miRNA在軟骨母細胞型骨肉瘤診斷中的用圖
【專利摘要】本發(fā)明公開了miRNA在軟骨母細胞型骨肉瘤診斷中的用途，所述miRNA為miRNA?4482?3p。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了miRNA?4482?3p與骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展相關，可作為骨肉瘤的分子標志物。鑒于此，本發(fā)明提供了用于骨肉瘤早期診斷的產(chǎn)品，該產(chǎn)品在臨床上具有較好的應用前景。
【專利說明】
m i RNA在軟骨母細胞型骨肉瘤診斷中的用途
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領域，設及miRNA在軟骨母細胞型骨肉瘤診斷中的用途，具體 的所述 miRNA 為 miRNA-4482-化。
【背景技術】
[0002] microRNA是一種不編碼蛋白質的，約21-25nt大小的單鏈小分子RNA。通過特異性 的結合祀基因來調控其表達。從1993年，第一個mi croRNA: 1 in-4被發(fā)現(xiàn)后，在過去的幾十 年，大量的microRNA被發(fā)現(xiàn)并認為在細胞的發(fā)生、分化、增殖和調亡起著重要的作用。據(jù)報 道，miRNAs調控人類60 %編碼蛋白基因的表達，通過結合其目標基因 mRNA的3 '非翻譯區(qū)而 導致mRNA的降解或者翻譯抑制。除了沉默作用外，某些miRNAs還被證實能激活基因的表達。 在不同的腫瘤類型中，microRNA呈現(xiàn)兩種不一樣的角色:抑癌基因和癌基因。主要的作用機 制包括:miRNA位點的缺失、擴增、突變，表觀遺傳水平改變，轉錄調控因子的異常表達等。
[0003] 原發(fā)性骨腫瘤臨床較為罕見，每百萬人口中僅約有10例被診斷該病，而在運10例 之中大約2-5例，就可能是患有骨肉瘤，運一現(xiàn)象在兒童和青少年人群中尤其常見。雖然骨 肉瘤發(fā)病率并不算高，但其卻是最常見的原發(fā)性骨惡性腫瘤，其惡性程度甚高，進展迅速， 極易發(fā)生早期肺轉移，是兒童和青少年群體中引起腫瘤相關性死亡的最主要誘因，給患者 及其家庭帶來極大的精神損害，給社會乃至國家亦帶來沉重的經(jīng)濟負擔。骨肉瘤發(fā)病率男 女比例約為1.5:1，近80%-90%發(fā)生與股骨、腔骨和化骨等，發(fā)生在手和足等四肢末端的不 到1%。骨肉瘤患者預后很差，高分化骨肉瘤單純手術切除后5年生存率小于20%，近年來應 用新輔助化療治療骨肉瘤使得骨肉瘤患者長期生存率有了大幅提高，無轉移的高分化骨肉 瘤患者5年生存率從原來的小于20%提高到60%-70%。但是，轉移或者復發(fā)的患者長期生 存率仍低于20%，對化療藥物的耐藥是造成治療失敗及復發(fā)的主要原因。
[0004] 骨肉瘤可分為不同的亞型，其中軟骨母細胞型骨肉瘤為骨肉瘤的一種亞型。軟骨 母細胞型骨肉瘤W產(chǎn)生軟骨基質為主，大多為高級別透明軟骨，除了頌骨和盆骨的軟骨母 細胞型骨肉瘤W外，腫瘤內的軟骨基質很少有明顯黏液變性或出現(xiàn)其他形式的軟骨肉瘤成 分。軟骨母細胞型骨肉瘤的瘤組織中，1/2W上呈軟骨肉瘤樣結構，在此基礎上可化生形成 腫瘤骨。軟骨母細胞型骨肉瘤作為普通型骨肉瘤的一個亞型和其他普通型骨肉瘤的臨床治 療和預后并無大的差別。
[0005] 由于骨肉瘤給人類健康帶來的巨大危害，研究者們正通過各種途徑尋找有效的治 療骨肉瘤的方法。分子祀向治療正在被嘗試應用到骨肉瘤的診斷和治療當中。最近的研究 表明microRNA(miRNA)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，尋找與骨肉瘤發(fā)生發(fā)展相關 的miRNA對骨肉瘤的機制研究W及臨床上的診斷和治療就有重要的意義。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明的目的之一在于提供一種用于骨肉瘤診斷的miRNA,該miRNA為miRNA- 4482-3p〇
[0007] 本發(fā)明的目的之二，提供一種對骨肉瘤進行早期診斷的產(chǎn)品。
