本發(fā)明涉及生物檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及一種鑒定腸道病毒71型的引物組合及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

腸道病毒71型(Enterovirus 71，EV71)為單股正鏈RNA病毒，屬于小RNA病毒科(Picoranviridae)腸道病毒屬，其衣殼蛋白由VP1、VP2、VP3和VP4四種構(gòu)成。腸道病毒71型可引起手足口病(另一個(gè)主要病原是柯薩奇病毒A16)，是嬰兒和兒童的一種常見(jiàn)疾病，表現(xiàn)為發(fā)熱、口腔潰瘍和皰疹為特征。個(gè)別患者可引起心肌炎、肺水腫、無(wú)菌性腦膜腦炎等并發(fā)癥。腸道病毒EV71感染疾病是全球性傳染病，世界大部分地區(qū)均有此病流行的報(bào)道。1972-1973年、1986年和1999年澳大利亞均發(fā)生過(guò)EV71流行。20世紀(jì)70年代中期，保加利亞、匈牙利相繼暴發(fā)以中樞神經(jīng)系統(tǒng)為主要臨床特征的EV71流行，日本是EV71感染疾病發(fā)病較多的國(guó)家，歷史上有過(guò)多次大規(guī)模流行。20世紀(jì)90年代后期，EV71開(kāi)始肆虐東亞地區(qū)。1997年以來(lái)，該病在馬來(lái)西亞、新加坡等地大規(guī)模爆發(fā)流行，并發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀而導(dǎo)致死亡病例增多，引起世界各國(guó)關(guān)注和警惕。

傳統(tǒng)的腸道病毒71型檢測(cè)方法包括病毒分離檢測(cè)、血清免疫檢測(cè)、免疫組化檢測(cè)以及PCR核酸檢測(cè)等方法。其中，病毒分離檢測(cè)方法周期長(zhǎng)，大概要一周以上的時(shí)間，步驟繁瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且有時(shí)無(wú)法得到合適的臨床樣本進(jìn)而無(wú)法分離得到病毒株。使用血清免疫檢測(cè)的方法需要用血清型特異性的中和抗血清進(jìn)行中和試驗(yàn)，結(jié)果可靠性并不是很高。PCR檢測(cè)法近年來(lái)在臨床檢測(cè)中應(yīng)用頗多，如常規(guī)PCR、RT-PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR等，在病原微生物的檢測(cè)以及疾病診斷方面作用重大，但其一般需要能夠進(jìn)行精密控溫的儀器來(lái)進(jìn)行高級(jí)復(fù)雜的分析，并且對(duì)檢測(cè)人員的操作要求較高，反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)，不適用于樣品的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，不利于基層推廣，無(wú)法滿足疾病防控簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)要求。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)通過(guò)識(shí)別靶序列上6個(gè)特異區(qū)域的引物，在一種具有鏈置換特性的DNA聚合酶——Bst酶(Bst DNApolymerase)的作用下，能夠在恒溫條件下高效、快速、特異地?cái)U(kuò)增DNA靶序列。在反應(yīng)體系中加入逆轉(zhuǎn)錄酶，即可檢測(cè)RNA靶序列。在LAMP體系中加入熒光染料，可根據(jù)反應(yīng)體系中的熒光信號(hào)強(qiáng)度來(lái)判斷反應(yīng)的進(jìn)行情況。目前，LAMP技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于病原微生物的檢測(cè)中，包括人類致病微生物、動(dòng)植物病毒以及寄生蟲(chóng)所致疾病的診斷。對(duì)LAMP技術(shù)而言，引物設(shè)計(jì)是其核心。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種鑒定腸道病毒71型的引物組合及其應(yīng)用。

