Rpl8在制備診斷或治療多發(fā)性骨髓瘤工具中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，公開了RPL8基因作為多發(fā)性骨髓瘤的診治標(biāo)志物的用途。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明RPL8基因在正常骨髓組織和多發(fā)性骨髓瘤組織中的表達(dá)存在顯著差異，據(jù)此可將RPL8用于開發(fā)診斷多發(fā)性骨髓瘤的產(chǎn)品。本發(fā)明還公開了RPL8基因可作為多發(fā)性骨髓瘤的治療靶標(biāo)。本發(fā)明的研究成果為臨床醫(yī)師制定個性化治療方案提供理論基礎(chǔ)、并且能夠?yàn)槎喟l(fā)性骨髓瘤藥物的開發(fā)提供新的藥物靶點(diǎn)。
【專利說明】
RPL8在制備診斷或治療多發(fā)性骨髓瘤工具中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及腫瘤診斷、治療、預(yù)測預(yù)后領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明設(shè)及W檢測RPL8異 常為手段的腫瘤診斷、預(yù)測預(yù)后方法;及抑制RPL8基因或蛋白質(zhì)的腫瘤治療劑。
【背景技術(shù)】
[0002] 多發(fā)性骨髓瘤(Multiple myeloma,MM)是W惡性漿細(xì)胞聚集骨髓并在血液或尿液 中出現(xiàn)單克隆蛋白（M蛋白）為特征的一種惡性疾病。臨床特點(diǎn)包括易發(fā)感染、腎功能受損、 貧血、高巧血癥及溶骨性病變。MM約占所有惡性血液病的10 %，好發(fā)于老年人，隨著我國人 口老齡化，MM發(fā)病人數(shù)有增加的趨勢。目前認(rèn)為MM發(fā)生是一個逐步進(jìn)展的過程:很多患者在 早期發(fā)生意義不明的單克隆球蛋白癥(MGUS)，然后進(jìn)展為MM，部分患者最終發(fā)展為髓外骨 髓瘤(漿細(xì)胞白血?。?，整個過程中患者骨髓漿細(xì)胞伴有多種基因的突變。臨床上，根據(jù)MM的 一些臨床參數(shù)如Μ蛋白、帖-MG對歷進(jìn)行分期，W采取不同的治療措施。常用分期標(biāo)準(zhǔn)有 Durie-Salmon(DS)分期系統(tǒng)及國際分期系統(tǒng)（ISS)。ISS分期簡便易行，根據(jù)的-MG和血清白 蛋白兩個指標(biāo)將MM分為I期、II期、III期，III期患者病情與預(yù)后最差。當(dāng)前臨床治療各期MM 的主要手段有激素、烷基類藥物、免疫調(diào)節(jié)劑、蛋白酶抑制劑等，運(yùn)些方法可使MM有所緩解， 但最終難免復(fù)發(fā)，因此有待開發(fā)一些新的診斷與治療策略。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的之一在于提供一種通過檢測RPL8基因或蛋白表達(dá)差異來診斷多發(fā) 性骨髓瘤的方法。
[0004] 本發(fā)明的目的之二在于提供一種通過檢測RPL8基因或蛋白表達(dá)差異來預(yù)測多發(fā) 性骨髓瘤預(yù)后的方法。
[0005] 本發(fā)明的目的之Ξ在于提供一種通過抑制RPL8基因或RPL8蛋白來治療多發(fā)性骨 髓瘤的方法。
[0006] 本發(fā)明的目的之四在于提供一種用于篩選治療多發(fā)性骨髓瘤的藥物的方法。
[0007] 本發(fā)明的目的之五在于提供一種用于治療多發(fā)性骨髓瘤的藥物。
[000引為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：
[0009] 本發(fā)明提供了檢測RPL8基因或RPL8蛋白的產(chǎn)品在制備多發(fā)性骨髓瘤診斷工具中 的用途。
[0010] 本發(fā)明還提供了檢測RPL8基因或RPL8蛋白的產(chǎn)品在制備預(yù)測多發(fā)性骨髓瘤預(yù)后 工具中的用途。
[0011] 進(jìn)一步，所述檢測RPL8基因或RPL8蛋白的產(chǎn)品包括檢測RPL8基因或RPL8蛋白的表 達(dá)水平的產(chǎn)品。所述產(chǎn)品包括能夠結(jié)合RPL8基因的核酸或者能夠結(jié)合RPL8蛋白的物質(zhì)（例 如抗體）。所述核酸能夠檢測RPL8基因的表達(dá)水平;所述物質(zhì)能夠檢測RPL8蛋白的表達(dá)水 平。
[0012] 本發(fā)明的檢測RPL8基因的產(chǎn)品可基于使用核酸分子的已知方法來發(fā)揮其功能:如 PCR、如Southern雜交、Northern雜交、點(diǎn)雜交、巧光原位雜交(FISH)、DNA微陣列、ASO法、高 通量測序平臺等。使用該產(chǎn)品可W定性地、定量地、或半定量地實(shí)施分析。
[0013] 包含在上述產(chǎn)品中的核酸可W通過化學(xué)合成來獲得，或通過從生物材料制備含有 期望核酸的基因，然后使用設(shè)計用于擴(kuò)增期望核酸的引物擴(kuò)增它來獲得。
[0014] 進(jìn)一步，所述PCR方法為已知方法，例如，ARMS(Ampl if ication RefractoiT Mutation System,擴(kuò)增不應(yīng)突變系統(tǒng))法、RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄酶-PCR)法、嵌套PCR法等等。擴(kuò)增 的核酸可W通過使用點(diǎn)印跡雜交法、表面等離子共振法(SPR法）、PCR-RFLP法、原位RT-PCR 法、PCR-SS0 (序列特異性寡核巧酸）法、PCR-SSP法、AMPFLP (可擴(kuò)增片段長度多態(tài)性）法、 MVR-PCR法、和PCR-SSCP (單鏈構(gòu)象多態(tài)性)法來檢測。
[0015] 上面所述的核酸包括擴(kuò)增RPL8基因的引物，產(chǎn)品中包括的引物可W通過通過化學(xué) 合成來制備，通過使用本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的方法參考已知信息來適當(dāng)?shù)卦O(shè)計，并通過化 學(xué)合成來制備。
[0016] 在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述核酸為QPCR實(shí)驗(yàn)中使用的擴(kuò)增引物，所述引物 的序列如SEQ ID N0.1 (正向序列）和SEQ ID N0.2(反向序列)所示。
[0017] 上面所述的核酸還可包括探針，所述探針可W通過化學(xué)合成來制備，通過使用本 領(lǐng)域技術(shù)人員知道的方法參考已知信息來恰當(dāng)設(shè)計，并通過化學(xué)合成來制備，或者可W通 過從生物材料制備含有期望核酸序列的基因，并使用設(shè)計用于擴(kuò)增期望核酸序列的引物擴(kuò) 增它來制備。
