本發(fā)明涉及一種檢測(cè)雪松疫霉根腐病菌(Phytophthora lateralis Tucker et Mibrath)的LAMP引物，以及利用所述引物檢測(cè)雪松疫霉根腐病菌的分子檢測(cè)方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

雪松疫霉根腐病菌是一用于種重要的毀滅性植物病原菌，可侵染美國(guó)扁柏Chamaecyparis lawsoniana(A.Murray bis)Parlatore引起嚴(yán)重的根腐病。病害最早于1923年在美國(guó)西雅圖、華盛頓附近的觀賞植物上有報(bào)道發(fā)生，直到1942年，病菌在美國(guó)俄勒岡州的威拉梅特谷被發(fā)現(xiàn)并命名，病菌造成俄勒岡州西北部和華盛頓西部觀賞植物的嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，使極具價(jià)值的園藝栽培種幾乎全部毀滅，隨后病菌傳入加拿大、法國(guó)，對(duì)當(dāng)?shù)赜^賞植物及林業(yè)貿(mào)易造成嚴(yán)重影響^[1]。由于該病害為害重、傳播快，而防治根除又極為困難，該病原菌已引起歐盟等許多國(guó)家的高度重視，紛紛采取措施嚴(yán)防其傳入。近年來(lái)，由于國(guó)際間苗木及其植物包裝材料的調(diào)運(yùn)日趨頻繁，該病原菌極可能傳入我國(guó)，一旦傳入，將對(duì)我國(guó)農(nóng)林業(yè)、生態(tài)環(huán)境等造成重大威脅。由于我國(guó)未有雪松疫霉根腐病菌發(fā)生的報(bào)道，國(guó)家質(zhì)檢總局于2007年將該病菌列入新修訂的《進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄》中。為了防止該病原菌傳入我國(guó)，需要對(duì)其進(jìn)行快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)，因此針對(duì)雪松疫霉根腐病菌的檢測(cè)我們進(jìn)行了一系列的研究。

雪松疫霉根腐病菌(Phytophthora lateralis Tucker&Milbrath)又名側(cè)生疫霉，隸屬藻菌界(Chromista)，卵菌門(mén)(Oomycota)，霜霉目(Peronosporales)，腐霉科(Pythiaceae)，疫霉屬(Phytophthora)，是一類重要的植物病原菌，其地理分布和寄主范圍均很廣泛。病菌在V8培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度較慢(2mm/d～4mm/d)，菌落平貼至中度的蓬松。最低生長(zhǎng)溫度為3℃，最適生長(zhǎng)溫度20℃，最高生長(zhǎng)溫度26℃。菌絲無(wú)隔、分枝多而短，無(wú)色，常見(jiàn)的是光滑的，偶爾也有粗糙的，長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)后會(huì)在培養(yǎng)基上形成一層薄膜?？僧a(chǎn)生菌絲膨大體，最終形成厚垣孢子，厚垣孢子棕褐色，直徑22μm～77μm，平均40μm，無(wú)柄，單個(gè)生于孢子梗頂端。病菌孢子囊無(wú)乳突，叢生于孢囊梗上，卵圓形、倒卵形、倒梨形，20μm～60μm×12μm～20μm(平均26μm×15μm)，長(zhǎng)寬比1.67～5:1，平均1.73:1，游動(dòng)孢子有側(cè)生雙鞭毛，直徑為10μm～12μm。病菌為同宗配合，雄器側(cè)生，藏卵器球形、光滑，卵孢子滿器、壁厚約6μm，直徑28μm～46μm，平均40μm^[1]。