本發(fā)明提供了一種引物組合，由引物F3-1、引物B3-1、引物FIP-1、引物BIP-1、引物L(fēng)F-1和引物L(fēng)B-1組成；

所述引物F3-1為如下(a1)或(a2)：

(a1)序列表的序列1所示的單鏈DNA分子；

(a2)將序列1經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列1具有相同功能的DNA分子；

所述引物B3-1為如下(a3)或(a4)：

(a3)序列表的序列2所示的單鏈DNA分子；

(a4)將序列2經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列2具有相同功能的DNA分子；

所述引物FIP-1為如下(a5)或(a6)：

(a5)序列表的序列3所示的單鏈DNA分子；

(a6)將序列3經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列3具有相同功能的DNA分子；

所述引物BIP-1為如下(a7)或(a8)：

(a7)序列表的序列4所示的單鏈DNA分子；

(a8)將序列4經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列4具有相同功能的DNA分子；

所述引物L(fēng)F-1為如下(a9)或(a10)：

(a9)序列表的序列5所示的單鏈DNA分子；

(a10)將序列5經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列5具有相同功能的DNA分子；

所述引物L(fēng)B-1為如下(a11)或(a12)：

(a11)序列表的序列6所示的單鏈DNA分子；

(a12)將序列6經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列6具有相同功能的DNA分子。

所述引物組合的用途為如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)：

(b1)鑒定或輔助鑒定待測(cè)病毒是否為腸道病毒71型；

(b2)制備用于鑒定或輔助鑒定待測(cè)病毒是否為腸道病毒71型的試劑盒；

(b3)檢測(cè)待測(cè)樣本是否感染了腸道病毒71型；

(b4)制備用于檢測(cè)待測(cè)樣本是否感染了腸道病毒71型的試劑盒。

本發(fā)明還保護(hù)所述引物組合的應(yīng)用，為如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)：

(b1)鑒定或輔助鑒定待測(cè)病毒是否為腸道病毒71型；

(b2)制備用于鑒定或輔助鑒定待測(cè)病毒是否為腸道病毒71型的試劑盒；

(b3)檢測(cè)待測(cè)樣本是否感染了腸道病毒71型；

(b4)制備用于檢測(cè)待測(cè)樣本是否感染了腸道病毒71型的試劑盒。

本發(fā)明還保護(hù)含有所述引物組合的試劑盒；所述試劑盒的用途為如下(c1)或(c2)：

(c1)鑒定或輔助鑒定待測(cè)病毒是否為腸道病毒71型；

(c2)檢測(cè)待測(cè)樣本是否感染了腸道病毒71型。

本發(fā)明還保護(hù)所述試劑盒的制備方法，包括將各條引物單獨(dú)包裝的步驟。

本發(fā)明還保護(hù)一種鑒定或輔助鑒定待測(cè)病毒是否為腸道病毒71型的方法，包括如下步驟：提取待測(cè)病毒的總RNA；以總RNA為模板，采用所述引物組合進(jìn)行RT-LAMP擴(kuò)增反應(yīng)，如果采用所述引物組合可以實(shí)現(xiàn)以所述總RNA為模板的陽(yáng)性擴(kuò)增、待測(cè)病毒為或候選為腸道病毒71型，如果采用所述引物組合不能實(shí)現(xiàn)以所述總RNA為模板的陽(yáng)性擴(kuò)增、待測(cè)病毒為或候選為非腸道病毒71型。

本發(fā)明還保護(hù)一種鑒定或輔助鑒定待測(cè)病毒是否為腸道病毒71型的方法，包括如下步驟：檢測(cè)待測(cè)病毒的總RNA是否含有所述引物組合的靶序列相應(yīng)的RNA，如果所述總RNA中含有所述引物組合的靶序列相應(yīng)的RNA、待測(cè)病毒為或候選為腸道病毒71型，如果所述總RNA中不含有所述引物組合的靶序列相應(yīng)的RNA、待測(cè)病毒為或候選為非腸道病毒71型。

本發(fā)明還保護(hù)一種檢測(cè)待測(cè)樣本是否感染了腸道病毒71型的方法，包括如下步驟：提取待測(cè)樣本的總RNA；以總RNA為模板，采用所述引物組合進(jìn)行RT-LAMP擴(kuò)增反應(yīng)，如果所述采用引物組合可以實(shí)現(xiàn)以所述總RNA為模板的陽(yáng)性擴(kuò)增、待測(cè)樣本感染或疑似感染了腸道病毒71型，如果采用所述引物組合不能實(shí)現(xiàn)以所述總RNA為模板的陽(yáng)性擴(kuò)增、待測(cè)樣本未感染或疑似未感染腸道病毒71型。

本發(fā)明還保護(hù)一種檢測(cè)待測(cè)樣本是否感染了腸道病毒71型的方法，包括如下步驟：檢測(cè)待測(cè)樣本的總RNA是否含有所述引物組合的靶序列相應(yīng)的RNA，如果所述總RNA中含有所述引物組合的靶序列相應(yīng)的RNA、待測(cè)樣本感染或疑似感染了腸道病毒71型，如果所述總RNA中不含有所述引物組合的靶序列相應(yīng)的RNA、待測(cè)樣本未感染或疑似未感染腸道病毒71型。

