一種低產(chǎn)高級醇高產(chǎn)乳酸乙酯釀酒酵母菌株及其構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種低產(chǎn)高級醇高產(chǎn)乳酸乙酯釀酒酵母菌株及其構(gòu)建方法，包括目的基因的獲得，染色體整合載體的構(gòu)建和選育菌株發(fā)酵驗證。選育的酵母菌株對南極假絲酵母(Pseudozyma antarctica)脂肪酶B進行異源分泌表達，與親本菌株相比：所構(gòu)建的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株基本發(fā)酵性能不受影響，高粱原料半固態(tài)白酒發(fā)酵6天后，選育菌株乳酸乙酯含量提高了57.4％?84.5％；高級醇生成量顯著降低，分別為：異戊醇降低了9.5％，異丁醇降低了約50.0％，活性戊醇降低了約44.0％。選育的釀酒酵母菌株顯著提高乳酸乙酯生成量的同時降低高級醇生成量，在一定程度上解決了酒類風味物質(zhì)不協(xié)調(diào)等問題，在白酒相關(guān)領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用前景。CICC3231520080123
【專利說明】
一種低產(chǎn)高級醇高產(chǎn)乳酸乙酯釀酒酵母菌株及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及工業(yè)微生物的育種，尤其是一種低產(chǎn)高級醇 高產(chǎn)乳酸乙酯的釀酒酵母菌株及其構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 白酒中的微量風味物質(zhì)是影響白酒品質(zhì)的主要因素，含量約占其中酯類 物質(zhì)又占微量成分的60%_90%，因此提高白酒的酯含量對于形成白酒風味典型性具有非 常重要的意義。高含量酯能夠使得酒體柔和，香味協(xié)調(diào)，改善飲料酒的品質(zhì)。清香型白酒酯 類化合物中乳酸乙酯僅次于乙酸乙酯，乳酸乙酯和乙酸乙酯的含量及比例對白酒的風味影 響很大。而對于老白干香型白酒來說，乳酸乙酯含量要多于乙酸乙酯，其比例為1.5-2.2:1， GB/T20825規(guī)定，老白干香型白酒乳酸乙酯/乙酸乙酯彡0.80,因此乳酸乙酯含量對于對固 態(tài)清香型白酒具有非常重要的意義。由于現(xiàn)代大型白酒企業(yè)衛(wèi)生條件控制嚴格，新廠建立 等，使得白酒中乳酸乙酯生成量較低，尤其是冬季，乳酸乙酯生成量更少，嚴重影響白酒風 味，造成酒香不突出，后味淡薄。工業(yè)上為了增香通常會加入產(chǎn)酯酵母，這對乳酸乙酯的生 成量幾乎沒有作用，另一方面通過延長發(fā)酵時間和窖藏陳釀時間提高酯香物質(zhì)不僅增加耗 糧，還會帶來糠嗅味、澀味、酸味等異味物質(zhì)影響白酒品質(zhì)。同時高級醇作為酒類重要的助 香物質(zhì)，含量過高，使酒產(chǎn)生令人不愉快的異雜味，影響酒的風味和品質(zhì)。此外高級醇在人 體內(nèi)的代謝速度遠低于乙醇，對人體的毒害作用更大。
[0003] 如何提高飲料酒中酯香物質(zhì)的含量，能否讓釀酒酵母大量酯化乳酸和乙醇合成乳 酸乙酯，是一個困擾我國現(xiàn)代大型飲料酒業(yè)界和相關(guān)科研單位的問題。目前提高普通白酒 乳酸乙酯含量的主要方法有如下三種:一是全液法，在發(fā)酵醪中加入產(chǎn)香微生物，乳酸菌發(fā) 酵液或?qū)⑷樗岚l(fā)酵液經(jīng)化學，生物法酯化后，再加到發(fā)酵醪中。二是調(diào)香法，用天然香料調(diào) 制或用純化學藥品按某一名酒的香味成分組成來進行調(diào)香;三是固液結(jié)合法，用液態(tài)法生 產(chǎn)酒基，用固態(tài)法的酒糟、酒尾或成品酒來提高質(zhì)量;這些提高酒中乳酸乙酯含量的方法大 多是從工藝水平上進行的，雖然酯香物質(zhì)含量有一定提高，但酒質(zhì)與高檔名酒相差仍很大， 特別是化學品的添加存在安全隱患。