傳統(tǒng)病原菌的分類、鑒定主要基于形態(tài)學(xué)特性、致病性測(cè)定等，操作繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)、靈敏度低、易受人為及環(huán)境等諸多因素的干擾^[2]，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，分子生物學(xué)技術(shù)已逐步應(yīng)用到雪松疫霉根腐病菌的研究中?；谄胀≒CR的方法已經(jīng)成功用于檢測(cè)雪松疫霉根腐病菌^[3,4]，雖然普通PCR法在特異性和靈敏度上有較大的提高，但是檢測(cè)時(shí)間仍然比較長(zhǎng)，大概4～5h，同時(shí)普通PCR方法依賴精密的溫度循環(huán)裝置，檢測(cè)過(guò)程復(fù)雜，不能滿足快速檢測(cè)的需求。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-mediated isothermalamplification,LAMP)是日本的榮研株式會(huì)發(fā)明的一種新的核酸擴(kuò)增技術(shù)^[5]，因?yàn)槠洳僮骱?jiǎn)單、快速、特異性高、成本低等優(yōu)點(diǎn)，成為可以替代普通PCR的新的核酸擴(kuò)增技術(shù)。它是針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4種特異的引物，在Bst大片段聚合酶的作用下引起自循環(huán)鏈置換反應(yīng)，60～65℃范圍60～70min內(nèi)，大量合成目標(biāo)DNA的同時(shí)伴隨有副產(chǎn)物——白色的焦磷酸鎂沉淀產(chǎn)生^[6]。由于LAMP擴(kuò)增過(guò)程依賴識(shí)別靶序列6個(gè)獨(dú)立區(qū)域，所以反應(yīng)特異性很強(qiáng)，并且核酸擴(kuò)增過(guò)程是在恒溫條件下進(jìn)行，普通水浴鍋或者有穩(wěn)定熱源的設(shè)備就能滿足反應(yīng)要求，檢測(cè)成本大大降低。

靶標(biāo)基因的選擇是LAMP檢測(cè)的重要因素之一。目前，分子檢測(cè)常用的靶標(biāo)基因有核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internal transcribed space,ITS)，然而許多學(xué)者認(rèn)為該靶標(biāo)沒(méi)有足夠的變異位點(diǎn)區(qū)分所有的疫霉種^[7]。本發(fā)明選用的新型靶標(biāo)三磷酸鳥(niǎo)苷(GTP)結(jié)合蛋白基因(Ypt1)是一個(gè)與原癌基因Ras(Rat sarcoma)相關(guān)的基因，在酵母中，該基因編碼一個(gè)與Ras相關(guān)的GTP結(jié)合蛋白。Ypt1基因包含有多個(gè)內(nèi)含子，非編碼區(qū)具有足夠多的特異性位點(diǎn)，并且其序列在種內(nèi)高度保守，非常適合作為疫霉菌的分子檢測(cè)靶標(biāo)^[8]。

參考文文獻(xiàn)如下：

1.Erwin,D.C.；Ribeiro,O.K.Phytophthora lateralis.In:Phytophthora diseases worldwide.American Phytopathological Society,St.Paul(US),1996,pp 365-367.

2.Daniells J,Davis D,Peterson R,et al..Goldfinger:not as resistant to sigatoka/yellow sigatoka as first thought.Infomusa，1995,4(1):6.

3.Winton,L.M.；Hansen,E.M.Molecular diagnosis of Phytophthora lateralis in trees,water,and foliage baits using multiplex polymerase chain reaction.Forest Pathology,2001,31(5):275-283.

4.紀(jì)睿,王健生,廖太林,李百勝,張正光,鄭小波.雪松疫霉(Phytophthora lateralis)的快速分子檢測(cè).植物病理學(xué)報(bào),2014,44(2):113-120.

5.Notomi,T.,Okayama,H.,Masubuchi,H.,Yonekawa,T.,Watanabe,K.,Amino,N.,and Hase,T.Loop-mediated isothermal amplification of DNA.Nucleic Acids Research,2000,28:e63-e63.

6. 6.Yasuyoshi Mori,Kentaro Nagamine,Norihiro Tomita,and Tsugunori Notomi.Detection of Loop-Mediated Isothermal Amplification Reaction by Turbidity Derived from Magnesium Pyrophosphate Formation.Biochemical and Biophysical Research Communications,2001,289:e150-e154.