以上任一所述RT-LAMP擴(kuò)增反應(yīng)體系中F3-1的終濃度為0.3-0.5μM，B3-1的終濃度為1-2μM，F(xiàn)IP-1的終濃度為2.4-3.4μM，BIP-1的終濃度為2.4-3.4μM，LF-1的終濃度為1-2μM，LB-1的終濃度為1-2μM。

所述F3-1的終濃度具體可為0.3μM，B3-1的終濃度具體可為2μM，F(xiàn)IP-1的終濃度具體可為2.4μM，BIP-1的終濃度具體可為2.4μM，LF-1的終濃度具體可為1μM，LB-1的終濃度具體可為1μM。

以上任一所述RT-LAMP擴(kuò)增反應(yīng)體系中還含有熒光染料Eva-Green。

以上任一所述RT-LAMP擴(kuò)增的反應(yīng)體系具體組成可為：5μL Reaction Mix.，0.4μL酶Mix.，1.09μL混合引物，0.24μL Eva-Green，2μL模板RNA，1.27μL ddH₂O。

所述混合引物即為所述引物組合I中的各條引物組成的混合物。

以上任一所述RT-LAMP擴(kuò)增的反應(yīng)程序具體可為：65℃恒溫60min。反應(yīng)過(guò)程中，采用熒光PCR儀檢測(cè)熒光信號(hào)。