[0008] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術方案：
[0009] 本發(fā)明提供了檢測微小RNA的試劑在制備診斷骨肉瘤的產(chǎn)品中的應用，其中，所述 微小RNA為miRNA-4482-化或其同源物。
[0010] 進一步，所述骨肉瘤為軟骨母細胞型骨肉瘤。
[0011] 進一步，所述產(chǎn)品通過測定樣本中miRNA-4482-化或其同源物的表達水平W診斷 骨肉瘤。其中，miRNA-4482-化或其同源物在骨肉瘤患者中表達下調。
[001^ 進一步，所述產(chǎn)品包括通過使用qRT-PCR、印記雜交、原位雜交、陣列雜交、基因忍 片或新一代測序來檢測miRNA-4482-化或其同源物的水平W診斷骨肉瘤的產(chǎn)品。
[0013] 進一步，所述產(chǎn)品包括忍片和/或試劑盒。其中，所述忍片包括固相載體W及固定 在所述固相載體上的寡核巧酸探針，所述寡核巧酸探針包括特異性地對應于上面所述的 miRNA-4482-化的部分或全部序列。所述試劑盒包括用于檢測上面所述的miRNA-4482-化的 表達水平的試劑。
[0014] 進一步，所述試劑盒包括擴增miRNA-4482-化的引物對，序列如SEQ ID N0.2和SEQ ID NO.3所示。
[0015] 本發(fā)明提供了一種診斷骨肉瘤的產(chǎn)品，所述產(chǎn)品能夠通過檢測樣本中miRNA- 4482-化或其同源物的水平來診斷骨肉瘤。
[0016] 進一步，所述樣本包括血液、尿液、腦脊液、組織液、汗液、唾液、淚液。在本發(fā)明的
【具體實施方式】中，所述樣本為血液。
[0017]進一步，所述產(chǎn)品包括通過使用qRT-PCR、印記雜交、原位雜交、陣列雜交、基因忍 片或新一代測序來檢測miRNA-4482-化或其同源物的表達水平。
[0018] 進一步，所述產(chǎn)品包括忍片和/或試劑盒。其中，所述忍片包括固相載體；W及固定 在所述固相載體上的寡核巧酸探針，所述寡核巧酸探針包括特異性地對應于上面所述的 miRNA-4482-化的部分或全部序列。所述試劑盒包括針對miRNA-4482-化的引物和/或探針。
[0019] 在本發(fā)明中，試劑盒還包括針對現(xiàn)有技術中已經(jīng)報道的用于診斷骨肉瘤的miRNA 的引物和/或探針。將多種miRNA的檢測引物和/或探針放置在同一試劑盒中通過檢測多種 miRNA指標聯(lián)合診斷骨肉瘤的情況也包含在本發(fā)明的保護范圍之內。
[0020] 所述忍片（即微陣列）包含針對miRNA-4482-化特異性的一組寡核巧酸（如寡脫氧 核巧酸)探針。通過使用該微陣列，可通過逆轉錄RNAW產(chǎn)生一組祀寡脫氧核巧酸，然后使其 與微陣列上的探針寡脫氧核巧酸雜交，從而產(chǎn)生雜交或表達譜，來測定生物樣品中多種微 小RNA的表達水平。miRNA特異性的探針寡核巧酸或對miRNA特異性的探針寡核巧酸是指具 有經(jīng)選擇與特定miRNA基因產(chǎn)物雜交或與該特定miRNA基因產(chǎn)物的逆轉錄物雜交的序列的 探針寡核巧酸。
[0021] 在本發(fā)明的【具體實施方式】中，所述miRNA-4482-3p核巧酸序列如序列表中的SEQ ID NO. 1 所示。
[0022] 應當知道，本發(fā)明的miRNA-4482-3p包括組成型核酸分子的功能等同物，即變體， "變體"是指，與對應野生型miRNA基因產(chǎn)物具有少于100%的同一性并且具有對應野生型 miRNA基因產(chǎn)物的一個或多個生物活性的miRNA。此類生物活性的實例包括但不限于，與骨 肉瘤發(fā)生發(fā)展的細胞過程(例如，細胞分化、細胞生長、細胞死亡）的抑制。運些變體包括物 種變體和由于miRNA基因的一個或多個突變(例如，置換、缺失、插入)而產(chǎn)生的變體。在某些 實施方案中，變體與對應野生型miRNA基因產(chǎn)物具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、 95%、98%或99%的同一性。其顯示完整11111?^4-4482-3口核酸分子相同的功能，它們可能通 過核巧酸殘基的缺失、置換或者插入而突變。