7.White,T.J.,Bruns,T.,Lee,S.,and Taylor,J.Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics.1990,Pages 315-322in:PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications.M.A.Innis,D.H.Gelfand,J.J.Sninsky,and T.J.White,eds.Academic Press,San Diego,CA.

8.Chen Y,Roxby R.Characterization of a Phytophthora infestans gene involved in vesicle transport.Gene,1996,181(1-2):89-94.

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是解決現(xiàn)有技術(shù)中雪松疫霉根腐病菌的生物學(xué)檢測(cè)方法所需周期長(zhǎng)、費(fèi)時(shí)費(fèi)力、繁瑣、特異性差的問(wèn)題及PCR檢測(cè)技術(shù)需要熱循環(huán)儀器，成本高、無(wú)法快速檢測(cè)雪松疫霉根腐病菌的問(wèn)題，從而提供了雪松疫霉根腐病菌新的分子檢測(cè)方法，對(duì)雪松疫霉根腐病菌進(jìn)行LAMP檢測(cè)，該方法檢測(cè)周期短(僅需80min)、特異性強(qiáng)、靈敏度高、可肉眼觀察檢測(cè)結(jié)果且不需昂貴儀器成本低、操作簡(jiǎn)便易行。

新型靶標(biāo)基因的選取和引物的篩選是LAMP檢測(cè)的關(guān)鍵因素。目前，分子檢測(cè)廣泛應(yīng)用的是基于核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)的靶標(biāo)，但由于ITS序列沒(méi)有足夠的變異位點(diǎn)區(qū)分所有的疫霉種，因此需要發(fā)掘出新的分子檢測(cè)靶標(biāo)。首先，查找相關(guān)文獻(xiàn)選取了tRNA(轉(zhuǎn)運(yùn)RNA)EF1α(翻譯延長(zhǎng)因子)、Ypt1(三磷酸鳥(niǎo)苷結(jié)合蛋白基因)、beta微管蛋白基因等可用性靶標(biāo)，然后依次篩選靶標(biāo)基因，最終選擇Ypt1作為檢測(cè)栗疫霉黑水病菌的靶標(biāo)基因。再對(duì)以該靶標(biāo)基因設(shè)計(jì)的多套引物進(jìn)行試驗(yàn)和驗(yàn)證，篩選出一套檢測(cè)雪松疫霉根腐病菌的LAMP引物。

本發(fā)明提供的技術(shù)方案是：

本發(fā)明選取新型靶標(biāo)基因，設(shè)計(jì)和篩選用于檢測(cè)雪松疫霉根腐病菌的LAMP引物，其包括四條特異性引物F3、B3、FIP、BIP和一條環(huán)引物L(fēng)B，引物序列分別如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.5所示，具體見(jiàn)下表1。

表1雪松疫霉根腐病菌LAMP引物序列

同時(shí)，本發(fā)明還提供一種利用上述引物檢測(cè)雪松疫霉根腐病菌的方法，其過(guò)程是：提取待測(cè)樣品的DNA作為模板，利用所述的引物進(jìn)行LAMP擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)后，在常光下肉眼觀察，以羥基萘酚藍(lán)(hydroxynaphthol blue,HNB)的顏色變化進(jìn)行結(jié)果判定，常光下，天藍(lán)色表示檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，即樣品中檢測(cè)到雪松疫霉根腐病菌，紫色表示檢測(cè)結(jié)果為陰性，即樣品中未檢測(cè)到雪松疫霉根腐病菌。(圖1)

上述檢測(cè)雪松疫霉根腐病菌的方法，其LAMP擴(kuò)增反應(yīng)體系為：2.5μL 10×ThermoPol Buffer(0.1％Trion-X,20mM Tris-HCl,10mM KCl，10mM(NH4)SO4,pH 8.8)，4μL MgSO4(50mM)，4μL甜菜堿(5M)，3.5μL dNTPs(10mM)，內(nèi)引物FIP和BIP(20μM)各2μL，外引物F3和B3(10μM)各0.5μL，環(huán)引物L(fēng)B(10μM)1μL，2μL HNB(2.4mM)，1μL Bst DNA聚合酶(8U·μL-1)，模板DNA 2μL，用滅菌去離子水補(bǔ)足體積至26μL。