本發(fā)明還保護(hù)引物組合II或引物組合III。

所述引物組合II由引物F3-2、引物B3-2、引物FIP-2、引物BIP-2、引物L(fēng)F-2和引物L(fēng)B-2組成；

所述引物F3-2為如下(d1)或(d2)：

(d1)序列表的序列7所示的單鏈DNA分子；

(d2)將序列7經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列7具有相同功能的DNA分子；

所述引物B3-2為如下(d3)或(d4)：

(d3)序列表的序列8所示的單鏈DNA分子；

(d4)將序列8經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列8具有相同功能的DNA分子；

所述引物FIP-2為如下(d5)或(d6)：

(d5)序列表的序列9所示的單鏈DNA分子；

(d6)將序列9經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列9具有相同功能的DNA分子；

所述引物BIP-2為如下(d7)或(d8)：

(d7)序列表的序列10所示的單鏈DNA分子；

(d8)將序列10經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列10具有相同功能的DNA分子；

所述引物L(fēng)F-2為如下(d9)或(d10)：

(d9)序列表的序列11所示的單鏈DNA分子；

(d10)將序列11經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列11具有相同功能的DNA分子；

所述引物L(fēng)B-2為如下(d11)或(d12)：

(d11)序列表的序列12所示的單鏈DNA分子；

(d12)將序列12經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列12具有相同功能的DNA分子。

所述引物組合III由引物F3-3、引物B3-3、引物FIP-3、引物BIP-3、引物L(fēng)F-3和引物L(fēng)B-3組成；

所述引物F3-3為如下(e1)或(e2)：

(e1)序列表的序列13所示的單鏈DNA分子；

(e2)將序列13經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列13具有相同功能的DNA分子；

所述引物B3-3為如下(e3)或(e4)：

(e3)序列表的序列14所示的單鏈DNA分子；

(e4)將序列14經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列14具有相同功能的DNA分子；

所述引物FIP-3為如下(e5)或(e6)：

(e5)序列表的序列15所示的單鏈DNA分子；

(e6)將序列15經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列15具有相同功能的DNA分子；

所述引物BIP-3為如下(e7)或(e8)：

(e7)序列表的序列16所示的單鏈DNA分子；

(e8)將序列16經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列16具有相同功能的DNA分子；

所述引物L(fēng)F-3為如下(e9)或(e10)：

(e9)序列表的序列17所示的單鏈DNA分子；

(e10)將序列17經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列17具有相同功能的DNA分子；

所述引物L(fēng)B-3為如下(c11)或(c12)：

(e11)序列表的序列18所示的單鏈DNA分子；

(e12)將序列18經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列18具有相同功能的DNA分子。

所述引物組合II的用途為如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)：

(b1)鑒定或輔助鑒定待測(cè)病毒是否為腸道病毒71型；

(b2)制備用于鑒定或輔助鑒定待測(cè)病毒是否為腸道病毒71型的試劑盒；

(b3)檢測(cè)待測(cè)樣本是否感染了腸道病毒71型；

(b4)制備用于檢測(cè)待測(cè)樣本是否感染了腸道病毒71型的試劑盒。

所述引物組合III的用途為如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)：

(b1)鑒定或輔助鑒定待測(cè)病毒是否為腸道病毒71型；

(b2)制備用于鑒定或輔助鑒定待測(cè)病毒是否為腸道病毒71型的試劑盒；

(b3)檢測(cè)待測(cè)樣本是否感染了腸道病毒71型；

(b4)制備用于檢測(cè)待測(cè)樣本是否感染了腸道病毒71型的試劑盒。

本發(fā)明還保護(hù)所述的引物組合II或引物組合III的應(yīng)用，為如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)：

(b1)鑒定或輔助鑒定待測(cè)病毒是否為腸道病毒71型；

(b2)制備用于鑒定或輔助鑒定待測(cè)病毒是否為腸道病毒71型的試劑盒；

(b3)檢測(cè)待測(cè)樣本是否感染了腸道病毒71型；

(b4)制備用于檢測(cè)待測(cè)樣本是否感染了腸道病毒71型的試劑盒。

本發(fā)明還保護(hù)含有所述引物組合II的試劑盒；所述試劑盒的用途為如下(c1)或(c2)：

(c1)鑒定或輔助鑒定待測(cè)病毒是否為腸道病毒71型；

(c2)檢測(cè)待測(cè)樣本是否感染了腸道病毒71型。

本發(fā)明還保護(hù)含有所述引物組合III的試劑盒；所述試劑盒的用途為如下(c1)或(c2)：

(c1)鑒定或輔助鑒定待測(cè)病毒是否為腸道病毒71型；

(c2)檢測(cè)待測(cè)樣本是否感染了腸道病毒71型。

以上任一所述待測(cè)病毒具體可為腸道病毒71型(EV71)、甲型流感病毒(IAV)或鴨肝炎病毒(DHV)。

本發(fā)明成功建立了腸道病毒71型的RT-LAMP檢測(cè)方法。該方法能夠成功檢測(cè)出腸道病毒71型，而且不與其他常見(jiàn)的呼吸道病原微生物發(fā)生非特異性反應(yīng)。本發(fā)明所建立的腸道病毒71型檢測(cè)方法準(zhǔn)確性高、靈敏度高、特異性強(qiáng)。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例3反應(yīng)溫度為63℃時(shí)得到的擴(kuò)增曲線。

圖2為實(shí)施例3反應(yīng)溫度為64℃時(shí)得到的擴(kuò)增曲線。

圖3為實(shí)施例3反應(yīng)溫度為65℃時(shí)得到的擴(kuò)增曲線。

圖4為實(shí)施例4反應(yīng)體系1的擴(kuò)增結(jié)果。

圖5為實(shí)施例4反應(yīng)體系2的擴(kuò)增結(jié)果。

圖6為實(shí)施例4反應(yīng)體系3的擴(kuò)增結(jié)果。

圖7為實(shí)施例4反應(yīng)體系4的擴(kuò)增結(jié)果。

圖8為實(shí)施例4反應(yīng)體系5的擴(kuò)增結(jié)果。

圖9為實(shí)施例4反應(yīng)體系6的擴(kuò)增結(jié)果。

圖10為實(shí)施例4反應(yīng)體系7的擴(kuò)增結(jié)果。

圖11為實(shí)施例5中EV71為模板的擴(kuò)增結(jié)果。

圖12為實(shí)施例5中甲型流感病毒(IAV)為模板的擴(kuò)增結(jié)果。

圖13為實(shí)施例5中人皰疹病毒(EBV)為模板的擴(kuò)增結(jié)果。

具體實(shí)施方式

以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。以下實(shí)施例中的RT-LAMP擴(kuò)增中使用的Reaction Mix.和酶Mix.均來(lái)自Loopamp RNA擴(kuò)增反應(yīng)試劑盒。

Loopamp RNA擴(kuò)增反應(yīng)試劑盒：日本榮研化學(xué)。

鴨肝炎病毒減毒疫苗：南京天邦生物科技有限公司。

實(shí)施例1、引物設(shè)計(jì)及制備

進(jìn)行大量序列分析、比對(duì)獲得了用于鑒定腸道病毒71型的若干引物。將各個(gè)引物進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，比較靈敏度、特異性等性能，最終得到用于鑒定腸道病毒71型的三套引物組合。