而通過延長發(fā)酵時間和窖藏陳釀時間提高酯香物質(zhì)不 僅增加耗糧，還會帶來糠嗅味、澀味、酸味等異味物質(zhì)對白酒品質(zhì)的影響。對于降低白酒高 級醇含量，一般通過改變發(fā)酵工藝條件，如發(fā)酵溫度、時間及工藝方法等，但降低較高不顯 著，發(fā)酵性能不穩(wěn)定。以上提高酯類物質(zhì)的方法均以改變發(fā)酵工藝為切入點，不僅收效甚 微，甚至存在安全隱患。選育高產(chǎn)乳酸乙酯低產(chǎn)高級醇釀酒酵母菌株，通過改變酵母相關(guān)代 謝途徑，能夠有效解決乳酸乙酯生成量低高級醇生成量較高的問題。
[0004] 白酒中酯類的生成途徑有兩種：一種是通過有機反應(yīng)生成酯，在常溫條件下極為 緩慢，往往需要經(jīng)幾年時間才能使酯化反應(yīng)達平衡；另一種就是由微生物的生化反應(yīng)生成 酯，這是白酒生產(chǎn)中產(chǎn)酯的主要途徑。存在于酒醅中的漢遜酵母、假絲酵母等微生物，均有 較強的產(chǎn)酯能力。近年來已有關(guān)于南極假絲酵母脂肪酶B合成短鏈酯類的相關(guān)研究。孫海龍 等研究了表面展示處理后的南極假絲酵母脂肪酶B對丟糟中有機酸酯化效果的影響，酒樣 品乙酸乙酯和乳酸乙酯含量均有了很大提高。但目前國內(nèi)酒類生產(chǎn)的相關(guān)研究中，并沒有 將南極假絲酵母脂肪酶B基因異源整合到釀酒酵母細胞中以提高乳酸乙酯生成量的相關(guān)報 道。釀酒酵母酒精發(fā)酵過程中，25%的高級醇來源于Ehrlich途徑，代謝途徑中的BAT2基因 編碼的支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶能夠?qū)⑾嚓P(guān)氨基酸分解為高級醇前體物α_酮酸。因此通過選育 ΒΑΤ2基因缺失的酵母菌株，降低α-酮酸生成量可達到降低釀酒酵母高級醇生成量的目的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是解決釀酒酵母在酒類生產(chǎn)中合成乳酸乙酯能力較低以及高級醇 含量較高的問題，提供一種低產(chǎn)高級醇高產(chǎn)乳酸乙酯的釀酒酵母菌株及其構(gòu)建方法。
[0006] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明技術(shù)方案如下：
[0007] 本發(fā)明提供三株含分泌信號肽低產(chǎn)高級醇高產(chǎn)乳酸乙酯釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)菌株，命名為a5CALBi、a5CALBn和a5CALBa。選擇的分泌信號 肽分別為釀酒酵母a接合因子信號肽MFal，菊粉酶信號肽CSS和南極假絲酵母脂肪酶B信號 肽nsB。高粱原料半固態(tài)白酒發(fā)酵6天后，a5CALBi乳酸乙酯含量提高了84.5 %、a5CALBn提高 了74.7%、a5CALBa提高了57.38%;高級醇生成量降低顯著，分別為:異戊醇降低了9.5%， 異丁醇降低了約50.0 %，活性戊醇降低了約44.0 %。
[0008] 本發(fā)明所述低產(chǎn)高級醇高產(chǎn)乳酸乙酯酵母菌株的構(gòu)建方法，是通過用強啟動子異 源分泌表達南極假絲酵母脂肪酶B基因，并同時敲除細胞質(zhì)支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶基因來實現(xiàn)。
[0009] 所述異源表達南極假絲酵母脂肪酶B基因替換細胞質(zhì)支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶基因。 [0010]所述細胞質(zhì)支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶基因為BAT2,其Gene ID為:853613,核苷酸序列如 核苷酸序列表中SEQ NO: 1所示；所述異源表達南極假絲酵母脂肪酶B基因為CALB，其Gene ID為:515792，核苷酸序列如核苷酸序列表中SEQ NO: 2所示。
