pfHRP-2重組蛋白及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物制品技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種PfHRP-2重組蛋白及其在瘧疾 pfHRP-2檢測(cè)試劑盒的陽(yáng)性質(zhì)控品中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 瘧疾是一種由按蚊傳播的寄生蟲(chóng)病，以發(fā)熱、寒戰(zhàn)、貧血為特征。瘧原蟲(chóng)可分為四 種(惡性瘧、間日瘧、卵形瘧和三日瘧）。目前全球90多個(gè)國(guó)家報(bào)道了瘧疾病例，據(jù)估計(jì)全球 每年發(fā)現(xiàn)5億多臨床病例和270多萬(wàn)瘧疾所致死亡病例，其中惡性瘧所致死亡病例最多。
[0003] 檢測(cè)瘧疾的方法主要分三種:病理學(xué)診斷、免疫學(xué)診斷和分子生物學(xué)診斷。其中病 理學(xué)診斷（顯微鏡鏡檢)是目前公認(rèn)的金標(biāo)準(zhǔn)，缺點(diǎn)是需要訓(xùn)練有素的檢驗(yàn)技術(shù)員，敏感性 較低，不是所有的實(shí)驗(yàn)室都能開(kāi)展瘧原蟲(chóng)鏡檢工作;分子生物學(xué)診斷靈敏度高于病理學(xué)診 斷，但其缺點(diǎn)是技術(shù)復(fù)雜，設(shè)備和環(huán)境要求高、費(fèi)時(shí)，不能在現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用。
[0004] 免疫學(xué)診斷通過(guò)檢測(cè)高特異性的靶抗原來(lái)實(shí)現(xiàn)，目前公認(rèn)的瘧疾靶抗原主要有富 組氨酸蛋白_2(Plasmodium falciparum Histidine-rich protein 2，pfHRP2)、癥原蟲(chóng)乳 酸脫氫酶(Plasmodium Lactate Dehydrogenase，pLDH)。依照標(biāo)記和檢測(cè)系統(tǒng)的不同可分 為：間接焚光抗體法（Indirect Fluorescent Antibody Test IF-ΑΤ)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (Enzyme Linked Immunosorbentassay,ELISA)、免疫層析技術(shù)等。其中基于免疫層析技術(shù) 的膠體金試劑從取血、反應(yīng)至結(jié)果判斷，只需10~15min，而且多個(gè)樣本可同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，不 需特殊儀器，非常適合于瘧疾高發(fā)的邊遠(yuǎn)山區(qū)基層醫(yī)院、衛(wèi)生所防保醫(yī)生和村醫(yī)應(yīng)用。
[0005] 體外診斷試劑校準(zhǔn)品（物）、質(zhì)控品（物)是實(shí)現(xiàn)體外診斷試劑臨床檢測(cè)及監(jiān)督檢驗(yàn) 結(jié)果準(zhǔn)確一致的主要工具，也是保證量值傳遞的實(shí)物計(jì)量標(biāo)準(zhǔn)，如何確保檢測(cè)試劑的有效 性引起了Π )Α的關(guān)注，在2015年FDA公告中要求將質(zhì)控品作為瘧疾HRP 2膠體金檢測(cè)試劑的 必備組分之一。但就目前而言，在市面上很難購(gòu)買(mǎi)到膠體金產(chǎn)品的質(zhì)控品。
[0006] 常規(guī)表達(dá)的pfHRP 2重組蛋白需在高堿性的緩沖情況下才可以充分溶解，而高堿 的環(huán)境并不適合蛋白的活性保持，特別是在蛋白濃度低的情況下，另外高堿性的緩沖環(huán)境， 并不適合膠體金檢測(cè)。
[0007] 瘧疾流行區(qū)主要位于熱帶和亞熱帶地區(qū)，例如非洲、東南亞等。這些區(qū)域氣候炎 熱，地理位置偏僻，經(jīng)濟(jì)落后。美國(guó)CTK生物技術(shù)公司的質(zhì)控品采用凍干保存的形式，干粉2 ~30°C可保存1年，重溶后2~8°C可保存1周，其要求存儲(chǔ)溫度低于30°C，重溶后需低溫保 存，不適合高溫環(huán)境，且重溶后穩(wěn)定性差，只能保存一周時(shí)間。BinaxNOW公司的質(zhì)控品采用 凍干保存的形式，干粉2~8°C保存，重溶后< _20°C保存，同樣不適合高溫環(huán)境。因此，開(kāi)發(fā) 一種能夠適合高溫環(huán)境的瘧疾HRP-2膠體金檢測(cè)的質(zhì)控品顯得尤為重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 基于此，為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提供了一種pfHRP-2重組蛋白及其 在瘧疾pfHRP-2檢測(cè)的陽(yáng)性質(zhì)控品中的應(yīng)用，該陽(yáng)性質(zhì)控品適合高溫環(huán)境，具有高穩(wěn)定性， 用于檢定試劑卡的有效性。
[0009] 為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采取了以下技術(shù)方案：