用于鑒定腸道病毒71型的引物組合I，包括一對(duì)外引物(F3-1、B3-1)，一對(duì)內(nèi)引物(FIP-1、BIP-1)和一對(duì)環(huán)引物(LF-1、LB-1)，各條引物序列如下所示(5’→3’)：

F3-1(序列表的序列1)：GCCAACTGGGACATAGA；

B3-1(序列表的序列2)：AGGGTCTGACAGCTTGACAA；

FIP-1(序列表的序列3)：GGTGTGCACGCAACAAAAGTGA-GCGCAAATGCGTAGAAAGG；

BIP-1(序列表的序列4)：TATGTTTGTGCCACCTGGAGCC-GGGGTTAGTGGCGGTTTG；

LF-1(序列表的序列5)：TCAAAGCGCATGTAGGTGAATAG；

LB-1(序列表的序列6)：CCTAAGCCAGATTCTAGGGA。

用于鑒定腸道病毒71型的引物組合II，包括一對(duì)外引物(F3-2、B3-2)，一對(duì)內(nèi)引物(FIP-2、BIP-2)和一對(duì)環(huán)引物(LF-2、LB-2)，各條引物序列如下所示(5’→3’)：

F3-2(序列表的序列7)：GCCAACTGGGACATAGACATAA；

B3-2(序列表的序列8)：GTTTGCCATGCAAGGGATTC；

FIP-2(序列表的序列9)：GGTGTGCACGCAACAAAAGTGA-GTTACGCGCAAATGCGTAGA；

BIP-2(序列表的序列10)：CACCGGGGAAGTTGTCCCAC-ATCTGGCTTAGGGGCTCC；

LF-2(序列表的序列11)：TCAAAGCGCATGTAGGTGAATAG；

LB-2(序列表的序列12)：TCCAATATATGTTTGTGCCACC。

用于鑒定腸道病毒71型的引物組合III，包括一對(duì)外引物(F3-3、B3-3)，一對(duì)內(nèi)引物(FIP-3、BIP-3)和一對(duì)環(huán)引物(LF-3、LB-3)，各條引物序列如下所示(5’→3’)：

F3-3(序列表的序列13)：AGTAAGGCCCTCACCCAAG；

B3-3(序列表的序列14)：AGCCTGCTCTGCTGAAGA；

FIP-3(序列表的序列15)：GCGGCTTGAAGTGCTGGTACTT-ACCCACAGGCCAAAACAC；

BIP-3(序列表的序列16)：CGGAGCTTCGTCGAATGCTAGT-GGTGGTTTCAGCTGTGCTAT；

LF-3(序列表的序列17)：GTGTCTAAGCGATGACTGC；

LB-3(序列表的序列18)：GAGAGTATGATTGAGACT。

實(shí)施例2、引物優(yōu)化

1、人工制備EV71裝甲R(shí)NA標(biāo)準(zhǔn)品溶液，RNA序列如序列表的序列19所示。

2、取步驟1得到的EV71裝甲R(shí)NA標(biāo)準(zhǔn)品溶液，95℃加熱1min，以加熱后的RNA標(biāo)準(zhǔn)品溶液作為模板，分別采用實(shí)施例1中制備的引物組合I、引物組合II和引物組合III進(jìn)行RT-LAMP擴(kuò)增。

當(dāng)采用引物組合I時(shí)，RT-LAMP擴(kuò)增的反應(yīng)體系(10μL)：5μL Reaction Mix.，0.4μL酶Mix.，1.09μL混合引物，0.24μL Eva-Green，2μL模板RNA，1.27μL ddH₂O。混合引物即引物組合I中的各條引物組成的混合物。反應(yīng)體系中，F(xiàn)3-1的終濃度為0.3μM，B3-1的終濃度為2μM，F(xiàn)IP-1的終濃度為2.4μM，BIP-1的終濃度為2.4μM，LF-1的終濃度為1μM，LB-1的終濃度為1μM。

當(dāng)采用引物組合II時(shí)，RT-LAMP擴(kuò)增的反應(yīng)體系(10μL)：5μL Reaction Mix.，0.4μL酶Mix.，1.09μL混合引物，0.24μL Eva-Green，2μL模板RNA，1.27μL ddH₂0?；旌弦锛匆锝M合II中的各條引物組成的混合物。反應(yīng)體系中，F(xiàn)3-2的終濃度為0.3μM，B3-2的終濃度為2μM，F(xiàn)IP-2的終濃度為2.4μM，BIP-2的終濃度為2.4μM，LF-2的終濃度為1μM，LB-2的終濃度為1μM。