[0011] 所述出發(fā)酵母菌株為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CICC32315。
[0012] 本發(fā)明低產(chǎn)高級醇高產(chǎn)乳酸乙酯酵母菌株的構(gòu)建方法具體包括如下步驟：
[0013] 1)將通過PCR方法獲得到來源于華南理工大學贈予的質(zhì)粒PMD20-T-CALB-2上的 CALB基因片段連到質(zhì)粒Yep-PGK上，得到三種質(zhì)粒Yep-PGK-CALB(目的片段含有三種分泌信 號肽序列）；
[0014] 2)使用PCR方法獲得來源于釀酒酵母CICC32315支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶基因 BAT2上下 同源臂BA、BB;
[0015] 3)使用PCR方法獲得來源于三種質(zhì)粒Yep-PC上的目的片段PGKp-CALBi-PGKT、 PGKp-CALBn-PGKT和PGKp-CALBa-PGKT;以及來源于質(zhì)粒pUG6上的抗性基因 KanMX;
[0016] 4)使用融合PCR方法將三種目的片段PGKp-CALB-PGKT和Μ融合得到BA-PGK-CALB 片段，連接到質(zhì)粒PUC19后得到質(zhì)粒pUC-BAPCi、pUC-BAPCn和pUC-BAPCa;
[0017] 5)使用融合PCR方法將片段KanMX與BB融合得到片段KanMX-BB片段，連接三種質(zhì)粒 pUC-BAPC 后得到 pUC-BABPCiK、pUC-BABPCnK 和 pUC-BABPCaK;
[0018] 6)制備出發(fā)酵母菌株CICC32315的單倍體，篩選出各項發(fā)酵性能綜合最優(yōu)的a型和 α型單倍體，并以α型單倍體作為出發(fā)菌株進行以下步驟操作。
[0019] 7)將通過PCR方法獲得的來源于構(gòu)建的三種質(zhì)粒pUC-BABPCK的重組盒BA-PGK-CALBi-KanMX-BB、BA-PGK-CALBn-KanMX-BB和BA-PGK-CALBa-KanMX-BB，用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法分 別將其重組入釀酒酵母CICC32315a型單倍體，同源重組后得到釀酒酵母基因菌株。
[0020] 高粱原料半固態(tài)白酒發(fā)酵:稱取78g高粱，加入200mL 60-70°C熱水，靜置20min后 加入液化酶85~90°C浸泡lh，充分吸水液化，115°C蒸煮20min，降溫至60°C，加糖化酶水浴 保溫30min，靜置降溫到30°C后加入大曲12g和接種2%乳酸菌，培菌12h后，按500萬/mL接菌 量接種a5CALB酵母菌株，30°C培養(yǎng)發(fā)酵。
[0021 ] GC分析：發(fā)酵液經(jīng)蒸餾后，酒樣進行氣相色譜分析，色譜條件為：氣相色譜儀為 Agilent 7890C，并且配置有Agilent G4512A自動進樣器，色譜柱Agilent 1909N-213,30m X 0.32mm X 0.5μπι毛細血管柱，檢測器為FID。進樣口的溫度設(shè)置為200°C，檢測器的溫度為 200°C。進樣量條件：UiL的進樣量，并設(shè)置為5:1的分流比。載氣為高純度的氮氣，流速設(shè)置 為2.0mL/min。升溫程序:起始柱溫設(shè)置為50°C，保持8min，再以5°C/min的升溫速度上升至 120°(：，保持511^11。
[0022] 有益效果：
[0023] 1、本發(fā)明提供了一種低產(chǎn)高級醇高產(chǎn)乳酸乙酯釀酒酵母菌株，既克服了普通釀酒 酵母酯化生成乳酸乙酯能力低導致的風味不協(xié)調(diào)，同時降低了對人體有不良影響的高級醇 的產(chǎn)生量。