[0018] 本發(fā)明的檢測RPL8蛋白的產(chǎn)品可基于使用抗體的已知方法來發(fā)揮其功能：例如， 可W包括化ISA、放射免疫測定法、免疫組織化學(xué)法、Western印跡等。
[0019] 本發(fā)明的檢測RPL8蛋白的產(chǎn)品包括特異性結(jié)合RPL8蛋白的抗體或其片段?？蒞使 用任何結(jié)構(gòu)、尺寸、免疫球蛋白類別、起源等的抗體或其片段，只要它結(jié)合祀蛋白質(zhì)即可。本 發(fā)明的檢測產(chǎn)品中包括的抗體或其片段可W是單克隆的或多克隆的?？贵w片段指保留抗體 對抗原的結(jié)合活性的抗體一部分(部分片段)或含有抗體一部分的膚?？贵w片段可W包括F (al/ )2、Fab/ Jab、單鏈Fv(scFv)、二硫化物鍵合的Fv(dsFv)或其聚合物、二聚化V區(qū)（雙抗 體）、或含有CDR的膚。本發(fā)明的檢測RPL8蛋白的產(chǎn)品可W包括編碼抗體或編碼抗體片段的 氨基酸序列的分離的核酸，包含該核酸的載體，和攜帶該載體的細(xì)胞。
[0020] 抗體可W通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法來獲得。例如，制備保留整個或部分祀 蛋白質(zhì)的多膚或整合編碼它們的多核巧酸的哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體作為抗原。使用抗原免 疫動物后，從經(jīng)過免疫的動物獲得免疫細(xì)胞并融合骨髓瘤細(xì)胞W獲得雜交瘤。然后從雜交 瘤培養(yǎng)物收集抗體。最后可W通過使用被用作抗原的RPL8蛋白或其部分對獲得的抗體實(shí)施 抗原特異性純化來獲得針對RPL8蛋白的單克隆抗體?？蒞如下制備多克隆抗體：用與上文 相同的抗原免疫動物，從經(jīng)過免疫的動物收集血液樣品，從血液中分離出血清，然后使用上 述抗原對血清實(shí)施抗原特異性純化?？蒞通過用酶處理獲得的抗體或通過使用獲得的抗體 的序列信息來獲得抗體片段。
[0021] 標(biāo)記物與抗體或其片段的結(jié)合可W通過本領(lǐng)域普遍知道的方法來實(shí)施。例如，可 W如下巧光標(biāo)記蛋白質(zhì)或膚：用憐酸鹽緩沖液清洗蛋白質(zhì)或膚，添加用DMS0、緩沖劑、等準(zhǔn) 備的染料，然后混合溶液，再于室溫放置10分鐘。另外，標(biāo)記可使用商品化的標(biāo)記試劑盒，諸 如生物素標(biāo)記試劑盒，如生物素標(biāo)記試劑盒-NH2、生物素標(biāo)記試劑盒-SH (DojindoLaboratories);堿性憐酸酶標(biāo)記試劑盒諸如堿性憐酸酶標(biāo)記試劑盒-N肥、堿性憐 酸酶標(biāo)記試劑盒-SH(Dojindo Laboratories);過氧化物酶標(biāo)記試劑盒諸如過氧化物酶標(biāo) 記試劑盒-NH2、過氧化物酶標(biāo)記試劑盒-NH2(Dojindo Laboratories);藻膽蛋白標(biāo)記試劑 盒諸如藻膽蛋白標(biāo)記試劑盒-NH2、藻膽蛋白標(biāo)記試劑盒-SH、B-藻紅蛋白標(biāo)記試劑盒-NH2， B-藻紅蛋白標(biāo)記試劑盒-SH、R-藻紅蛋白標(biāo)記試劑盒-NH2、R-藻紅蛋白標(biāo)記試劑盒SH (DojindoLaboratories);巧光標(biāo)記試劑盒諸如巧光素標(biāo)記試劑盒-NH2、HiLyte FluoHTM) 555標(biāo)記試劑盒-N肥、HiLyte Fluo;r(TM)647標(biāo)記試劑盒-NH2(Dojindo Laboratories);及 DyLi曲t 547和DyLi曲t647(Techno 化emical Corp.)、Zenon(TM)、Alexa Fluo;r(TM)抗體 標(biāo)記試劑盒、Qdot(TM)抗體標(biāo)記試劑盒（Invitrogen Coloration)和EZ-標(biāo)記物蛋白質(zhì)標(biāo) 記試劑盒(化nakoshi Co巧oration)。為了正確標(biāo)記，可W使用適宜的儀器來檢測經(jīng)過標(biāo)記 的抗體或其片段。
[0022] 作為依照本發(fā)明的檢測產(chǎn)品的樣品，可W使用例如自活檢受試者獲得的組織樣品 或流體。樣品不受特別限制，只要它適于本發(fā)明的測定;例如，它可W包括組織、血液、血漿、 血清、淋己液、尿液、漿膜腔液、脊髓液、滑液、房水、淚液、唾液、或其級分或經(jīng)過處理的材 料。
[0023] 在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述樣品來自受試者的組織。
[0024] 在本發(fā)明中，"預(yù)后"是指腫瘤患者在通過手術(shù)處理等抑制或緩解腫瘤生長后的過 程或結(jié)果。在本說明書中，預(yù)后可W是通過手術(shù)處理抑制或緩解腫瘤生長后1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、15、20年或更久時的生機(jī)狀態(tài)。預(yù)后可W通過檢查生物標(biāo)志物即RPL8蛋白或編碼 RPL8蛋白的基因來預(yù)測。預(yù)后預(yù)測可W運(yùn)樣進(jìn)行:根據(jù)生物標(biāo)志物的有或無，或者升高或降 低，確定患者的預(yù)后是良好還是不良，或者確定良好預(yù)后或不良預(yù)后的概率。
[0025] 在本發(fā)明中，"預(yù)后良好"是指在通過手術(shù)處理等為患者抑制或緩解腫瘤生長之 后，患者長時期(例如3、5、6、7、8、9、10、15、20年或更長)沒有危急狀況?；蛘撸A(yù)后好可^意 指在運(yùn)樣長時間內(nèi)存活、無轉(zhuǎn)移、無復(fù)發(fā)、或無再發(fā)。例如，預(yù)后良好可W意指至少3年或尤 其是至少5年存活，優(yōu)選沒有轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)。預(yù)后良好最優(yōu)選的狀態(tài)是長期無疾病的存活。如 本文中所使用的，"預(yù)后良好"還可W包括任何運(yùn)樣的狀態(tài)，其中可W發(fā)現(xiàn)疾病如轉(zhuǎn)移，但是 惡性低且不嚴(yán)重地影響生存能力。