上述檢測(cè)雪松疫霉根腐病菌的方法，其LAMP擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?2℃，80min。

有益效果

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下有益效果：

(1)實(shí)用性好。普通PCR反應(yīng)對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳很容易造成產(chǎn)物擴(kuò)散，這是實(shí)驗(yàn)室污染的一個(gè)主要來(lái)源；而且溴化乙錠(EB)有劇毒，可累積致癌；長(zhǎng)期觀察紫外燈也會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)人員造成一定程度的傷害。而LAMP反應(yīng)只需在恒溫水浴鍋中進(jìn)行，反應(yīng)結(jié)束之后通過(guò)HNB的顏色變化便可直接判斷結(jié)果，整個(gè)操作過(guò)程簡(jiǎn)單易行，適用于對(duì)雪松疫霉根腐病菌的口岸檢疫和病害的快速診斷。

(2)恒溫?cái)U(kuò)增。不像PCR法必須要熱循環(huán)，這樣就擺脫了對(duì)熱循環(huán)儀器的依賴，只要有穩(wěn)定的熱源LAMP反應(yīng)就可以發(fā)生，極大的擴(kuò)展了LAMP使用的范圍，LAMP之所以能在恒定的熱源下發(fā)生反應(yīng)是因?yàn)樵贚AMP反應(yīng)液中添加了甜菜堿，使雙鏈DNA處于解鏈的動(dòng)態(tài)平衡中，在Bst DNA聚合酶的作用下實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增。

(3)準(zhǔn)確性高。由于傳統(tǒng)雪松疫霉根腐病菌檢測(cè)技術(shù)只是根據(jù)形態(tài)特征來(lái)進(jìn)行鑒定，耗時(shí)長(zhǎng)、靈敏度低、易受人為及環(huán)境等諸多因素的干擾；而本發(fā)明根據(jù)雪松疫霉根腐病菌的Ypt1序列，該序列在雪松疫霉根腐病菌中的基因組中非常保守，利用Bioedit軟件將雪松疫霉根腐病菌的Ypt1序列和其他疫霉菌的Ypt1序列進(jìn)行比較，設(shè)計(jì)雪松疫霉根腐病菌特異性的LAMP引物。LAMP反應(yīng)通過(guò)4條引物特異性識(shí)別靶序列上的6個(gè)獨(dú)立區(qū)域，相對(duì)于普通PCR引物識(shí)別靶序列的2個(gè)獨(dú)立區(qū)域而言，特異性和靈敏度都比較高。

本發(fā)明的檢測(cè)體系在62℃等溫條件下，能快速、方便、高效、高特異、高靈敏地檢測(cè)到雪松疫霉根腐病菌，且不需要復(fù)雜儀器，為雪松疫霉根腐病菌的檢測(cè)提供了新的技術(shù)平臺(tái)，能較好滿足對(duì)雪松疫霉根腐病菌的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，適用于出入境植物和植物產(chǎn)品的檢驗(yàn)檢疫和病害的調(diào)查、快速診斷及監(jiān)測(cè)等，對(duì)防止雪松疫霉根腐病菌傳入我國(guó)具有重要意義，同時(shí)，本發(fā)明體系的建立也為其他病原菌的檢測(cè)提供了技術(shù)指導(dǎo)和理論依據(jù)。

附圖說(shuō)明

圖1 LAMP反應(yīng)加入HNB顯色反應(yīng)試驗(yàn)，其中，-:陰性反應(yīng)呈現(xiàn)紫色；+:陽(yáng)性反應(yīng)呈現(xiàn)天藍(lán)色。

圖2雪松疫霉根腐病菌Ypt1基因核酸序列及引物位置。

圖3引物的通用性驗(yàn)證；

其中1:P.lateralis(ATCC 44777)；2:P.lateralis(CBS 102608)；3:P.lateralis(CBS 117106)；4:P.lateralis(CBS 168.42)；5:陰性對(duì)照。