[0024] 2、本發(fā)明提供的低產(chǎn)高級醇高產(chǎn)乳酸乙酯釀酒酵母在保持良好發(fā)酵性能的前提 下，完全敲除氨基酸轉(zhuǎn)氨酶編碼基因 BAT2,同時異源高表達南極假絲酵母脂肪酶B編碼基因 CALB，達到了高產(chǎn)乳酸乙酯低產(chǎn)高級醇的目的，為釀造出風味優(yōu)良且更有利于健康的白酒 奠定了理論基礎(chǔ)，具有廣闊的市場前景。
[0025] 3、本發(fā)明選育得到的酵母菌株乳酸乙酯、高級醇生成量有顯著變化:高粱原料半 固態(tài)白酒發(fā)酵6天后，與親本菌株相比，乳酸乙酯含量提高了 57.4%-84.5%，異戊醇降低了 9.5%，異丁醇降低了約50.0%，活性戊醇降低了約44.0%。
【附圖說明】
[0026] 圖1重組質(zhì)粒pUC-BABPCK的構(gòu)建流程示意圖；
[0027] 圖2重組質(zhì)粒pUC-BABPCK的驗證電泳圖；
[0028] 圖3重組質(zhì)粒pUC-BABPCK與酵母基因組的同源重組示意圖；
[0029]圖4釀酒酵母構(gòu)建菌株的PCR驗證電泳圖。
【具體實施方式】
[0030] 下面通過具體的實施方案敘述本發(fā)明。除非特別說明，本發(fā)明中所用的技術(shù)手段 均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法。另外，實施方案應(yīng)理解為說明性的，而非限制本發(fā)明的 范圍，本發(fā)明的實質(zhì)和范圍僅由權(quán)利要求書所限定。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不背離本 發(fā)明實質(zhì)和范圍的前提下，對這些實施方案中的物料成分和用量進行的各種改變或改動也 屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0031] 本發(fā)明所使用的釀酒酵母是可以采用任何來源的釀酒酵母菌株。
[0032] 實施例1:低產(chǎn)高級醇高產(chǎn)乳酸乙酯釀酒酵母菌株的構(gòu)建 [0033] 菌株主要構(gòu)建過程如下：
[0034] l)pUC_BABPCK 質(zhì)粒的構(gòu)建
[0035] 以pUC-19為基礎(chǔ)質(zhì)粒構(gòu)建同源重組質(zhì)粒pUC-BABPCK，構(gòu)建流程如圖1所示(菌株構(gòu) 建方法基本相同），以釀酒酵母CICC32315單倍體α5為模板使用引物BA-U(SEQ N0:3)和BA-D (SEQ N0:4)PCR擴增得到502bp的上游同源臂Μ以及BB-U(SEQ N0:5)和BB-D(SEQ N0:6) 501bp的下游同源臂BB。以華南理工大學贈予的pMD20-T-CALB-2質(zhì)粒為模板，使用三種目的 基因上游引物Ci-U(SEQN0:7)、Cn-U(SEQN0:8)、Ca-U(SEQN0:9)和下游引物C-D (SEQ NO: 10) PCR擴增得到954bp的南極假絲酵母脂肪酶B基因 CALB，通過Bgl II單酶切插入到Y(jié)ep-PGK質(zhì) 粒上的啟動子PGKp和終止子PGKt之間，得到三種質(zhì)粒Yep-PGK-CALB;以Yep-PGK-CALB質(zhì)粒 為模板，使用引物PGKr-U (SEQ NO: 11)和PGKr-D (SEQ NO: 12) PCR擴增得到 2794bp、2800bp和 3012bp 目的片段PGK-CALBi、PGK-CALBn和PGK-CALBa片段。使用融合PCR方法將PGK-CALB和 BA進行融合得到三種片段BA-PGK-CALB，大小為3296bp、3202bp和3514bp;以pUG6質(zhì)粒為模 板，使用引物Kr-U (SEQ NO: 13)和Kr-D (SEQ NO: 14) PCR擴增獲得1613bp的KanMX基因，使用 融合PCR方法將KanMX和BB進行融合得到片段KanMX-BB，大小為2115bp;將三種片段BA-PGK-CALB經(jīng)Sma頂每切回收后用Solution I連接酶連接到pUC19質(zhì)粒，得到質(zhì)粒pUC-BAPC; 然后Sph I酶切KanMX基因和質(zhì)粒pUC-BAPC，用Solution I連接酶連接，構(gòu)建三個重組質(zhì)粒 pUC-BABPCiK、pUC-BABPCnK和pUC-BABPCaK。整個過程所用引物的序列如表1。