[0023] 本領域人員熟知，為了保證miRNA的穩(wěn)定性，可W在miRNA的一端或者兩端增加保 護性堿基，如TT，也可對miRNA堿基進行修飾，但是不影響miRNA的功能。因此，本領域技術人 員熟知，在不影響miRNA-4482-化功能的條件下，對miRNA-4482-化進行堿基修飾或者在兩 端增加堿基獲得的序列同樣包含在本發(fā)明的保護范圍之內。
[0024] 本發(fā)明的miRNA-4482-化核酸分子可單鏈或雙鏈的形式存在。成熟的miRNA- 4482-化主要呈單鏈形式，而miRNA-4482-化前體是部分自互補的，W形成雙鏈結構。本發(fā)明 的核酸分子可W是RNA、DNA、PNA、LNA的形式。
[00巧]根據(jù)SEQ ID NO. 1所示的核酸序列，可W生成用于給定miRNA基因產(chǎn)物的RNA印記 雜交的合適探針，包括但不限于，與目標miRNA基因產(chǎn)物具有至少約70%、75%、80%、85%、 90 %、95 %、98 %、99 %或完全互補的探針。標記的DNA和RNA采用常規(guī)方法制備，例如核酸探 針用下述物質標記，如放射性核素3山32?、33?、1伯或355，重金屬，能起到標記配體的特異 性結合對成員功能的配體如生物素、抗生物素蛋白或抗體等，巧光分子，化學發(fā)光分子、酶 等。
[0026] 通過切口平移法或隨機引物法，可W將探針標記成高比放射性，后者是從單鏈DNA 或從RNA模板合成高比放射性的32P-標記的探針的選擇方法。例如，通過根據(jù)切口平移法用 高效放射性的核巧酸替換現(xiàn)有的核巧酸，可W制備比放射性大大超過108邱m/微克的32P- 標記的核酸探針。然后通過使雜交的濾膜曝光于照相膠片，可W進行雜交的放射自顯影檢 測。對雜交的濾膜曝光的照相膠片的光密度掃描，會提供miRNA基因轉錄產(chǎn)物水平的精確測 量。
[0027] 本發(fā)明所述的寡核巧酸探針還可包括針對現(xiàn)有技術中已經(jīng)報道的可用于診斷骨 肉瘤的miRNA的寡核巧酸探針。將多種miRNA的檢測探針放置在同一忍片上通過檢測多種 miRNA指標聯(lián)合診斷骨肉瘤的情況也包含在本發(fā)明的保護范圍之內。上面所述試劑還包括 針對現(xiàn)有技術中已經(jīng)報道的診斷骨肉瘤miRNA的引物和/或探針。將多種miRNA的檢測引物 和/或探針放置在同一試劑盒中通過檢測多種miRNA指標聯(lián)合診斷骨肉瘤的情況也包含在 本發(fā)明的保護范圍之內。
[0028] 所述的miRNA忍片的制備可采用本領域已知的生物忍片的常規(guī)制造方法，例如，如 果固相載體采用的是修飾玻片或娃片，探針的5'端含有氨基修飾的聚dT串，可將寡核巧酸 探針配制成溶液，然后采用點樣儀將其點在修飾玻片或娃片上，排列成預定的序列或陣列， 然后通過放置過夜來固定，就可得到本發(fā)明的miRNA忍片。如果核酸不含氨基修飾，則其制 備方法也可參照：王申五主編的《基因診斷技術-非放射性操作手冊》；J.L.erisi， V.R.Iyer，P.O.BROWN.Exploring the metabolic and genetic control of gene expression on a genomic scale.Science, 1997;278:680和馬立人，蔣中華主編.生物忍 片.北京:化學工業(yè)出版社，2000，1-130。
[0029] 本發(fā)明的miRNA-4482-3p可W是天然的或是人工合成的，或者使用可W表達 miRNA-4482-化的DNA片段的載體轉染細胞獲得。
[0030] 可W表達miRNA-4482-3p的DNA片段可w通過如下方式獲?。簭膍iRNA數(shù)據(jù)庫中 化t1:p V/microrna. sanger .ac .uk/sequences/)尋找miRNA-4482-化在基因組上的位置及 具體序列信息，根據(jù)基因組序列確定miRNA-4482-化初始miRNA的位置，在miRNA-4482-化初 始miRNA位置的上下游500-80化P區(qū)間內設計特異性引物，擴增引物中間的序列即可獲得表 達miRNA-4482-化的DNA片段。