[0010] 一種pfHRP-2重組蛋白，其具有如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列。
[0011]本發(fā)明還提供了所述pfHRP-2重組蛋白在瘧疾pfHRP-2檢測(cè)中作為陽(yáng)性質(zhì)控品的 應(yīng)用。
[0012] 本發(fā)明還提供了一種瘧疾pfHRP-2檢測(cè)的陽(yáng)性質(zhì)控品，其包含上述pfHRP-2重組蛋 白。
[0013]在其中一些實(shí)施例中，所述陽(yáng)性質(zhì)控品還包括凍干保護(hù)劑，所述凍干保護(hù)劑為含 有2~5wt % 明膠、5~IOwt %海藻糖、1~5wt %BSA、0 · 05~0 · 2wt %proClean300、0 · 2~ lwt% 吐溫20的0.01 ~0· IM PBS。
[0014]本發(fā)明還提供了一種瘧疾pfHRP-2檢測(cè)試劑盒，其包含上述陽(yáng)性質(zhì)控品。
[0015]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：
[0016] 1、本發(fā)明的pfHRP-2重組蛋白是借助生物信息學(xué)軟件，通過(guò)序列分析在保證 pfHRP-2蛋白常見(jiàn)抗原表位完整的情況下，通過(guò)序列優(yōu)化在改變蛋白的pi的同時(shí)，引入親水 序列進(jìn)一步提高蛋白的親水性，最終制備得到的重組蛋白在中性以及弱堿性環(huán)境下的溶解 度提高，進(jìn)而從分子層面上提高了蛋白的穩(wěn)定性；
[0017] 2、本發(fā)明的瘧疾pfHRP-2檢測(cè)的陽(yáng)性質(zhì)控品含有高穩(wěn)定性的pfHRP-2重組蛋白，陽(yáng) 性質(zhì)控品為凍干制劑，使用時(shí)，將質(zhì)控品用試劑盒中配套樣本稀釋液復(fù)溶到原體積，即可使 用，可在2~40°C保存1年以上，滿(mǎn)足運(yùn)輸及使用過(guò)程中對(duì)高溫環(huán)境的要求;復(fù)溶后，可在2~ 30°C保存1個(gè)月以上，以確保重復(fù)使用。
【附圖說(shuō)明】
[0018]圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中經(jīng)改造拼接前后的PfHRP-2重組蛋白序列的親疏水性和抗 原性對(duì)比圖，其中圖IA-B為親疏水性對(duì)比，圖IC-D為抗原性對(duì)比；
[0019]圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中經(jīng)改造拼接前后的pfHRP-2重組蛋白序列的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性對(duì) 比圖；
[0020] 圖3為本發(fā)明試驗(yàn)例1中的膠體金標(biāo)準(zhǔn)色板；
[0021] 圖4為本發(fā)明試驗(yàn)例1中的特異性C水平的范圍。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 為能進(jìn)一步了解本發(fā)明的特征、技術(shù)手段以及所達(dá)到的具體目的、功能，解析本發(fā) 明的優(yōu)點(diǎn)與精神，藉由以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的闡述。
[0023]以下實(shí)施例中的步驟除了特殊說(shuō)明外，均為本領(lǐng)域常規(guī)操作步驟，以下實(shí)施例中 所使用的原料，均來(lái)源于市售。
[0024] 實(shí)施例1 一種pfHRP-2重組蛋白
[0025] 該實(shí)施例的pfHRP-2重組蛋白，具有如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列。
[0026]該實(shí)施例的pfHRP-2重組蛋白的制備方法，包括如下具體步驟：
[0027] 1、針對(duì)瘧疾分布特點(diǎn)，選擇流行株序列為模板(WHO公布的亞洲、非洲區(qū)流行株； Genbank(U69551.1))進(jìn)行序列改造和拼接；在第22個(gè)氨基酸位點(diǎn)和第45位點(diǎn)增加序列 HATDAHHAADAHHATDAHHAADA(該序列在抗原性能方面，涵蓋了多個(gè)高頻抗原特異性位點(diǎn)，親 水性能好），并修飾空間結(jié)構(gòu)序列；
[0028]經(jīng)改造拼接前后的序列的親疏水性和抗原性分別如圖IA-B和圖IC-D所示，從圖1 結(jié)果可以看出，插入基團(tuán)提高了序列親水性，增強(qiáng)了蛋白溶解性;經(jīng)改造拼接前后的結(jié)構(gòu)穩(wěn) 定性分別如圖2A和圖2B所示，從圖2結(jié)果可以看出，新序列空間結(jié)構(gòu)形成的抗原性位點(diǎn)增 多，提高了特異性。
[0029] 2、經(jīng)序列改造和拼接后，純化得到pfHRP-2重組蛋白，其具有如SEQ ID NO: 1所示 的氨基酸序列。
[0030]實(shí)施例2 -種瘧疾PfHRP-2檢測(cè)的陽(yáng)性質(zhì)控品
[00311該實(shí)施例的瘧疾pfHRP-2檢測(cè)的陽(yáng)