[0026] 在本發(fā)明中，"預(yù)后不良"是指患者在通過手術(shù)處理等抑制或緩解腫瘤生長后的短 時期（例如1、2、3、4、5年或更短）內(nèi)發(fā)生致命狀況?；蛘撸A(yù)后差是指在運(yùn)樣的短時期里死 亡、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、或再發(fā)。例如，預(yù)后差可W意指至少3年或尤其至少5年內(nèi)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、或死 亡。
[0027] 預(yù)測預(yù)后是指預(yù)測患者狀況的過程或結(jié)果，并不意味著能W100%的準(zhǔn)確度預(yù)測 患者狀況的過程或結(jié)果。預(yù)測預(yù)后是指確定某些過程或結(jié)果的可能性是否增加，而并不意 味著通過與某些過程或結(jié)果不發(fā)生的情況比較來確定發(fā)生某些過程或結(jié)果的可能性。如本 發(fā)明而言，本發(fā)明中RPL8基因或RPL8蛋白的水平升高的患者中，與不顯示該特征的患者相 比，更有可能觀察到特定過程或結(jié)果。
[0028] 進(jìn)一步，所述檢測RPL8基因或RPL8蛋白的產(chǎn)品可W是檢測RPL8基因或RPL8蛋白的 試劑、也可W是包含所述試劑的試劑盒、忍片、試紙等，也可W是使用所述試劑的高通量測 序平臺。
[0029] 本發(fā)明還提供了一種診斷多發(fā)性骨髓瘤的工具，所述工具能夠檢測RPL8基因或 RPL8蛋白的表達(dá)水平。所述工具包括能夠結(jié)合RPL8基因的核酸或者能夠結(jié)合RPL8蛋白的物 質(zhì)（例如抗體）。所述核酸能夠檢測RPL8基因的表達(dá)水平;所述物質(zhì)能夠檢測RPL8蛋白的表 達(dá)水平。
[0030] 進(jìn)一步，所述核酸和所述物質(zhì)的性質(zhì)同前面所述。
[0031] 進(jìn)一步，所述診斷多發(fā)性骨髓瘤的工具包括但不限于忍片、試劑盒、試紙、或高通 量測序平臺；高通量測序平臺是一種特殊的診斷多發(fā)性骨髓瘤的工具，隨著高通量測序技 術(shù)的發(fā)展，對一個人的基因表達(dá)譜的構(gòu)建將成為十分便捷的工作。通過對比疾病患者和正 常人群的基因表達(dá)譜，容易分析出哪個基因的異常與疾病相關(guān)。因此，在高通量測序中獲知 RPL8基因的異常與多發(fā)性骨髓瘤相關(guān)也屬于RPL8基因的用途，同樣在本發(fā)明的保護(hù)范圍之 內(nèi)。
[0032] 本發(fā)明還提供了一種預(yù)測多發(fā)性骨髓瘤預(yù)后的工具，所述預(yù)測多發(fā)性骨髓瘤預(yù)后 工具包括能夠結(jié)合RPL8基因的核酸或者能夠結(jié)合RPL8蛋白的物質(zhì)(例如抗體）。所述核酸能 夠檢測RPL8基因的mRNA水平;所述物質(zhì)能夠檢測RPL8蛋白的表達(dá)水平。
[0033] 進(jìn)一步，所述核酸和所述物質(zhì)的性質(zhì)同前面所述。
[0034] 進(jìn)一步，所述預(yù)測多發(fā)性骨髓瘤預(yù)后的工具包括但不限于忍片、試劑盒、試紙、或 高通量測序平臺；高通量測序平臺是一種特殊的診斷多發(fā)性骨髓瘤的工具，隨著高通量測 序技術(shù)的發(fā)展，對一個人的基因表達(dá)譜的構(gòu)建將成為十分便捷的工作。通過對比疾病患者 和正常人群的基因表達(dá)譜，容易分析出哪個基因的異常與疾病相關(guān)。因此，在高通量測序中 獲知RPL8基因的異常與多發(fā)性骨髓瘤相關(guān)也屬于RPL8基因的用途，同樣在本發(fā)明的保護(hù)范 圍之內(nèi)。
[0035] 本發(fā)明的檢測產(chǎn)品、診斷工具中使用的抗RPL8抗體或其片段所識別的氨基酸的數(shù) 目沒有特別限制，只要抗體能夠結(jié)合RPL8即可。當(dāng)抗體作為治療藥物時，優(yōu)選的是它能夠識 別盡可能多的氨基酸，只要它能抑制RPL8功能?？贵w或其片段識別的氨基酸的數(shù)目是至少 一個，更優(yōu)選至少Ξ個?？贵w的免疫球蛋白類別不受限制，可W是IgG、IgM、IgA、IgE、I曲或 I巧。
[0036] 本發(fā)明還提供了一種診斷多發(fā)性骨髓瘤或預(yù)測多發(fā)性骨髓瘤預(yù)后的方法，所述方 法包括如下步驟：
[0037] (1)獲取受試者的樣品；
[0038] (2)檢測受試者樣品中RPL8基因或蛋白的表達(dá)水平；
[0039] (3)將測得的RPL8基因或蛋白的表達(dá)水平與受試者的患病與否關(guān)聯(lián)起來。
[0040] (4)與對照相比，RPL8基因或蛋白的表達(dá)水平升高，則該受試者被診斷為多發(fā)性骨 髓瘤，或該受試者被確定為預(yù)后不良。
[0041] 本發(fā)明還提供了一種多發(fā)性骨髓瘤的治療方法，所述方法包括抑制RPL8基因或 RPL8蛋白。
[0042] 進(jìn)一步，所述方法包括抑制RPL8基因的表達(dá)，或抑制RPL8蛋白的表達(dá)或抑制RPL8 蛋白的活性。
[0043] 本發(fā)明還提供了一種腫瘤藥物的篩選方法，可W通過在對腫瘤細(xì)胞添加測試藥物 后或在對腫瘤模型動物施用測試藥物后的某個時期測量RPL8基因或者RPL8蛋白的表達(dá)水 平來測定腫瘤藥物改善腫瘤預(yù)后的效果。更具體地說，當(dāng)RPL8基因或者RPL8蛋白的表達(dá)水 平在添加或施用測試藥物后降低時或者恢復(fù)正常水平時，可選擇該藥物作為改善腫瘤預(yù)后 的治療藥物。
[0044] 本發(fā)明還提供了一種含有RPL8基因或RPL8蛋白的抑制劑的藥物。
[0045] 本發(fā)明還提供了上述抑制劑在制備治療多發(fā)性骨髓瘤的藥物中的應(yīng)用。
[0046] 本發(fā)明的RPL8基因或RPL8蛋白的抑制劑不受限制，只要是可W抑制RPL8或設(shè)及 RPL8上游或下游途徑的物質(zhì)的表達(dá)或活性，且對于治療腫瘤有效的藥物即可。
[0047] 進(jìn)一步，所述抑制劑包括反義核酸、dsRNA、核酶、適體、RPL8結(jié)合蛋白片段、或抗體 或其片段。
[004引"反義核酸"指含有與編碼RPL8的mRNA互補(bǔ)的序列的核酸。反義核酸可W由DNA、 RNA或二者組成。反義核酸不需要與祀RPL8的mRNAlOO%互補(bǔ)。反義核酸可含有非互補(bǔ)堿基， 只要它能夠在嚴(yán)格條件下特異性雜交即可。當(dāng)將反義核酸引入細(xì)胞時，它結(jié)合祀多核巧酸 并抑制轉(zhuǎn)錄、RNA加工、翻譯或穩(wěn)定性。除反義多核巧酸之外，反義核酸還包括多核巧酸模擬 物，它含有經(jīng)過修飾的主鏈、和y和5/端部分。運(yùn)樣的反義核酸可W根據(jù)RPL8序列信息來恰 當(dāng)設(shè)計并使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法來生成。