圖4引物的種間特異性驗(yàn)證；

其中1:雪松疫霉根腐病菌P.lateralis；2‐4:栗疫霉黑水疫霉P.cambivora；5,6:櫟樹(shù)猝死病菌P.ramorum；7:大豆疫霉P.sojae；8:致病疫霉P.infestans；9:大雄疫霉P.megasperma；10:瓜類疫霉P.melonis；11:辣椒疫霉P.capsici；12:苜蓿疫霉P.medicaginis；13:掘氏疫霉P.drechsleri；14:棕櫚疫霉P.palmivora；15:荔枝霜疫霉Peronophthora litchii；16:惡疫霉P.cactorum；17:苧麻疫霉P.boehmeriae；18:隱地疫霉P.cryptogea；19:煙草疫霉P.nicotianae；20:陰性對(duì)照。

圖5引物的屬間特異性驗(yàn)證；

其中1:雪松疫霉根腐病菌P.lateralis；2:禾谷鐮孢菌Fusarium graminearum；3:尖鐮孢菌F.oxysporum；4:層出鐮孢菌F.proliferatum；5:木賊鐮孢菌F.equiseti；6:茄腐鐮孢菌F.solani；7:燕麥鐮孢菌F.avenaceum；8:黃色鐮孢菌F.culmorum；9:平頭炭疽菌Colletotrichum truncatum；10:膠孢炭疽菌C.gloeosporioides；11:多主棒孢菌Corynespora cassiicola；12:大豆炭腐病菌Macrophomina phaseolina；13:大豆紫斑病菌Cercospora kikuchii；14:立枯絲核菌Rhizoctonia solani；15:冬青麗赤殼菌Calonectria ilicicola；16:玉蜀黍平臍蠕孢菌Bipolaris maydis；17:米曲霉菌Aspergillus oryzae；18:稻瘟病菌Magnaporthe grisea；19:大豆南方莖潰瘍病菌Diaporthe phaseolorum var.meridionalis；20:大豆北方莖潰瘍病菌Diaporthe phaseolorum var.caulivora；21:大豆莖褐腐病菌Phialophora gregata；22:大豆擬莖點(diǎn)種腐病菌Phomopsis longicolla；23:大豆銹菌Phakopsora pachyrhiz；24:陰性對(duì)照。

圖6雪松疫霉根腐病菌LAMP檢測(cè)方法的靈敏度檢測(cè)；

其中1-8:分別以100ng·μL^-1、10ng·μL^-1、1ng·μL^-1、100pg·μL^-1、10pg·μL^-1、1pg·μL^-1、100fg·μL^-1、10fg·μL^-1濃度梯度的雪松疫霉根腐病菌DNA作為反應(yīng)模板；9:陰性對(duì)照。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：選取新型靶標(biāo)基因，設(shè)計(jì)和篩選用于檢測(cè)雪松疫霉根腐病菌的LAMP引物，并建立LAMP檢測(cè)體系