當(dāng)采用引物組合III時(shí)，RT-LAMP擴(kuò)增的反應(yīng)體系(10μL)：5μL Reaction Mix.，0.4μL酶Mix.，1.09μL混合引物，0.24μL Eva-Green，2μL模板RNA，1.27μL ddH₂O?；旌弦锛匆锝M合III中的各條引物組成的混合物。反應(yīng)體系中，F(xiàn)3-3的終濃度為0.3μM，B3-3的終濃度為2μM，F(xiàn)IP-3的終濃度為2.4μM，BIP-3的終濃度為2.4μM，LF-3的終濃度為1μM，LB-3的終濃度為1μM。

RT-LAMP擴(kuò)增的反應(yīng)程序：64℃恒溫60min。反應(yīng)過(guò)程中，采用熒光PCR儀檢測(cè)熒光信號(hào)。

結(jié)果顯示，采用引物組合I、引物組合II或引物組合III對(duì)模板進(jìn)行擴(kuò)增均可以得到擴(kuò)增曲線，采用引物組合I時(shí)，反應(yīng)體系的出峰時(shí)間早于采用引物組合II或引物組合III時(shí)反應(yīng)體系的出峰時(shí)間，引物組合I為最優(yōu)引物組合。

實(shí)施例3、反應(yīng)溫度優(yōu)化

1、人工制備EV71裝甲R(shí)NA標(biāo)準(zhǔn)品溶液，RNA序列如序列表的序列19所示。

2、取步驟1得到的EV71裝甲R(shí)NA標(biāo)準(zhǔn)品溶液，95℃加熱1min，以加熱后的RNA標(biāo)準(zhǔn)品溶液作為模板，采用實(shí)施例1中制備的引物組合I進(jìn)行RT-LAMP擴(kuò)增。

RT-LAMP擴(kuò)增的反應(yīng)體系(10μL)：5μL Reaction Mix.，0.4μL酶Mix.，1.09μL混合引物，0.24μL Eva-Green，2μL模板RNA，1.27μL ddH₂O?；旌弦锛匆锝M合I中的各條引物組成的混合物。反應(yīng)體系中，F(xiàn)3-1的終濃度為0.3μM，B3-1的終濃度為2μM，F(xiàn)IP-1的終濃度為2.4μM，BIP-1的終濃度為2.4μM，LF-1的終濃度為1μM，LB-1的終濃度為1μM。

RT-LAMP擴(kuò)增的反應(yīng)程序：一定溫度下恒溫60min。反應(yīng)過(guò)程中，采用熒光PCR儀檢測(cè)熒光信號(hào)。

分別設(shè)置如下反應(yīng)溫度：

反應(yīng)溫度I：63℃；

反應(yīng)溫度II：64℃；

反應(yīng)溫度III：65℃。

每個(gè)反應(yīng)體系設(shè)置3次重復(fù)。設(shè)置等體積水作為模板的陰性對(duì)照。

結(jié)果如圖1-圖3所示。圖1為反應(yīng)溫度為63℃時(shí)得到的擴(kuò)增曲線。圖2為反應(yīng)溫度為64℃時(shí)得到的擴(kuò)增曲線。圖3為反應(yīng)溫度為65℃時(shí)得到的擴(kuò)增曲線。圖1-圖3中，橫坐標(biāo)為循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)為ΔRn。

結(jié)果表明，反應(yīng)溫度為65℃時(shí)，檢測(cè)效果最好。

實(shí)施例4、靈敏度

1、用ddH₂O10倍梯度稀釋實(shí)施例2步驟1得到的EV71裝甲R(shí)NA標(biāo)準(zhǔn)品溶液，得到各個(gè)稀釋液。

2、將步驟1得到的各稀釋液95℃加熱1min，以加熱后的稀釋液作為模板，采用實(shí)施例1中制備的引物組合I進(jìn)行RT-LAMP擴(kuò)增。

RT-LAMP擴(kuò)增的反應(yīng)體系(10μL)：5μL Reaction Mix.，0.4μL酶Mix.，1.09μL混合引物，0.24μL Eva-Green，2μL模板RNA，1.27μL ddH₂O?；旌弦锛匆锝M合I中的各條引物組成的混合物。反應(yīng)體系中，F(xiàn)3-1的終濃度為0.3μM，B3-1的終濃度為2μM，F(xiàn)IP-1的終濃度為2.4μM，BIP-1的終濃度為2.4μM，LF-1的終濃度為1μM，LB-1的終濃度為1μM。