[00例 "dsRNA"指含有雙鏈RNA結(jié)構(gòu)，通過RNA干擾(RNAi)來抑制基因表達(dá)的RNA，包括 siRNA(短干擾RNA)和shRNA(短發(fā)夾RNA)dcIsRNA不需要與祀基因序列具有100%的同源性， 只要它可抑制祀基因表達(dá)即可。為了穩(wěn)定化或其它目的，可W將dsRNA的一部分用DNA替代。 優(yōu)選的是，S i RNA是21 -2 3個堿基的雙鏈RNA。S i RNA可W通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法來 制備，例如通過化學(xué)合成或作為天然存在RNA的類似物。shRNA是具有發(fā)夾轉(zhuǎn)角化airpin turn)結(jié)構(gòu)的短鏈RNA。shRNA可W通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法來制備，例如通過化學(xué)合 成或通過將編碼shRNA的DNA引入細(xì)胞并表達(dá)DNA。
[0050] "核酶"指具有催化活性的RNA，它能夠切割、粘貼、插入、和轉(zhuǎn)移RNA。核酶的結(jié)構(gòu)可 W包括鍵頭、發(fā)夾等。
[0051] "適體"指結(jié)合某物質(zhì)諸如蛋白質(zhì)的核酸。適體可W是RNA或DNA。核酸的形式可W 是雙鏈或單鏈。適體的長度無限制，只要它能夠特異性結(jié)合祀分子即可，可W由例如10至 200個核巧酸、優(yōu)選10至100個核巧酸、更優(yōu)選15至80個核巧酸、進(jìn)一步更優(yōu)選15至50個核巧 酸組成。適體可W使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法來選擇。例如，可W采用SELEX(通過指數(shù) 式富集進(jìn)行的配體的系統(tǒng)進(jìn)化）。
[0052] "RPL8結(jié)合蛋白的片段"指結(jié)合RPL8且抑制RPL8實(shí)施原始功能的蛋白質(zhì)的片段。
[0053] 本發(fā)明的藥物可W作為醫(yī)藥單獨(dú)施用或與其它藥物一起施用?？蒞與本發(fā)明的藥 物一起施用的其它藥物不受限制，只要它不損害本發(fā)明的治療性或預(yù)防性藥物的效果即 可，優(yōu)選的是，用于治療或預(yù)防腫瘤的藥物可W包括例如燒化劑，諸如異環(huán)憐酷胺、環(huán)憐酷 胺、達(dá)卡己嗦、替莫挫胺、尼莫司汀、白消安、丙卡己阱、美法侖、和雷莫司汀;抗代謝物，諸如 依諾他濱、卡培他濱、卡莫?dú)?、克拉屈濱、吉西他濱、阿糖胞巧、阿糖胞巧十八烷基憐酸鹽 (cy^rabine ocfos化te)、替加氣、替加氣-尿喀晚、替加氣吉美喀晚奧替拉西鐘、去氧氣尿 巧、徑基脈、氣尿喀晚、氣達(dá)拉濱、培美曲塞、噴司他下、琉嚷嶺、和甲氨蝶嶺;植物生物堿，諸 如伊立替康、依托泊巧、索布佐生、多西他賽、nogitecan、帕利他賽、長春瑞濱、長春地辛、和 長春堿;抗癌抗生素，諸如放線菌素 D、阿柔比星、氨柔比星、伊達(dá)比星、表柔比星、凈司他下 stimalamer、柔紅霉素、多柔比星、化柔比星、博來霉素、培洛霉素、絲裂霉素 C、和米托蔥釀； 基于銷的藥物，諸如奧沙利銷、卡銷、順銷、和奈達(dá)銷;激素藥物，諸如阿那曲挫、依西美坦、 雌莫司汀、烘雌醇、氯地孕酬、戈舍瑞林、他莫昔芬、地塞米松、托瑞米芬、比卡魯胺、氣他胺、 潑尼松龍、憐雌酪、米托坦、甲睪酬、甲徑孕酬、美雄燒、亮丙瑞林、和來曲挫；生物反應(yīng)修飾 劑，諸如干擾素 α、干擾素 β、干擾素丫、白介素、烏苯美司、干BCG、和香茹多糖;和分子祀向藥 物，諸如伊馬替尼（imatinib)、吉非替尼(旨6門1:;[]1化）、吉姆單抗、奧佐米星、他米己羅汀、曲 妥單抗、維A酸、棚替佐米(bo;rtezomib)、和利妥昔單抗等。
[0054] 本發(fā)明的藥物可根據(jù)需要制備成各種劑型。包括但不限于，經(jīng)皮、粘膜、鼻、口頰、 舌下或經(jīng)口使用的片劑、溶液劑、顆粒劑、貼劑、膏劑、膠囊劑、氣霧劑或栓劑。
[0055] 本發(fā)明的藥物的施用途徑不受限制，只要它能發(fā)揮期望的治療效果或預(yù)防效果即 可，包括但不限于靜脈內(nèi)，腹膜內(nèi)，眼內(nèi)，動脈內(nèi)，肺內(nèi)，口服，小泡內(nèi)，肌肉內(nèi)，氣管內(nèi)，皮下 的，通過皮膚，通過胸膜，局部的，吸入，通過粘膜，皮膚，腸胃，關(guān)節(jié)內(nèi)，屯、室內(nèi)，直腸，陰道， 煩骨內(nèi)，尿道內(nèi)，肝內(nèi)，瘤內(nèi)。在某些情況下，可W系統(tǒng)地給藥。在某些情況下是局部地給藥。
[0056] 本發(fā)明的藥物的劑量不受限制，只要獲得期望的治療效果或者預(yù)防效果即可，可 W依據(jù)癥狀、性別、年齡等來恰當(dāng)?shù)拇_定。本發(fā)明的治療藥物或預(yù)防藥物的劑量可W使用例 如對疾病的治療效果或者預(yù)防效果作為指標(biāo)來確定。
[0057] 在本發(fā)明的上下文中，"診斷多發(fā)性骨髓瘤"既包括判斷受試者是否已經(jīng)患有多發(fā) 性骨髓瘤、也包括判斷受試者是否存在患有多發(fā)性骨髓瘤的風(fēng)險。
[0058] 本文所用的"治療"涵蓋患有相關(guān)疾病或病癥的哺乳動物例如人類中治療相關(guān)的 疾病或疾病狀態(tài)，并且包括：
[0059] (1)預(yù)防疾病或疾病狀態(tài)在哺乳動物中發(fā)生，尤其是當(dāng)該哺乳動物易感于所述疾 病狀態(tài)，但尚未被診斷出患有運(yùn)種疾病狀態(tài)時；
[0060] (2)抑制疾病或疾病狀態(tài)，即阻止其發(fā)生;或者
[0061] (3)緩解疾病或疾病狀態(tài)，即使疾病或疾病狀態(tài)消退。
[0062] 術(shù)語"治療"通常設(shè)及治療人類或動物(例如，被獸醫(yī)所應(yīng)用），其中可達(dá)到某些預(yù) 期的治療效果，例如，抑制病癥的發(fā)展(包括降低發(fā)展速度、使發(fā)展停止）、改善病癥和治愈 病癥。還包括作為預(yù)防措施(例如預(yù)防）的治療。對還沒有發(fā)展為病癥但有發(fā)展為該病癥危 險的患者的用途，也包括在術(shù)語"治療"中。
[0063] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果：
[0064] 本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)了一種診斷多發(fā)性骨髓瘤的分子標(biāo)志物，使用該分子標(biāo)志物可W在 多發(fā)性骨髓瘤發(fā)生的早期即可作為判斷，提供了患者的生存率。
[0065] 另外，通過預(yù)測患者的預(yù)后，本發(fā)明能夠提供有意義的信息來為患者決定治療方 案策略。