(一)新型靶標(biāo)基因的選取及引物的設(shè)計(jì)和篩選

新型靶標(biāo)基因的選取和引物的篩選是LAMP檢測(cè)的關(guān)鍵因素。目前，分子檢測(cè)廣泛應(yīng)用的是基于核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)的靶標(biāo)，但由于ITS序列沒(méi)有足夠的變異位點(diǎn)區(qū)分所有的疫霉種，因此需要發(fā)掘出新的分子檢測(cè)靶標(biāo)。首先，查找相關(guān)文獻(xiàn)選取了tRNA(轉(zhuǎn)運(yùn)RNA)EF1α(翻譯延長(zhǎng)因子)、Ypt1(三磷酸鳥(niǎo)苷結(jié)合蛋白基因)、beta微管蛋白基因等可用性靶標(biāo)。以靶標(biāo)Ypt1為例，從GeneBank中下載雪松疫霉根腐病菌的Ypt1基因序列和其它疫霉種的Ypt1基因序列，然后應(yīng)用Bioedit軟件對(duì)所有下載的Ypt1基因序列進(jìn)行對(duì)比分析，并使用PrimerExplore V4軟件在線設(shè)計(jì)引物，根據(jù)引物長(zhǎng)度、引物自由能及GC含量等選取合適的引物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，從中篩選種內(nèi)通用性好，種間特異性強(qiáng)，屬間特異性強(qiáng)，靈敏度高的引物。依次篩選其他靶標(biāo)，最終選擇Ypt1作為檢測(cè)雪松疫霉根腐病菌的靶標(biāo)基因(圖2)。再對(duì)以該靶標(biāo)基設(shè)計(jì)的多套引物進(jìn)行多次試驗(yàn)和驗(yàn)證，選出一套通用性好，特異性強(qiáng)，靈敏度高，能快速，準(zhǔn)確檢測(cè)出雪松疫霉根腐病菌的引物，序列如下：

檢測(cè)引物對(duì)((F3、B3、FIP、BIP、LB))

F3(正向外引物)：CCGTACGATCGAGCTGGA(SEQ ID NO.1)；

B3(反向外引物)：ACGTCGTACACCACGATGA(SEQ ID NO.2)；

FIP(正向內(nèi)引物)(F1C+F2)：

ACCCCAAGGAAAGCGGGAAAAA-GCAAGACCATCAAGCTCCA(SEQ ID NO.3)；

BIP(反向內(nèi)引物)(B1C+B2)：

CTCTTGTAGTGGGACACGGCC-GCGGTAGTAGCTGCTTGTG(SEQ ID NO.4)；

LB(環(huán)引物)：GAGCGCTTCCGCACGAT(SEQ ID NO.5)。

(二)建立雪松疫霉根腐病菌LAMP檢測(cè)體系

雪松疫霉根腐病菌LAMP反應(yīng)體系：2.5μL 10×ThermoPol Buffer(0.1％Trion-X,20mM Tris-HCl,10mM KCl，10mM(NH4)SO4,pH 8.8)，4μL MgSO4(50mM)，4μL甜菜堿(5M)，3.5μL dNTPs(10mM)，內(nèi)引物FIP和BIP(20μM)各2μL，外引物F3和B3(10μM)各0.5μL，環(huán)引物L(fēng)B(10μM)1μL，ddH₂O1μL，2μL HNB(2.4mM)，1μL Bst DNA聚合酶(8U·μL^-1)，2μL模板DNA。將上述混合物置于0.2mL的PCR反應(yīng)管內(nèi)并在渦旋器上輕微渦旋，然后離心以確保管壁上沒(méi)有液滴。將反應(yīng)管置于62℃在水浴鍋中等溫反應(yīng)80min。

實(shí)施例2：制備DNA模板

提取樣品的DNA作為L(zhǎng)AMP反應(yīng)的模板，具體過(guò)程如下：

(一)菌株培養(yǎng)及菌絲粉制備

將供試疫霉菌菌株轉(zhuǎn)至LBA(利馬豆培養(yǎng)基(鄭小波.疫霉菌及其研究技術(shù).中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社.1997))平板上，其它菌株轉(zhuǎn)至PDA(馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基(Erwin,D.C.；Ribeiro,O.K.Phytophthora lateralis.In:Phytophthora diseases worldwide.American Phytopathological Society,St.Paul(US),1996,pp 365-367))平板上，25℃黑暗培養(yǎng)3d后從菌落邊緣切取10塊2×2mm菌絲塊，疫霉菌的菌株轉(zhuǎn)至V8液體培養(yǎng)基(鄭小波.疫霉菌及其研究技術(shù).中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社.1997)，其它菌株轉(zhuǎn)至PDB(馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(Erwin,D.C.；Ribeiro,O.K.Phytophthora lateralis.In:Phytophthora diseases worldwide.American Phytopathological Society,St.Paul(US),1996,pp 365-367))中，25℃振蕩培養(yǎng)5～7d，過(guò)濾收集菌絲，經(jīng)冷凍抽干研磨成菌絲粉，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(二)基因組DNA的提取