[0036] 表 1 PCR 引物
[0038] 圖2為質(zhì)粒pUC-BABPCK的驗證電泳圖：其中泳道Μ為5000bp DNALadder Marker;其 中圖（a)泳道1-2為以受體菌為模板PCR擴增到的502bp上同源臂片斷Μ和501bp下同源臂 BB;泳道3為以質(zhì)粒pUG6為模板PCR擴增到的1613bp KanMX片段；（b)泳道1為對照片段 KanMX;泳道2為融合片段KanMX-BB;(c)泳道1為以Yep-PGK-CALB為模板PCR擴增得到2794bp 大小對照片段PGK-CALBi ;泳道2為PGK-CALBi和BA融合為3296bp的BA-PGK-CALBi片段;泳道 3為PGK-CALBn和Μ融合為3302bp的BA-PGK-CALBn片段；泳道4為PGK-CALBa和Μ融合為 3514bp片段BA-PGK-CALBa;(d)泳道1為以三個重組質(zhì)粒pUC-BABPCK為模板，分別PCR擴增得 至Ij5410bp、5416bp 和 5628bp 條帶大小的 BA-PGK-CALBi-KanMX-BB、BA-PGK-CALBn-KanMX-BB 和 BA-PGK-CALBa -KanMX-BB 同源重組片段。
[0039] 2)重組釀酒酵母菌株的構(gòu)建
[0040] 以3個重組質(zhì)粒pUC-BABPCK為模板，PCR擴增獲得長達5410bp、5416bp和5628bp重 組盒BA-PGK-CALB-KanMX-BB，用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法分別將其轉(zhuǎn)化入釀酒酵母CICC32315生孢分 離獲得的α型單倍體中，獲得同源重組后的釀酒酵母單倍體菌株。同源重組過程如圖3所示。 [0041 ] 重組釀酒酵母單倍體的驗證：
[0042] 根據(jù)釀酒酵母CICC32315重組位點兩端的基因序列和插入的同源重組序列，分別 設(shè)計兩組上下游引物，以生長較好單倍體轉(zhuǎn)化子基因組為模板，進行PCR擴增，驗證重組子。 引物序列為：
[0047] 分別以引物D1-U/D1-D和D2-U/D2-D進行上、下游定點PCR驗證，其中上游引物D1- U/D1-D的PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，可看到一條大小1483bp的特異性條帶，其大 小與預期一致;下游引物D2-U/D2-D的PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8 %的瓊脂糖凝膠電泳，可看到一條大小 1343bp的特異性條帶，其大小與預期一致，受體菌α型單倍體的陰性對照無條帶，說明重組 盒BA-PGK-CALB-KanMX-BB片段已成功重組到釀酒酵母CICC32315單倍體基因組中，并且重 組位置也正確。電泳結(jié)果如圖4所示，重組釀酒酵母驗證結(jié)果。
[0048] 圖4中Μ為5000bp DNA Ladder Marker，其中（a)中泳道1為受體菌α型單倍體的陰 性對照;泳道2為a5CALBi上游定點驗證PCR產(chǎn)物;泳道3為a5CALBn上游定點驗證PCR產(chǎn)物;泳 道4為a5CALBa上游定點驗證PCR產(chǎn)物；（b)中泳道1為受體菌α型單倍體的陰性對照;泳道2為 a5CALBi下游定點驗證PCR產(chǎn)物;泳道3為a5CALBn下游定點驗證PCR產(chǎn)物;泳道4為a5CALBa下 游定點驗證PCR產(chǎn)物
[0049] 實施例2:含菊粉酶信號肽INU菌株高粱原料半固態(tài)白酒發(fā)酵實驗