[0066] 本發(fā)明的包括RPL8基因或蛋白的抑制劑的治療藥物可用作新的多發(fā)性骨髓瘤的 治療藥物。
【附圖說明】
[0067] 圖1顯示抑制RPL8基因表達(dá)對多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞增殖的影響；
[0068] 圖2顯示抑制RPL8蛋白功能對多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞增殖的影響；
[0069] 圖3顯示抑制RPL8基因表達(dá)對多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞調(diào)亡的影響；
[0070] 圖4顯示抑制RPL8基因表達(dá)對多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞侵襲的影響；
[0071] 圖5顯示抑制RPL8基因表達(dá)對多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞遷移的影響。
[0072] 具體的實(shí)施方式
[0073] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。W下實(shí)施例僅用于說明本 發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條 件，例如Sambrook等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(New York:Cold Spring化rborLaboratoiy Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0074] 實(shí)施例1基因忍片篩選差異表達(dá)基因 [007引 1、取材：
[0076] 多發(fā)性骨髓瘤組織:收集確診的MM患者骨髓活檢標(biāo)本共10例，MM診斷標(biāo)準(zhǔn)參閱《中 國多發(fā)性骨髓瘤診治指南2011修訂版》?；颊咧心?例，女5例，中位年齡59歲。
[0077] 正常骨髓組織:收集同時期營養(yǎng)不良性貧血患者骨髓活檢組織標(biāo)本10例作為對照 組，其中男5例，女5例，中位年齡53歲。
[007引 2、組織RNA的獲取
[00巧]使用Tr i ZO1-步法提取組織總RNA。
[0080] 3、RNA純度及濃度的測定
[0081 ] 取RNA溶液化1，儀器測定0D260、0D280，RNA濃度為0D260值X稀釋倍數(shù)X 40/1000， 計算0D260/0D280，比值在1.7-2.0代表RNA溶液純度高，含蛋白質(zhì)等雜質(zhì)少，-20°C保存。
[0082] 4、RNA完整性檢測
[0083] (1)取化1 RNA樣品行1.5%瓊脂糖凝膠電泳(80v，15min);
[0084] (2)分出區(qū)帶后，genefinder染色，藍(lán)光下觀察電泳區(qū)帶；
[00化](3)當(dāng)28s/18s約2:1時，說明RNA穩(wěn)定無降解。
[00化]5、基因忍片雜交及掃描
[0087] 總RNA經(jīng)線性化擴(kuò)增后，cy3-UTP標(biāo)記，巧光標(biāo)記后的cRNAs采用歴EASY Mini Kit 純化，用Amhion的RNA化agmen化tion Reagents對標(biāo)記好的cRNAs進(jìn)行片段化處理。采用美 國Agilent公司的人全基因表達(dá)譜忍片(4χ44Κ基因），在忍片雜交爐中65°C雜交17h，然后洗 脫、染色，最后用Agilent DNA MicroarrayScanner掃描儀掃描。
[0088] 6、忍片數(shù)據(jù)處理與分析
[0089] 雜交后的忍片經(jīng)忍片掃描儀讀取數(shù)據(jù)點(diǎn)后，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入分析軟件，對于兩組比值 的自然對數(shù)絕對值大于2.0或小于0.5的基因作為差異表達(dá)基因。
[0090] 7、統(tǒng)計學(xué)處理
[0091] 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間差異比較采用單因素方差分析法，P< 0.05差異有顯著性意義。
[OOW] 8、結(jié)果
[0093] 忍片結(jié)果顯示，多發(fā)性骨髓瘤組織與正常骨髓組織之間共篩選出489個差異表達(dá) 基因，其中表達(dá)水平上調(diào)的基因215個，表達(dá)水平下調(diào)的基因274個。
[0094] 實(shí)施例2大樣本驗(yàn)證篩選出的差異表達(dá)基因
[0095] 考慮現(xiàn)有技術(shù)中還未見關(guān)于該基因與多發(fā)性骨髓瘤相關(guān)性進(jìn)行研究的基因作為 候選基因，同時考慮基因測序的結(jié)果，選擇RPL8基因（其表達(dá)在多發(fā)性骨髓瘤組織中上調(diào)） 進(jìn)行驗(yàn)證。
[0096] 1、樣本收集
[0097] 按照實(shí)施例1的方法收集多發(fā)性骨髓瘤組織50例，正常骨髓組織60例。
[0098] 2、在mRNA水平上進(jìn)行驗(yàn)證
[0099] 2.1提取組織RNA
[0100] 步驟同實(shí)施例1。
[0101] 2.2逆轉(zhuǎn)錄
[0102] 逆轉(zhuǎn)錄體系共20化，包括細(xì)胞總RNA化g/化L，50U/化化asin 1化，5X逆轉(zhuǎn)錄反 應(yīng)緩沖液化1，101111(1饑'?化1，504旨/1^隨機(jī)引物化1^9'〇111日旨日），2001]/41]\1-]\11^￥逆轉(zhuǎn)錄酶 化L，DEPC 祉L。
[0103] 37 °C反應(yīng)60分鐘，95 °C 5分鐘終止反應(yīng)。cDNA在-80 °C保存或進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
[0104] 2.3PCR
[010日]反應(yīng)體系按照Real Master Mix(SYBR Green)試劑盒（購自天根生化科技（北京） 有限公司）配置，SYBR反應(yīng)體系共25化，2.5 XReal Master Mix lOyL，20 XSYBR solution 1.2化L，上游引物0.化L，下游引物0.化L，去離子水10.7扣L，cDNA化L。反應(yīng)條件為94°C 5min，94°C 45s，60 °C Imin，30 個循環(huán)，設(shè)空白對照。