[0031] 在本發(fā)明中，"陣列"或"微陣列"是雜交陣列原件有序排列在基質上，所述雜交陣 列原件諸如聚核巧酸探針（例如寡核巧酸）或結合劑（例如抗體）。所述基質可W是固體基 質，例如，玻璃或二氧化娃玻片、珠、纖維光學粘結劑或半固態(tài)基質，例如硝酸纖維素膜。核 巧酸序列可W是DNA、RNA或其中的任何排列。微陣列可從產(chǎn)生自已知miRNA序列的基因-特 異的寡核巧酸探針來制備。陣列可含有每個miRNA的巧巾不同的寡核巧酸探針，一種含有活 性的成熟序列，而另一種特異于miRNA的前體。陣列還可含有對照，諸如與人類直向同源物 僅幾個堿基不同的一種或多種小鼠序列，其可作為雜交嚴緊條件的對照。來自兩個物種的 tRNA也可印在微忍片上，提供了特異雜交的內部、相對穩(wěn)定的陽性對照。非特異雜交的一個 或多個適當?shù)膶φ找部砂ㄓ谖⑷唐稀?br>[0032] 術語"引物"涵蓋任何能夠在模板依賴性過程中啟動初生核酸的合成的核酸。引物 可為十至二十和/或Ξ十個堿基對長的寡核巧酸，也可采用更長的序列。引物可W雙鏈和/ 或單鏈形式提供，優(yōu)選的為單鏈形式。
[0033] miRNA基因產(chǎn)物的"生物活性片段"是指，具有對應野生型miRNA基因產(chǎn)物的一個或 多個生物活性的miRNA基因產(chǎn)物的RNA片段。如上文中所述，此類生物活性的實例包括但不 限于，骨肉瘤的細胞增殖過程的抑制。在某些實施方案中，生物活性片段在長度上為至少約 5、7、10、12、15或17個核巧酸。在具體的實施方案中，可將分離的miRNA基因產(chǎn)物與一種或多 種另外的抗癌治療組合來給受試者施用。適當?shù)目拱┲委煱ǖ幌抻?，化學療法、放射療 法W及組合(例如，放化療）。
[0034] 術語"miRNA基因產(chǎn)物"或"同源物"可W是任何從miRNA基因轉錄得到的產(chǎn)物，包括 初級轉錄產(chǎn)物、pre-miRNA、頸環(huán)序列、p;ri-miRNA、miRNA前體、單順反子轉錄產(chǎn)物、多順反子 轉錄產(chǎn)物、miRNA*、成熟miRNA或其變體。pre-miRNA是指具有發(fā)夾結構并含有miRNA的非編 碼RNA;頸環(huán)序列是指具有發(fā)夾結構并含有成熟miRNA序列的RNA;pri-miRNA是指非編碼 RNA，其具有作為雙鏈RNA特異性核糖核酸酶化osha的底物的發(fā)夾結構;miRNA前體是指起源 于基因組DNA的轉錄物，并包含含有一個或多個miRNA序列的非編碼結構性RNA;單順反子轉 錄產(chǎn)物是指含有單個miRNA序列的miRNA前體；多順反子轉錄產(chǎn)物是指含有兩個或更多個 miRNA序列的miRNA前體。
[0035] 本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果：
[0036] 本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了miRNA-4482-3p在骨肉瘤患者中表達下調，通過檢測miRNA- 4482-化的水平，可W判斷患者是否患有骨肉瘤或者患骨肉瘤的風險。
[0037] 本發(fā)明提供了一種診斷骨肉瘤的產(chǎn)品，該產(chǎn)品可W實現(xiàn)骨肉瘤的早期診斷，為降 低骨肉瘤患者的死亡率提供
【附圖說明】
[0038] 圖1顯示利用高通量測序檢測miRNA-4482-化在骨肉瘤患者血液中的表達情況；
[0039] 圖2顯示利用qPCR檢測miRNA-4482-化在骨肉瘤患者血液中的表達情況。
【具體實施方式】
[0040] 下面結合具體的實施例進一步說明本發(fā)明，本發(fā)明的實施例僅用于解釋本發(fā)明， 并不意味著限制本發(fā)明的保護范圍。
[0041 ]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0042] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0043] 實施例1與骨肉瘤相關的miRNA的篩選