RT-LAMP擴(kuò)增的反應(yīng)程序：65℃恒溫60min。反應(yīng)過(guò)程中，采用熒光PCR儀檢測(cè)熒光信號(hào)。

由于采用的稀釋液的稀釋度不同，形成如下不同的反應(yīng)體系：

反應(yīng)體系1中，EV71 RNA的初始含量為8×10⁷個(gè)拷貝；

反應(yīng)體系2中，EV71 RNA的初始含量為8×10⁶個(gè)拷貝；

反應(yīng)體系3中，EV71 RNA的初始含量為8×10⁵個(gè)拷貝；

反應(yīng)體系4中，EV71 RNA的初始含量為8×10⁴個(gè)拷貝；

反應(yīng)體系5中，EV71 RNA的初始含量為8×10³個(gè)拷貝；

反應(yīng)體系6中，EV71 RNA的初始含量為8×10²個(gè)拷貝；

反應(yīng)體系7中，EV71 RNA的初始含量為8×10¹個(gè)拷貝。

每個(gè)反應(yīng)體系設(shè)置3次重復(fù)。

結(jié)果如圖4-10所示。圖4-圖10依次為反應(yīng)體系1-7的擴(kuò)增結(jié)果。圖4-10中，橫坐標(biāo)為循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)為ΔRn。

結(jié)果表明，本方法最低檢出限為8×10²個(gè)拷貝的病毒核酸。

實(shí)施例5、特異性

待測(cè)樣本為實(shí)施例2人工制備的EV71裝甲R(shí)NA標(biāo)準(zhǔn)品溶液、人工制備的甲型流感病毒(IAV)裝甲R(shí)NA標(biāo)準(zhǔn)品溶液(RNA序列如序列表的序列20所示)、鴨肝炎病毒減毒疫苗。

1、提取待測(cè)樣本的總RNA。

2、以步驟1提取的總RNA作為模板，分別采用實(shí)施例1中制備的引物組合I進(jìn)行RT-LAMP擴(kuò)增。

RT-LAMP擴(kuò)增的反應(yīng)體系(10μL)：5μL Reaction Mix.，0.4μL酶Mix.，1.09μL混合引物，0.24μL Eva-Green，2μL模板RNA，1.27μL ddH₂0?；旌弦锛匆锝M合I中的各條引物組成的混合物。反應(yīng)體系中，F(xiàn)3-1的終濃度為0.3μM，B3-1的終濃度為2μM，F(xiàn)IP-1的終濃度為2.4μM，BIP-1的終濃度為2.4μM，LF-1的終濃度為1μM，LB-1的終濃度為1μM。

RT-LAMP擴(kuò)增的反應(yīng)程序：65℃恒溫60min。反應(yīng)過(guò)程中，采用熒光PCR儀檢測(cè)熒光信號(hào)。

每個(gè)反應(yīng)體系設(shè)置3次重復(fù)。

結(jié)果如圖11-圖13所示。圖11為EV71裝甲R(shí)NA標(biāo)準(zhǔn)品溶液的擴(kuò)增結(jié)果，圖12為甲型流感病毒(IAV)裝甲R(shí)NA標(biāo)準(zhǔn)品溶液的擴(kuò)增結(jié)果，圖13為鴨肝炎病毒減毒疫苗的擴(kuò)增結(jié)果。圖11-圖13中，橫坐標(biāo)為時(shí)間(min)，縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度。結(jié)果表明，只有EV71的樣本可以得到陽(yáng)性擴(kuò)增曲線，甲型流感病毒或鴨肝炎病毒的樣本均未得到陽(yáng)性擴(kuò)增曲線，本方法具有良好的特異性。