[0106] PCR反應(yīng)前10個循環(huán)的巧光信號作為巧光本底信號，調(diào)芐基線至適宜處，各巧光曲 線與基線交叉點(diǎn)的循環(huán)數(shù)即為Ct值。根據(jù)AC(t) = C(t)a腿H-C(t)e-actin，Δ AC(t) = 2 計算目的基因與β-actin相對表達(dá)量。
[0107] PCR引物序列如下：
[010引 RPL8基因引物序列如下所不：
[0109] 上游引物：5'-TTATCTCCTCAGCCAACAG-3'（沈Q ID N0.1);
[0110] 下游引物：5'-AGCCTTCAAGATGGGTTT-3'（SEQ ID N0.2)。
[0111] β-actin基因引物序列如下所示：
[0112] 上游引物：5'-CTGGCACCACACCTTCTACAAT-3'（SEQ ID N0.3);
[0113] 下游引物：5'-AATGTCACGCACGATTTCCCGC-3'（SEQ ID N0.4)
[0114] 2.4 結(jié)果
[0115] 結(jié)果顯示，與正常骨髓組織相比，多發(fā)性骨髓瘤組織中RPL8基因的mRNA水平明顯 上調(diào)，相對表達(dá)量為7.83 ±0.81，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
[0116] 3、在蛋白水平上進(jìn)行驗(yàn)證
[0117] 3.1提取組織總蛋白
[0118] 按照化i如化組織/細(xì)胞總蛋白提取試劑盒的說明書進(jìn)行蛋白提取的操作。
[0119] 3.2Western blot檢測
[0120] 將提取的蛋白定量進(jìn)行SDS-PAGE電泳，之后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗解育、二抗解育、 顯色。
[0121] 3.3統(tǒng)計學(xué)處理
[0122] 將蛋白條帶的灰度值使用Image J軟件進(jìn)行分析，Wi3-actin為內(nèi)參，將RPL8蛋白 條帶的灰度值進(jìn)行歸一化處理。結(jié)果數(shù)據(jù)都是W平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來表示，采用 SPSS13.ο統(tǒng)計軟件來進(jìn)行統(tǒng)計分析的，兩者之間的差異采用t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)P<0.05時具有統(tǒng) 計學(xué)意義。
[0123] 3.4 結(jié)果
[0124] 結(jié)果顯示，與正常骨髓組織相比，多發(fā)性骨髓瘤組織中RPL8蛋白水平顯著增加，相 對表達(dá)量為3.15±0.52，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
[0125] 實(shí)施例3抑制RPL8基因表達(dá)
[0126] UsiRNA設(shè)計合成
[0127] 針對 RPL8 的 siRNA 序列：
[012引 siRNA-RPL8:
[0129] 正義鏈為5'-AACACAAACUUUAUUGAGGCC-3'（沈Q ID N0.5)
[0130] 反義鏈為5'-CCUCAAUAAAGUUUGUGUUUA-3'（沈Q ID N0.6);
[0131] W上S i RNA序列與陰性對照S i RNA序列（S i RNA-NC)均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公 司提供。
[0132] 2、多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染
[0133] 2.1細(xì)胞培養(yǎng)
[0134] RPMI8226細(xì)胞采用含有15%胎牛血清(FBS)、青霉素 lOOU/ml、鏈霉素100μg/ml的 RPMI 1640培養(yǎng)基置于37°C，5%C02,飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)。
[0135] 2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染
[0136] (1)轉(zhuǎn)染前24小時，在50化1無抗培養(yǎng)基中接種0.5-2*105個細(xì)胞，轉(zhuǎn)染時細(xì)胞融合 度為30-50%。鋪板時要將細(xì)胞消化完全混勻，避免細(xì)胞堆積生長。
[0137] (2)用50μ1化ti-MEM稀釋siRNA(轉(zhuǎn)染細(xì)胞的終濃度為33nM，輕輕吹吸3-5次混勻。
[0138] (3)輕輕顛倒混勻轉(zhuǎn)染試劑，用50μ1 Opti-MEM稀釋化1 Lipofectamine2000輕輕 吹吸3-5次混勻，室溫下靜置5min。
[0139] (4)混合轉(zhuǎn)染試劑和SiRNA稀釋液，輕輕吹吸3-5次混勻，室溫下靜置20min。
[0140] (5)轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到24孔細(xì)胞板中，100μΙ/孔，前后輕搖細(xì)胞板混合均勻。
[0141 ] (6)細(xì)胞板置于37 °C，5 %C〇2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-48小時。轉(zhuǎn)染4-6小時后可換鮮培養(yǎng) 基。
[0142] 3、利用QPCR實(shí)驗(yàn)檢測S iRNA的干擾效率
[0143] 3.1提取細(xì)胞總RNA利用常規(guī)方法進(jìn)行操作。
[0144] 3.2逆轉(zhuǎn)錄
[0145] 步驟同實(shí)施例2。
[0146] 3.3QPCR
[0147] 步驟同實(shí)施例2。
[014引 3.4結(jié)果
[0149] 結(jié)果顯示，與siRNA-NC組相比，siRNA-RPL8能夠有效的抑制RPL8基因的表達(dá)，相對 表達(dá)量為0.29 ± 0.06，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
[0150] 實(shí)施例4 RPL8基因的表達(dá)對多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞增殖能力的測定
[0151] 1、步驟：
[0152] 將轉(zhuǎn)染4她的RPMI8226細(xì)胞按照巧103細(xì)胞/孔接種于96孔板，
[0153] 根據(jù)&rd U細(xì)胞增殖試劑盒(化emicon International)的說明書，測量細(xì)胞增殖 速率。
[0154] 2、結(jié)果