[0044] 1、樣本獲取:收集10例軟骨母細胞型骨肉瘤患者及10名正常人。受試者要求空腹 至少12h，于次日清晨7:00~8:00室溫下，抽取10ml靜脈血于乙二胺四乙酸化DTA)抗凝管， 提取外周血單個核細胞PBMCs，加入1ml Trizol試劑（Invitrogen公司），充分混勻，-80°C保 存標本，W用于RNA提取。所有的血樣和病理結果應真實可靠，研究經(jīng)倫理委員會批準，患者 知情同意。
[0045] 2、血液單核細胞RNA的提取
[0046] 使用Invitrogen公司的RNA提取試劑盒提取總RNA。步驟如下：
[0047] (1)先加1ml化izol于1X107細胞中，若凍存細胞直接加入化izol，不需解凍，吹 打裂解后室溫靜置5-lOmin。
[004引（2)加入0.2ml氯仿(Ξ氯甲腕），劇烈震蕩15s，室溫靜置2-3min。
[0049] (3)在 4°C 下 12000g 離屯、15min。
[0050] (4)小屯、吸出上清水相約50化1移入另一離屯、管(注意不要抽到蛋白層），加入50化 1異丙醇(專用），顛倒混勻，室溫靜置lOmin。
[0051 ] (5)4°C12000g離屯、lOmin，倒去上清液，底部可見針尖大小白色物質。
[0化2] (6)加入1ml 70%乙醇旋轉洗涂，清洗異丙醇。
[0化3] (7)4°C7500g離屯、5min，去除乙醇(盡量用槍頭吸干凈)后驚5-lOmin，不要太干，否 則難W溶解，放置于-70°C保存。
[0化4] 3、RNA樣品的質量分析(Nano化oplOOO分光光度計）
[005日]NanoDrop2000分光光度計檢測RNA樣品，RNA-seq測序的樣品要求:0D260/0D280含 1.8。
[0化6] 將上述提取的RNA進行瓊脂糖凝膠電泳，Agilent 2100(RNA 6000化no kit)檢測 RNA樣品質量，在凝膠成像儀上觀測、拍照，保存圖像，要求28S: 18S > 1; RIN值^ 7.0。
[0化7] 4、SRNA文庫構建
[0化引實驗采用Illumina TruSeq Small RNA試劑盒構建文庫，在總RNA中回收長度18- 30nt RNA，通過RT-PCR逆轉錄成單鍵cDNA，cDNA擴增后，回收cDNA產(chǎn)物，建成小RNAs文庫。 [0化9] 5、測序
[0060] 運用llumina Hiseq2500/Miseq第二代高通量測序技術對mRNA和miRNA進行測序， 通過去接頭、去低質量、去污染等過程完成數(shù)據(jù)的處理，得到最終數(shù)據(jù)。
[0061] 6、結果：
[0062] 通過轉錄組數(shù)據(jù)分析軟件對miRNA原始數(shù)據(jù)進行背景校正后進行t-test得到P值， 然后利用Fisher檢驗合并P值，篩選差異表達的miRNA。設定P值<0.01且log2(Fold_ change)no;rmalized的絕對值>3作為顯著性闊值。如圖1所示，miRNA-4482-化在正常人和 骨肉瘤患者中差異表達，在軟骨母細胞型骨肉瘤患者血液中顯著下調(P<〇.05)。
[0063] 實施例2 QPCR驗證差異表達的miRNA-4482-化
[0064] 1、根據(jù)miRNA忍片的檢測結果選擇miRNA-4482-化進行大樣本QPCR驗證。按照實施 例1中的樣本收集方式選擇正常人和軟骨母細胞型骨肉瘤樣本各60例。
[00化]2、RNA提取過程同實施例1。
[0066] 3、逆轉錄：
[0067] 1)將lOpg-lyg 的總 RNA 模板與化 1 10X 緩沖液、2μ1 dATP(l〇mM)、0.化 1 polyA 多 聚酶、0.5μ1核糖核酸酶(RNase)抑制劑和無核糖核酸酶水(RNase free water)混合，體積 最后為20μ1，37Γ解育化。
[006引 2)反應管中加入化1 O.SygAU Oligo(dT)特異性RT引物，70°C解育5min。
[0069] 3)立即冰上解育至少2min，打斷RNA和引物的二級結構。
[0070] 4)將上述20μ1反應混合物與4μ1 5X緩沖液、1μ1 dNTP(10mM)，0.扣1 M-MLV逆轉 錄酶，〇.5μ1核糖核酸酶（R化se)抑制劑，10μ1 polyA反應混合液和4μ1無核糖核酸酶水 (RNase 打ee water)混合，42°C解育化。
[0071] 4、QPCR 反應：
[00巧 1)引物設計
[0073] 擴增miRNA-4482-化的引物
