一種嵌合Fc受體的融合蛋白及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種新型重組融合蛋白及其制備方法和應(yīng)用，特別涉及一種嵌合了 Fc 受體的重組融合蛋白及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 腫瘤尤其是惡性腫瘤是當(dāng)今世界嚴(yán)重危害人類健康的疾病，在各種疾病所致死亡 中高居第二位。而且近年來，其發(fā)病率呈明顯上升趨勢。惡性腫瘤治療效果差，晚期轉(zhuǎn)移率 高，預(yù)后多不佳。目前臨床上所采用的常規(guī)治療方法如放、化療和手術(shù)治療雖然在很大程 度上緩解了病痛，延長了生存時間，但這些方法均存在很大的局限性，其療效難以進(jìn)一步提 尚。
[0003] 大量研究表明，腫瘤在形成過程中，可通過多重機(jī)制，逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)視，我們 將這一過程稱之為腫瘤組織的免疫逃逸或免疫編輯。T細(xì)胞在腫瘤免疫的過程中處于核心 地位，如果能調(diào)動體內(nèi)的殺傷武器，將是非常有效且安全的治療策略。T細(xì)胞的活化啟動和 效應(yīng)發(fā)揮的過程中至少需要兩種信號存在，第一種信號是抗原特異性的，由主要組織相容 性復(fù)合體（Major histocompatibility complex，MHC)以及與其結(jié)合的抗原肽被T細(xì)胞受 體（T cell reCeptor，TCR)識別并結(jié)合后，由TCR復(fù)合物向T細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)激活信號；第二種 激活信號是抗原非特異性的，是由抗原遞呈細(xì)胞（antigen presenting cell，APC)和T細(xì) 胞上多種輔助分子之間的配對和相互作用而提供的，能夠提供第二種激活信號的一類T細(xì) 胞膜蛋白又被稱為共刺激分子，在T細(xì)胞活化中發(fā)揮重要作用。
[0004] 隨著腫瘤免疫學(xué)理論和技術(shù)的發(fā)展，免疫治療在腫瘤治療中的作用日益受到重 視。T淋巴細(xì)胞在腫瘤免疫應(yīng)答中起主要作用，包括CIK(cytokine_induced killer)細(xì) 胞治療在內(nèi)的T細(xì)胞過繼性細(xì)胞免疫治療雖然在部分腫瘤中取得了一定的效果，但在大多 數(shù)腫瘤中療效尚不能令人滿意。近年來發(fā)展的利用基因改造技術(shù)表達(dá)腫瘤特異性嵌合抗 原受體（chimeric antigen receptor，CAR)的T細(xì)胞顯示出持久的革巴向殺傷活性，為過繼 性細(xì)胞免疫治療注入了新的解決方案。CAR是將識別腫瘤相關(guān)抗原的ScFv(single-chain variable fragment，ScFv)單鏈抗體、跨膜區(qū)和能誘導(dǎo)T細(xì)胞活化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域在體 外進(jìn)行基因重組，形成重組質(zhì)粒，在體外通過慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)染經(jīng)純化和大規(guī)模擴(kuò)增后 的Τ細(xì)胞，穩(wěn)定表達(dá)CAR的Τ細(xì)胞稱之為CAR-T細(xì)胞。這種基因改造也可幫助Τ細(xì)胞直接 識別腫瘤而不必要求通過TCR來識別MHC-抗原肽的限制性。臨床前和臨床研究均顯示 (Cancer Res 2010;70:9053-9061 ;Sci Transl Med 3,95ra73)，CAR-Τ 在體外及體內(nèi)均有 對特定腫瘤抗原的高度親和性及對抗原負(fù)荷細(xì)胞的高效殺傷性。
[0005] CAR-Τ細(xì)胞較其他基于T細(xì)胞的治療方式存在以下優(yōu)勢：①使用患者自體細(xì)胞，降 低排異反應(yīng)風(fēng)險；②鑒于很多腫瘤細(xì)胞表達(dá)相同的腫瘤抗原，針對某一種腫瘤抗原的CAR 基因構(gòu)建一旦完成，便可以被廣泛利用；③CAR既可以利用腫瘤蛋白質(zhì)抗原，又可利用糖 脂類非蛋白質(zhì)抗原，擴(kuò)大了腫瘤抗原靶點(diǎn)范圍；④CAR-Τ細(xì)胞作用過程不受MHC的限制； ⑤CAR-Τ細(xì)胞具有免疫記憶功能，可以長期在體內(nèi)存活。