[0050] 1)發(fā)酵工藝路線：
[0051] 高粱-浸泡-液化-糖化-冷卻-拌曲、接乳酸菌-培菌12h-發(fā)酵-蒸餾
[0052] 2)工藝條件:浸泡條件:60-70°C，充分吸水;蒸煮條件：115°C蒸煮30min左右;液化 條件：85~90 °C，耐高溫α-淀粉酶，液化60min ;糖化條件：55~60 °C，加入糖化酶，糖化 20min;發(fā)酵條件:30 °C，7天;蒸酒條件：1 OOmL發(fā)酵液，加 1 OOmL水，蒸出1 OOmL酒樣。
[0053] 3)配料：高粱粉:78g;加水200mL;耐高溫α-淀粉酶：25yL;糖化酶:45yL;酸性蛋白 酶：1.2mL;大曲5g;接種量:500萬/mL。
[0054]按上述發(fā)酵工藝對釀酒酵母出發(fā)菌株a5和選育菌株a5CALBi進行半固態(tài)大曲白酒 發(fā)酵實驗;發(fā)酵期間每隔12h振蕩并稱重，記錄失重;發(fā)酵結(jié)束后，停止培養(yǎng)并稱重;測定發(fā) 酵液的殘?zhí)菨舛取⒕凭纫约爸饕銡獬煞趾?。以發(fā)酵能力、殘?zhí)菨舛群彤a(chǎn)物生成量表征 其綜合性能，結(jié)果見表2。
[0055] 表2表明：本發(fā)明所獲得的釀酒酵母菌株與初始的原菌相比，高粱原料半固態(tài)白酒 發(fā)酵實驗時，發(fā)酵性能沒有太大變化。
[0056] 表2高粱原料半固態(tài)白酒發(fā)酵的發(fā)酵性能
[0058]注:所示數(shù)據(jù)為三個平行試驗結(jié)果的平均值 [0059]表3高粱原料半固態(tài)白酒發(fā)酵的主要風味物質(zhì)
[0061] 注:所示數(shù)據(jù)為三個平行試驗結(jié)果的平均值
[0062] 表3表明：本發(fā)明所獲得的釀酒酵母菌株與初始的原菌相比，高粱原料半固態(tài)白酒 發(fā)酵實驗時，高級醇類的正丙醇含量沒有變化。與親本菌株相比，選育的酵母菌株a5CALBi 異丁醇降低了48.7%，活性戊醇降低了42.7%，異戊醇降低較少，為12.9%。對于乳酸乙酯 生成量，酵母菌株a5CALBi提高了84.5%，乳酸乙酯生成量提高顯著。
[0063] 實施例3:含CalB自身信號肽nsB菌株高粱原料半固態(tài)白酒發(fā)酵實驗
[0064] 1)發(fā)酵工藝路線：
[0065]發(fā)酵工藝與實施例2中1) 一致。
[0066] 2)工藝條件:與實施例2中2)-致。
[0067] 3)配料:與實施例2中3)-致。
[0068]按上述發(fā)酵工藝對釀酒酵母出發(fā)菌株α5和選育菌株a5CALBn進行半固態(tài)大曲白酒 發(fā)酵實驗;發(fā)酵期間每隔12h振蕩并稱重，記錄失重;發(fā)酵結(jié)束后，停止培養(yǎng)并稱重;測定發(fā) 酵液的殘?zhí)菨舛取⒕凭纫约爸饕銡獬煞趾?。以發(fā)酵能力、殘?zhí)菨舛群彤a(chǎn)物生成量表 征其綜合性能，結(jié)果見表4。
[0069]表4高粱原料半固態(tài)白酒發(fā)酵的發(fā)酵性能
[0071] 注:所示數(shù)據(jù)為三個平行試驗結(jié)果的平均值
[0072] 表4表明：本發(fā)明所獲得的釀酒酵母菌株與初始的原菌相比，高粱原料半固態(tài)白酒 發(fā)酵實驗時，發(fā)酵性能沒有太大變化。
[0073] 表5表明：本發(fā)明所獲得的釀酒酵母菌株與初始的原菌相比，高粱原料半固態(tài)白酒 發(fā)酵實驗時，選育菌株高級醇類的正丙醇含量沒有明顯變化。與親本菌株相比，選育菌株a 5CALBn異丁醇降低了47.4%，活性戊醇降低了41.0%，異戊醇降低較少，為11.5%。對于乳 酸乙酯生成量，酵母菌株a5CALBn提高了74.7%，乳酸乙酯生成量提高顯著。
[0074]表5高粱原料半固態(tài)白酒發(fā)酵的主要風味物質(zhì)
[0076] 注:所示數(shù)據(jù)為三個平行試驗結(jié)果的平均值
[0077] 實施例4:含a接合因子信號肽菌株高粱原料半固態(tài)白酒發(fā)酵實驗