[0074] 正向引物：TTTCTATTTCTCAGTGGGGCTC(沈Q ID N0.2)
[0075] 反向引物:GTGCAGGGTCCGAGGT(沈Q ID N0.3)
[0076] 擴增U6snRNA的引物
[0077] 正向引物：CTCGCTTCGGCAGCACA(SEQ ID N0.4)
[007引 反向引物:AACGCTTCACGAATTTGCGT(沈Q ID N0.5)
[0079] 2)按照表1配審化CR反應體系：
[0080] 其中，SYBR Green聚合酶鏈式反應體系購自Invitrogen公司。
[0081 ] 表1 PCR反應體系 「mW
[0083] 3)PCR反應條件：95°C10min，（95°C15s，60°C60s)X45個循環(huán)。WSYBRGreen作為 巧光標記物，在Li曲t切cler巧光定量PCR儀上進行PCR反應，WU6snRNA作為參照基因，通 過融解曲線分析和電泳確定目的條帶，Δ Δ CT法進行相對定量。
[0084] 5、結果
[0085] 如圖2所示，與正常人血液相比，骨肉瘤患者血液中的miRNA-4482-化的表達水平 顯著降低，與高通量測序結果一致(p<0.05)。
[0086]上述實施例的說明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核屯、思想。應當指出，對于本 領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可W對本發(fā)明進行若干改進 和修飾，運些改進和修飾也將落入本發(fā)明權利要求的保護范圍內。
【主權項】
1. 檢測微小RNA的試劑在制備診斷骨肉瘤的產(chǎn)品中的應用，其特征在于，所述微小RNA 為miRNA-4482-3p或其同源物。2. 根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于，所述骨肉瘤為軟骨母細胞型骨肉瘤。3. 根據(jù)權利要求1或2所述的應用，其特征在于，所述產(chǎn)品通過測定樣本中miRNA-4482-3p或其同源物的表達水平以診斷骨肉瘤。4. 根據(jù)權利要求3所述的應用，其特征在于，所述miRNA-4482-3p或其同源物在骨肉瘤 患者中表達下調。5. 根據(jù)權利要求3所述的應用，其特征在于，所述產(chǎn)品包括通過使用qRT-PCR、印記雜 交、原位雜交、陣列雜交、基因芯片或新一代測序來檢測miRNA-4482-3p或其同源物的水平 以診斷骨肉瘤的產(chǎn)品。6. 根據(jù)權利要求3所述的應用，其特征在于，所述產(chǎn)品包括芯片和/或試劑盒。7. -種診斷骨肉瘤的產(chǎn)品，其特征在于，所述產(chǎn)品能夠通過檢測樣本中miRNA-4482-3p 或其同源物的水平來診斷骨肉瘤。8. 根據(jù)權利要求7所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述樣本包括血液、尿液、腦脊液、組織液、 汗液、唾液、淚液。9. 根據(jù)權利要求7所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述產(chǎn)品包括通過使用qRT-PCR、印記雜 交、原位雜交、陣列雜交、基因芯片或新一代測序來檢測miRNA-4482-3p或其同源物的表達 水平。10. 根據(jù)權利要求9所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述產(chǎn)品包括芯片和/或試劑盒;所述芯 片包括固相載體以及固定在所述固相載體上的寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針包括特異 性地對應于上面所述的miRNA-4482-3p的部分或全部序列；所述試劑盒包括針對miRNA-4482-3p的引物和/或探針。
【文檔編號】C12Q1/68GK106011294SQ201610616368
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年7月29日
【發(fā)明人】石小峰, 王曉云, 楊承剛
【申請人】北京泱深生物信息技術有限公司