[01巧]結(jié)果如圖1所示，與轉(zhuǎn)染siRNA-NC組相比，轉(zhuǎn)染siRNA-RPL8組細(xì)胞增殖緩慢，差異 具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<〇.05)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，R化8基因表達(dá)促進(jìn)了多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的 增殖。
[0156]實(shí)施例5多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞抗體中和實(shí)驗(yàn) [0157] 1、步驟：
[0158] 將多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞RPMI8226接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔巧103個細(xì)胞/孔/ 20化1，細(xì)胞貼壁后進(jìn)行如下處理：
[0159] 實(shí)驗(yàn)組1(對照組）：多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中加入無關(guān)單抗(1:50);
[0160] 實(shí)驗(yàn)組2:多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中加入抗人RPL8單抗(1:50)。
[0161] 將細(xì)胞在37°C、5%C02培養(yǎng)箱解育24小時后，根據(jù)Brd U細(xì)胞增殖試劑盒 (Qiemicon International)的說明書，測量細(xì)胞增殖速率。
[0162] 2、統(tǒng)計學(xué)方法
[0163] 實(shí)驗(yàn)都是按照重復(fù)3次來完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是W平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來表示， 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件來進(jìn)行統(tǒng)計分析的，兩者之間的差異采用t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)P<0.05時具 有統(tǒng)計學(xué)意義。
[0164] 3、結(jié)果
[0165] 結(jié)果如圖2所示，相比于對照組，加入抗人RPL8單抗的組細(xì)胞增殖減緩。上述實(shí)驗(yàn) 結(jié)果表明，抑制RPL8蛋白的功能可W抑制多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞增殖。
[0166] 實(shí)施例6測定RPL8基因表達(dá)對細(xì)胞調(diào)亡的影響
[0167] 1、TUNEL法檢測細(xì)胞調(diào)亡
[0168] (1)根據(jù)實(shí)施例3的步驟進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染；
[0169] (2)根據(jù)原位細(xì)胞調(diào)亡檢測試劑盒(化emicon International)說明書，利用共聚 焦顯微鏡定量調(diào)亡細(xì)胞；
[0170] (3)對TUNEL陽性細(xì)胞計數(shù)。
[0171] 2、統(tǒng)計學(xué)方法：
[0172] 實(shí)驗(yàn)都是按照重復(fù)3次來完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是W平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來表示， 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件來進(jìn)行統(tǒng)計分析的，兩者之間的差異采用t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)P<0.05時具 有統(tǒng)計學(xué)意義。
[0173] 3、結(jié)果：
[0174] 結(jié)果如圖3所示，相比S iRNA-NC細(xì)胞組，轉(zhuǎn)染siRNA-RPL8組細(xì)胞調(diào)亡明顯加劇，差 異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<〇.05)，上述結(jié)果表明RPL8基因表達(dá)抑制了細(xì)胞調(diào)亡。
[0175] 實(shí)施例7檢測RPL8基因表達(dá)對細(xì)胞遷移、侵襲的影響
[0176] 1、侵襲實(shí)驗(yàn)
[0177] 1.1實(shí)驗(yàn)步驟：
[0178] (1)上室用Matrigel(人工基底膜)預(yù)涂；
[0179] (2)在上室中種入轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，接種濃度為5*10^10化1細(xì)胞，在無血清培養(yǎng)基 中培養(yǎng)1她；
[0180] (3)將細(xì)胞加入到0.1%的FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)1她；
[0181] (4)在冰上吸取 50μ1 Matrigel;
[0182] (5)加入預(yù)冷的15化1無血清RPMI-1640培養(yǎng)基中充分混勻；
[0183] (6)分別取（5)中混合的Matrigel 50μ1，加入到transwell上室，覆蓋整個膜；
[0184] (7)37°C至過夜，使Matrigel聚合成膠；
[01化](8)細(xì)胞用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基洗2遍，再加入無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中， 至總體積1〇化1;
[0186] (9)將(8)均勻加入化answell上室中，下層培養(yǎng)液和小室間，避免氣泡；
[0187] (10)向下室加入500-600μ1 含 5%FBS 的 RPMI-1640培養(yǎng)，37°C，5%C02;
[0188] (11)4化后吸盡液體，擦去未穿透的細(xì)胞，遷移到膜的下表面的細(xì)胞用100%甲醇 固定30min，PBS洗2遍；