取少量菌絲粉，加900μL 2％CTAB提取液和90μL 10％SDS，漩渦混勻，于60℃水浴1h，中間每10min上下顛倒幾次。12000rpm·min^-1離心10min，取上清液加入等體積酚/氯仿/異戊醇(25：24：1)，顛倒混勻，12000rpm·min^-1離心10min；將上清液轉(zhuǎn)移至新管中，加入等體積的氯仿，輕輕顛倒混勻，12000rpm·min^-1離心5min。取上清液轉(zhuǎn)移至新管中，加2倍體積的無(wú)水乙醇和1/10體積的3mol·L^-1NaAc(pH 5.2)，-20℃靜置沉淀(>1h)。12000rpm·min^-1離心10min，傾去上清液，沉淀用70％乙醇洗滌2次，室溫晾干。加適量滅菌超純水或TE(pH 8.0)溶解沉淀(含20μg·ml^-1RNase)，37℃處理1h后，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)施例3：檢測(cè)LAMP引物的特異性和靈敏度

(一)特異性檢測(cè)

本發(fā)明所用菌株及相關(guān)信息見(jiàn)表2。采用本發(fā)明所設(shè)計(jì)的引物對(duì)表2中所有供試菌株的基因組DNA進(jìn)行LAMP擴(kuò)增反應(yīng)，HNB的顯色反應(yīng)結(jié)果顯示不同來(lái)源的雪松疫霉根腐病菌反應(yīng)管均呈天藍(lán)色，為陽(yáng)性結(jié)果，陰性對(duì)照反應(yīng)管沒(méi)有變色，仍為紫色(圖3)。雪松疫霉根腐病菌的反應(yīng)管均呈天藍(lán)色，為陽(yáng)性結(jié)果，其他疫霉菌、真菌和陰性對(duì)照的反應(yīng)管均呈紫色，為陰性結(jié)果(圖4，5)，結(jié)果表明該引物具有很好的特異性，可以將雪松疫霉根腐病菌與其近似種及其他相關(guān)種區(qū)分開(kāi)。

表2供試菌株及LAMP檢測(cè)結(jié)果

注：NJAU表示南京農(nóng)業(yè)大學(xué)；CAIQ表示中國(guó)檢科院；*表示無(wú)菌株(僅提供菌株的DNA)+表示發(fā)生了LAMP擴(kuò)增；‐表示無(wú)擴(kuò)增。

(二)靈敏度檢測(cè)

在26μL的反應(yīng)體系中測(cè)定了上述所建立的檢測(cè)體系的靈敏度，將10倍梯度稀釋的雪松疫霉根腐病菌的基因組DNA(從100ng·μL^‐1到10fg·μL^‐1)為模板進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，于62℃等溫條件下反應(yīng)80min。圖6顯示了靈敏度檢測(cè)結(jié)果的HNB可視化顯色圖，發(fā)生LAMP擴(kuò)增時(shí)，陽(yáng)性反應(yīng)變?yōu)樘焖{(lán)色，未發(fā)生LAMP擴(kuò)增的仍為紫色。檢測(cè)結(jié)果顯示最低檢測(cè)靈敏度為100pg·μL^‐1。

序列表

<110> 中華人民共和國(guó)昆山出入境檢驗(yàn)檢疫局

<120> 基于顏色判定的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）技術(shù)檢測(cè)雪松疫霉根腐病菌

<160> 5

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<400> 1

CCGTACGATCGAGCTGGA 18

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<400> 2

ACGTCGTACACCACGATGA 19

<210> 3

<211> 42

<212> DNA

<400> 3

ACCCCAAGGAAAGCGGGAAAAA-GCAAGACCATCAAGCTCCA 41

<210> 4

<211> 41

<212> DNA

<400> 4

CTCTTGTAGTGGGACACGGCC-GCGGTAGTAGCTGCTTGTG 40

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<400> 5

GAGCGCTTCCGCACGAT 17