[0006] 通常情況下，CAR包含一個用來識別腫瘤細(xì)胞表面抗原的胞外結(jié)構(gòu)域，一個保證 抗原識別域具有一定自由度鉸鏈區(qū)，一個跨膜結(jié)構(gòu)域，以及一個或幾個串聯(lián)的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域/ 模體（motif)用以觸發(fā)能導(dǎo)致T細(xì)胞活化的下游信號（Leukemia (2004) 18, 676 - 684)。大多 數(shù)CAR的抗原識別域是一種ScFv單鏈抗體，整合了單克隆抗體重鏈和輕鏈的可變區(qū)。許多 CAR的識別域來自抗體可變區(qū)，這可能被宿主的免疫系統(tǒng)識別并導(dǎo)致抗可變區(qū)片段的免疫 反應(yīng)，這有可能限制體內(nèi)過繼性T細(xì)胞的持久性。最初CAR的胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域/模體一 般僅含有CD3 ζ結(jié)構(gòu)域，往往不能有效誘導(dǎo)T細(xì)胞的活化，但經(jīng)過近十年的發(fā)展，新一代融 合了多種免疫共刺激分子（如CD28和4-1ΒΒ等）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的CAR能夠充分誘導(dǎo)過繼 性T淋巴細(xì)胞的增殖和效應(yīng)活性（Molecular Therapy νο?. 17ηο· 8, 1453 - 1464aug. 2009)。 CD28分子在調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞生存和增殖方面有著重要作用，也對的效應(yīng)功能和細(xì)胞記憶的建 立起著關(guān)鍵作用；這些作用的產(chǎn)生是由于募集如PI3K，Grb2和Lck之類的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子， 這些分子反過來調(diào)節(jié)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子如NF- κ B的活性，進(jìn)而增加 IL-2和INF- γ的合成和分 泌。TNF受體超家族，如4-1ΒΒ，也為維持Τ細(xì)胞應(yīng)答提供共刺激信號，在Τ細(xì)胞生存和⑶8+Τ 細(xì)胞的記憶維持中發(fā)揮關(guān)鍵作用；這類受體通過招募腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子-1/2 (TNF receptor-associated factor 1/2，TRAF1)和下游的銜接子，激活下游的ΜΑΡΚ和NF-κΒ信 號途徑。
[0007] 尋找完美的信號組合時，除了增加共刺激結(jié)構(gòu)域，目前還有其他一些方法用于增 加 CARS的抗腫瘤活性。在最近的一項(xiàng)研究中，經(jīng)基因改造的T細(xì)胞表達(dá)含⑶28和⑶3 ζ 結(jié)構(gòu)域的CARs并產(chǎn)生IL-15 ( -種對Τ淋巴細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和生存至關(guān)重要的細(xì)胞因子），這一組 合將使T淋巴細(xì)胞在體內(nèi)和體外具有較高的生存能力和增殖潛能，以及體內(nèi)更高效的抗腫 瘤活性。另外，過繼性T淋巴細(xì)胞還可被修飾使其可誘導(dǎo)表達(dá)自殺基因 iCasp9以限制其增 殖和毒性，因?yàn)檫@些刺激信號的結(jié)合可以造成危險的無法控制的過度增殖。
[0008] 最初的CAR用總的T淋巴細(xì)胞作為基因轉(zhuǎn)化的靶細(xì)胞。然而，最近研究顯示，中央 記憶性T細(xì)胞（central memory T cells)這一亞群更適合進(jìn)行CAR轉(zhuǎn)移，它們在體內(nèi)具有 更持久性且更高效的抗腫瘤活性。除了利用T淋巴細(xì)胞外，一些研究者提出利用其它淋巴 細(xì)胞群進(jìn)行CAR修飾。例如，NK細(xì)胞經(jīng)過CAR修飾后，對靶細(xì)胞表現(xiàn)出高的細(xì)胞毒性。