[0189] (12) 0.2 %結(jié)晶紫染色上室30min，PBS洗去多余結(jié)晶紫；
[0190] (13)倒置顯微鏡下計數(shù)。
[0191] 1.蛹果：
[0192] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4顯示，與轉(zhuǎn)染siRNA-NC組相比，轉(zhuǎn)染siRNA-R化8組細(xì)胞侵襲數(shù)明顯 減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<〇. 05)。
[0193] 2、遷移實(shí)驗(yàn)
[0194] 2.1實(shí)驗(yàn)步驟
[01M] (1)上室中不需要預(yù)涂Matrigel人工基底膜。在上室中種入轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，接種濃 度為(1*1〇5)/1〇化1個細(xì)胞，在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)18h;
[0196] (2)將細(xì)胞加入到0.1%的FBS的無血清RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)1她；
[0197] (3)在冰上用預(yù)冷的槍頭吸取50μ1 Matrigel;
[0198] (4)加入預(yù)冷的15化1無血清RPMI-1640培養(yǎng)基中充分混勻；
[0199] (5)分別取(4)中混合的Matrigel 50μ1加入到Transwell上室，覆蓋整個膜；
[0200] (6)37°C至過夜，使Matrigel聚合成膠；
[0201] (7)細(xì)胞用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基洗2次，再加入無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中， 至總體積1〇化1;
[0202] (8)將(7)均勻加入化answell上室中，下層培養(yǎng)液和小室間，避免氣泡，向下室加 入500-600μ1 含 10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)，37°C，5%C〇2;
[0203] (9)4化后吸盡液體，擦去未穿透的細(xì)胞，遷移到膜的下表面的細(xì)胞用100%甲醇固 定 30min，PBS洗2遍；
[0204] (10)0.2 %結(jié)晶紫染色上室30min，PBS洗去多余結(jié)晶紫；
[0205] (11)倒置顯微鏡下計數(shù)。
[0206] 2.2 結(jié)果
[0207] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5顯示，與轉(zhuǎn)染siRNA-NC組相比，轉(zhuǎn)染siRNA-R化8細(xì)胞組細(xì)胞遷移數(shù) 明顯減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<〇. 05)。
[0208] 上述結(jié)果表明，RPL8基因表達(dá)有利于骨髓瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。
[0209] 上述實(shí)施例的說明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核屯、思想。應(yīng)當(dāng)指出，對于本 領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可w對本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn) 和修飾，運(yùn)些改進(jìn)和修飾也將落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 檢測RPL8基因或RPL8蛋白的產(chǎn)品在制備診斷多發(fā)性骨髓瘤或預(yù)測多發(fā)性骨髓瘤預(yù) 后的工具中的應(yīng)用。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述檢測RPL8基因或RPL8蛋白的產(chǎn)品包括 檢測RPL8基因或RPL8蛋白的表達(dá)水平的產(chǎn)品。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述產(chǎn)品包括能夠結(jié)合RPL8基因的核 酸或者能夠結(jié)合RPL8蛋白的物質(zhì);所述核酸能夠檢測RPL8基因的表達(dá)水平;所述物質(zhì)能夠 檢測RPL8蛋白的表達(dá)水平。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述核酸是實(shí)時定量PCR中使用的特異擴(kuò) 增RPL8基因的引物如SEQIDN0.1和SEQIDN0.2所示。5. -種診斷多發(fā)性骨髓瘤或預(yù)測多發(fā)性骨髓瘤預(yù)后的工具，其特征在于，所述工具包 括能夠檢測RPL8基因或RPL8蛋白的表達(dá)水平的工具。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的工具，其特征在于，所述工具包括能夠結(jié)合RPL8基因的核酸或 者能夠結(jié)合RPL8蛋白的物質(zhì);所述核酸能夠檢測RPL8基因的表達(dá)水平;所述物質(zhì)能夠檢測 RPL8蛋白的表達(dá)水平。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的工具，其特征在于，所述核酸是實(shí)時定量PCR中使用的特異擴(kuò) 增RPL8基因的引物如SEQIDN0.1和SEQIDN0.2所示。8. -種治療多發(fā)性骨髓瘤的藥物，其特征在于，所述藥物包含RPL8基因或RPL8蛋白的 抑制劑。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的藥物，其特征在于，所述抑制劑能夠抑制RPL8或涉及RPL8上游 或下游途徑的物質(zhì)的表達(dá)或活性。10. 權(quán)利要求8或9所述的抑制劑在制備治療多發(fā)性骨髓瘤的藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】G01N33/68GK106011290SQ201610602019
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年7月27日
【發(fā)明人】楊承剛, 宋宏濤
【申請人】北京泱深生物信息技術(shù)有限公司