SEQUENCE LISTING

<110> 博奧生物集團(tuán)有限公司

<120> 鑒定腸道病毒71型的引物組合及其應(yīng)用

<160> 20

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

gccaactggg acataga 17

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 2

agggtctgac agcttgacaa 20

<210> 3

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 3

ggtgtgcacg caacaaaagt gagcgcaaat gcgtagaaag g 41

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 4

tatgtttgtg ccacctggag ccggggttag tggcggtttg 40

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 5

tcaaagcgca tgtaggtgaa tag 23

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 6

cctaagccag attctaggga 20

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 7

gccaactggg acatagacat aa 22

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 8

gtttgccatg caagggattc 20

<210> 9

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 9

ggtgtgcacg caacaaaagt gagttacgcg caaatgcgta ga 42

<210> 10

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 10

caccggggaa gttgtcccac atctggctta ggggctcc 38

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 11

tcaaagcgca tgtaggtgaa tag 23

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 12

tccaatatat gtttgtgcca cc 22

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 13

agtaaggccc tcacccaag 19

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 14

agcctgctct gctgaaga 18

<210> 15

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 15

gcggcttgaa gtgctggtac ttacccacag gccaaaacac 40

<210> 16

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 16

cggagcttcg tcgaatgcta gtggtggttt cagctgtgct at 42

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 17

gtgtctaagc gatgactgc 19

<210> 18

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 18

gagagtatga ttgagact 18

<210> 19

<211> 891

<212> RNA

<213> 腸道病毒71型

<400> 19

ggagauaggg uggcagaugu aauugaaagu uccauaggag auagcgugag cagagcccuc 60

acucacgcuc uaccagcacc cacaggccag aacacacagg ugagcaguca ucgacuggau 120

acaggcaagg uuccagcacu ccaagcugcu gaaauuggag caucaucaaa ugcuagugac 180

gagagcauga uugagacacg cuguguucuu aacucgcaca guacagcuga gaccacucuu 240

gauaguuucu ucagcagggc gggauuaguu ggagagauag aucucccucu uaagggcaca 300

acuaacccaa augguuaugc caacugggac auagacauaa cagguuacgc gcaaaugcgu 360

agaaagguag agcuauucac cuacaugcgc uuugaugcag aguucacuuu uguugcgugc 420

acacccaccg gggaaguugu cccacaauug cuccaauaua uguuugugcc accuggagcc 480

ccuaagccag auucuaggga aucccuugca uggcaaaccg ccacuaaccc cucaguuuuu 540

gucaagcugu cagacccucc agcgcagguu ucagugccau ucaugucacc ugcgagugcu 600

uaucaauggu uuuaugacgg auaucccaca uucggagaac acaaacagga gaaagaucuu 660

gaauacgggg cauguccuaa uaacaugaug ggcacguucu cagugcggac uguggggacc 720

uccaagucua aguacccuuu agugguuagg auuuacauga ggaugaagca cgucagggcg 780

uggauaccuc gcccgaugcg uaaccagaac uaccuauuca aagccaaccc aaauuaugcu 840

ggcaacucca uuaagccaac uggugccagu cgcacagcga ucaccacucu u 891

<210> 20

<211> 982

<212> RNA

<213> 甲型流感病毒

<400> 20

augagucuuc uaaccgaggu cgaaacguac guucuuucua ucaucccguc aggcccccuc 60

aaagccgaga ucgcgcagag acuggaaagu gucuuugcag gaaagaacac agaucuugag 120

gcucucaugg aauggcuaaa gacaagacca aucuugucac cucugacuaa gggaauuuua 180

ggauuugugu ucacgcucac cgugcccagu gagcgaggac ugcagcguag acgcuuuguc 240

caaaaugccc uaaaugggaa uggggacccg aacaacaugg auagagcagu uaaacuauac 300

aagaagcuca aaagagaaau aacguuccau ggggccaagg aggugucacu aagcuauuca 360

acuggugcac uugccaguug caugggccuc auauacaaca ggaugggaac agugaccaca 420

gaagcugcuu uuggucuagu gugugccacu ugugaacaga uugcugauuc acagcaucgg 480

ucucacagac agauggcuac uaccaccaau ccacuaauca ggcaugaaaa cagaauggug 540

cuggcuagca cuacggcaaa ggcuauggaa cagauggcug gaucgaguga acaggcagcg 600

gaggccaugg agguugcuaa ucagacuagg cagaugguac augcaaugag aacuauuggg 660

acucauccua gcuccagugc uggucugaaa gaugaccuuc uugaaaauuu gcaggccuac 720

cagaagcgaa ugggagugca gaugcagcga uucaagugau ccucucguca uugcagcaaa 780

uaucauuggg aucuugcacc ugauauugug gauuacugau cgucuuuuuu ucaaauguau 840

uuaucgucgc uuuaaauacg guuugaaaag agggccuucu acggaaggag ugccugaguc 900

caugagggaa gaauaucaac aggaacagca gagugcugug gauguugacg auggucauuu 960

ugucaacaua gagcuagagu aa 982