[0078] 1)發(fā)酵工藝路線：
[0079]發(fā)酵工藝與實施例2中1) 一致。
[0080] 2)工藝條件:與實施例2中2)-致。
[0081] 3)配料:與實施例2中3)-致。
[0082]按上述發(fā)酵工藝對釀酒酵母出發(fā)菌株a5和選育菌株a5CALBa進行半固態(tài)大曲白酒 發(fā)酵實驗;發(fā)酵期間每隔12h振蕩并稱重，記錄失重;發(fā)酵結(jié)束后，停止培養(yǎng)并稱重;測定發(fā) 酵液的殘?zhí)菨舛?、酒精度以及主要香氣成分含量。以發(fā)酵能力、殘?zhí)菨舛群彤a(chǎn)物生成量表征 其綜合性能，結(jié)果見表6。
[0083 ]表6高粱原料半固態(tài)白酒發(fā)酵的發(fā)酵性能
[0085] 注:所示數(shù)據(jù)為三個平行試驗結(jié)果的平均值
[0086] 表6表明：本發(fā)明所獲得的釀酒酵母菌株與初始的原菌相比，高粱原料半固態(tài)白酒 發(fā)酵實驗時，發(fā)酵性能沒有太大變化。
[0087] 表7高粱原料半固態(tài)白酒發(fā)酵的主要風味物質(zhì)
[0089] 注:所示數(shù)據(jù)為三個平行試驗結(jié)果的平均值
[0090] 表7表明：本發(fā)明所獲得的釀酒酵母菌株與初始的原菌相比，高粱原料半固態(tài)白酒 發(fā)酵實驗時，選育菌株高級醇類的正丙醇含量沒有變化。與親本菌株相比，選育菌株a5CALB a異丁醇降低了 50.9%，活性戊醇降低了 45.6%，異戊醇降低較少，為13.5%。對于乳酸乙酯 生成量，酵母菌株a5CALBn提高了57.4%，乳酸乙酯生成量提高顯著。
【主權(quán)項】
1. 選育出的低產(chǎn)高級醇高產(chǎn)乳酸乙酯釀酒酵母菌株，是在釀酒酵母出發(fā)菌株中完全敲 除支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶編碼基因 BAT2同時分泌表達南極假絲酵母(Pseudozyma antarctica) 脂肪酶B編碼基因 CALB獲得的。2. 如權(quán)利要求1所述的低產(chǎn)高級醇高產(chǎn)乳酸乙酯釀酒酵母菌株，其特征在于，所述出發(fā) 菌株為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)CICC32315〇3. 如權(quán)利要求1所述的低產(chǎn)高級醇高產(chǎn)乳酸乙酯釀酒酵母菌株，其特征在于，所述釀酒 酵母菌株為異源分泌表達。4. 如權(quán)利要求1所述的低產(chǎn)高級醇高產(chǎn)乳酸乙酯釀酒酵母菌株，其特征在于，所述BAT2 基因其Gene ID為:853613,核苷酸序列如核苷酸序列表中SEQ N0:1所示;所述CALB基因其 Gene ID為:515792,核苷酸序列如核苷酸序列表中SEQ N0:2所示。5. 選育的低產(chǎn)高級醇高產(chǎn)乳酸乙酯釀酒酵母菌株制備方法，包括以下步驟： 將目的片段CALB連接到含有PGK強啟動子的質(zhì)粒上;通過PCR擴增獲得CALB基因和強啟 動子的連接片段;通過融合PCR方法將連接片段、KanMX基因、BAT2上下同源臂序列按照順序 進行融合，通過PCR擴增獲得含BAT2基因同源序列的重組盒。將同源重組盒轉(zhuǎn)入酵母出發(fā)菌 株中，獲得整合分泌表達的重組菌株。6. 如權(quán)利要求1所述的低產(chǎn)高級醇高產(chǎn)乳酸乙酯釀酒酵母菌株在酒類生產(chǎn)中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N1/19GK105969678SQ201610012975
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年1月8日
【發(fā)明人】張翠英, 肖冬光, 劉芳志, 劉鑫, 郭學武, 陳葉福, 杜麗平, 董健, 馬立娟
【申請人】天津科技大學