[0009] 重度免疫缺陷小鼠（N0D/Shi-scid/IL-2Rynull，N0G)是體內(nèi)檢測CARs修飾淋巴 細(xì)胞最常用的動物模型。這種小鼠沒有成熟的T和B淋巴細(xì)胞，允許接種人細(xì)胞（腫瘤細(xì) 胞或淋巴細(xì)胞）到體內(nèi)而沒有明顯的排斥反應(yīng)。
[0010] FcR為一類能結(jié)合免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig)可結(jié)晶段（fragment crystallizable，F(xiàn)c)的受體，在免疫調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮重要作用。人Ig根據(jù)其重鏈的差異可 分為IgM、IgG、IgA、IgD和IgE五類，各類Ig的功能差異主要與其Fc段結(jié)構(gòu)有關(guān)。機(jī)體內(nèi) 許多細(xì)胞表面表達(dá)不同類Ig的Fc受體，通過Fc受體與Fc的結(jié)合，參與Ig介導(dǎo)的生理功 能或病理損傷過程。目前已鑒定明確屬于簇分化抗原（cluster of differentiation，CD) 的Fc受體有Fc γ R、Fc a R、Fc ε R，它們分別可以結(jié)合IgG、IgA和IgE。
[0011] 小鼠 FcyR 有四種，分別為 FcyRI、FcyRIIB、FcyRIII 和 FcyRIV。FcyR 很 保守，相應(yīng)的人類蛋白為 Fc γ RIA(CD64)、Fc γ RIIA(CD32A)、Fc γ RIIB (CD32B)、Fc γ RIIC、 FcyRIIIA(CD16A)和FcyRIIIB(CD16B)。從結(jié)構(gòu)上說，F(xiàn)cR及其配體都屬于一個免疫球 蛋白的大家族。大多數(shù)Fey R都有兩個胞外結(jié)構(gòu)域，而Fey RI有三個。按照它們與配體 結(jié)合的親和力不同，F(xiàn)cyR又可大致分為高親和力和低親和力受體；按照它們的功能差異， Fc γ R可大致分為激活性和抑制性受體。小鼠和人的Fc γ R中，F(xiàn)c γ RI均為唯一高親和力 受體，而其它均為低親和力受體。信號通路方面，小鼠和人的Fc γ RIIB結(jié)合相應(yīng)配體后可 以轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制性信號，其它Fc γ R -般在配體結(jié)合后轉(zhuǎn)導(dǎo)激活性信號。
[0012] CAR-T細(xì)胞技術(shù)在美國已獲得III期臨床研究許可。目前，重大產(chǎn)業(yè)項(xiàng)目部門致 力于CAR技術(shù)的前期技術(shù)轉(zhuǎn)化及與現(xiàn)有CIK-Prominent技術(shù)的產(chǎn)業(yè)整合研究。在此，我們 將常規(guī)CAR識別腫瘤相關(guān)抗原的ScFv置換成Fc γ R的Fc結(jié)合結(jié)構(gòu)域，構(gòu)建了一類新型嵌 合Fc受體，轉(zhuǎn)染這類受體的T細(xì)胞與腫瘤特異性抗體組合使用，在體外對表達(dá)特定抗原的 腫瘤細(xì)胞具有很高的殺傷效能，在體內(nèi)也有很好的抑制腫瘤生長的作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 本發(fā)明的目的在于提供一種全新的嵌合了 Fc受體的融合蛋白及其制備方法和應(yīng) 用，該融合蛋白能與Ig結(jié)合并誘導(dǎo)T細(xì)胞活化從而實(shí)現(xiàn)抗腫瘤的作用。
[0014] 本發(fā)明的第一方面，提供了一種嵌合Fc受體的融合蛋白，所述融合蛋白的氨基酸 序列為 SEQ ID N0 :2 或 SEQ ID N0 :4。
[0015] 本發(fā)明的第二方面，提供了一種編碼本發(fā)明第一方面所述融合蛋白的核苷酸序 列，編碼氨基酸序列SEQ ID N0:2的核苷酸序列為SEQ ID NO: 1;編碼氨基酸序列