例6軟瓊脂克隆形成實驗
[0151] 1、用0.25%膜蛋白酶消化轉(zhuǎn)染后處于對數(shù)生長期的細胞，輕輕吹打使之成為單細 胞懸液，離屯、收集細胞沉淀。
[0152] 2、用含20 %胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基重懸，適當稀釋后計數(shù)，調(diào)整細胞濃度為5 Xl〇3 個/ml。
[0153] 3、制備兩個濃度分別為1.2%和0.7%的低溶點瓊脂糖液，高壓滅菌后，維持在40 °(：水浴中。
[0154] 4、1.2%的瓊脂糖和2 X DMM培養(yǎng)基1:1混合，加入2 X抗生素和20%的小牛血清， 取3ml混合液注入直徑6cm平皿中放置5min冷卻凝固，作為底層瓊脂置于C〇2溫箱中備用。 [0K5] 5、在無菌試管中1:1混合0.7 %的瓊脂糖和2 X DMEM培養(yǎng)基，再向管中加入0.2ml濃 度為5X103個/ml的穩(wěn)定感染細胞懸液，充分混勻，注入上述平皿中，逐漸形成雙瓊脂層，每 個實驗組重復4個樣本。
[0156] 6、待上層瓊脂凝固后，置入37 °C 5 % C〇2溫箱中培養(yǎng)，每3天加培養(yǎng)基1.5ml。
[0157] 7、培養(yǎng)14天后取出培養(yǎng)皿，用1ml濃度為0.005%的龍膽紫染色90min。把平皿放置 在倒置顯微鏡下觀察，每組細胞隨機選取10個低倍視野，鏡下技術形成的細胞克隆數(shù)。
[015引8、結(jié)果
[0159] 結(jié)果如圖4所示，與其他組相比，siRNAl-KRT80組單細胞克隆集落形成數(shù)顯著降 低。
[0160] 實施例7Transwell細胞體外侵襲實驗
[0161 ] 1、向Transwell小室的上孔中加入100μΙ的無血清培養(yǎng)液Matrigel浸泡30min。
[0162] 2、用膜酶消化處于對數(shù)生長期的穩(wěn)定感染后各組細胞，PBS清洗細胞3次，用含有 10%血清的培養(yǎng)液重懸細胞，調(diào)整細胞濃度為1 X lOVml。
[0163] 3、向包被有Matr i ge 1的Transwe 11小室的上室中加入細胞懸液200μ 1。
[0164] 4、Transwe 11小室的下室中加入600μ1含20 % FBS的DMEM培養(yǎng)液。
[01化]5、37°C，5%C02溫箱內(nèi)培養(yǎng)2地。
[0166] 6、除去上室和下室中的培養(yǎng)液，用棉簽刮除上室中的Ma化i ge 1和存留的細胞，用 PBS清洗2次。
[0167] 7、用1 %結(jié)晶紫染色液染色45min，PBS清洗1次。
[0168] 8、隨機選取4個100倍視野，在顯微鏡下分別計數(shù)侵襲細胞數(shù)，每種不同類型的細 胞設3個復孔，共重復3次。
[0169] 9、數(shù)據(jù)處理
[0170] 用SPSS18.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。計量資料用均數(shù)±標準差表示。多個樣 本均數(shù)比較采用單因素方差分析，P<〇.05為差異有統(tǒng)計學意義。
[0171] 10、結(jié)果
[0172] 結(jié)果如圖5所示，KYSE150、siRNAl-KRT80、siRNA-NC組細胞在化answell小室中培 養(yǎng)2地后，siRNAl-KRT80組聚碳酸醋膜下室面的細胞數(shù)顯著減少。
[0173] 上述實施例的說明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核屯、思想。應當指出，對于本 領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可W對本發(fā)明進行若干改進 和修飾，運些改進和修飾也將落入本發(fā)明權利要求的保護范圍內(nèi)。
【主權項】
1. 一種基因及其表達產(chǎn)物在制備診斷食管鱗癌的產(chǎn)品中的應用，其特征在于，所述基 因為KRT80。2. 根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于，所述產(chǎn)品包括通過RT-PCR、實時定量PCR、 免疫檢測、原位雜交或芯片檢測KRT80基因及其表達產(chǎn)物的表達水平以診斷食管鱗癌的產(chǎn) 品。3. 根據(jù)權利要求2所述的應用，其特征在于，所述用實時定量PCR診斷食管鱗癌的產(chǎn)品 至少包括一對特異性擴增KRT80基因的引物，所述引物如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。4. 一種診斷食管鱗癌的產(chǎn)品，其特征在于，所述產(chǎn)品能夠通過檢測樣本中KRT80基因的 表達水平來診斷食管鱗癌。5. 根據(jù)權利要求4所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述產(chǎn)品包括芯片、或試劑盒;其中，所述 芯片包括基因芯片、蛋白質(zhì)芯片;所述試劑盒包括基因檢測試劑盒、蛋白免疫檢測試劑盒。 6. KRT80基因及其表達產(chǎn)物在制備治療食管鱗癌的藥物組合物中的應用。7. 根據(jù)權利要求6所述的應用，其特征在于，所述藥物組合物包括KRT80基因和/或其表 達產(chǎn)物的抑制劑。8. 根據(jù)權利要求7所述的應用，其特征在于，所述抑制劑包括抑制KRT80基因表達的物 質(zhì)、抑制KRT80基因表達產(chǎn)物穩(wěn)定性的物質(zhì)、和/或抑制KRT80基因表達產(chǎn)物活性的物質(zhì)。9. 一種治療食管鱗癌的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物包括權利要求7或8 所述的抑制劑。10. 根據(jù)權利要求9所述的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物還包括藥學上可 接受的載體。
【文檔編號】C12Q1/68GK106011295SQ201610616386
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年7月29日
【發(fā)明人】楊承剛, 邊洋
【申請人】北京泱深生物信息技術有限公司