一種抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及生物制藥領(lǐng)域，尤其涉及一種抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的方法；采用Crispr/cas9技術(shù)定點(diǎn)敲除腫瘤細(xì)胞的DP103基因；通過(guò)定點(diǎn)敲除腫瘤細(xì)胞的DP103基因，可以有效降低腫瘤轉(zhuǎn)移能力。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
一種抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及生物制藥領(lǐng)域，尤其涉及一種抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 在過(guò)去的幾十年里，抗腫瘤藥的篩選主要是考察其對(duì)快速生長(zhǎng)細(xì)胞的毒性作用。 隨著腫瘤生物學(xué)研究的發(fā)展，人們認(rèn)識(shí)到腫瘤細(xì)胞不僅具有旺盛的增殖能力，而且還具有 破壞自身組織、浸潤(rùn)相鄰組織以及浸潤(rùn)血管或淋巴管并隨著血液或淋巴液轉(zhuǎn)移到其他組織 的能力。腫瘤和正常組織的相互作用與腫瘤的血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移等特性有很大的關(guān)系。 腫瘤轉(zhuǎn)移已成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)之一。
[0003] 腫瘤轉(zhuǎn)移是指腫瘤細(xì)胞從原發(fā)部位擴(kuò)散到機(jī)體其它部位的現(xiàn)象。統(tǒng)計(jì)表明，超過(guò) 90 %的腫瘤患者死亡源于腫瘤轉(zhuǎn)移。腫瘤轉(zhuǎn)移包括：1、腫瘤細(xì)胞迀移通過(guò)腫瘤組織基底膜； 2、進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，在其中存活并轉(zhuǎn)運(yùn);3、在腫瘤繼發(fā)部位滯留；4、從循環(huán)系統(tǒng)滲出；5、浸入 腫瘤繼發(fā)部位并增殖形成新的腫瘤等過(guò)程。由于其復(fù)雜性，盡管已對(duì)其進(jìn)行了廣泛的研究， 腫瘤轉(zhuǎn)移仍然是迄今了解得最少的腫瘤生物學(xué)過(guò)程。腫瘤轉(zhuǎn)移這一復(fù)雜過(guò)程是由多種基因 調(diào)節(jié)的。其中有些基因促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生，叫做腫瘤轉(zhuǎn)移促進(jìn)基因。多年來(lái)，利用各種基 因過(guò)表達(dá)手段，人們找到了一些腫瘤轉(zhuǎn)移促進(jìn)基因，例如，AmfHgf/sfJGF-lMMPdPAj-catenin 等。
[0004] 另一類(lèi)基因抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生，叫做腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因。通常，腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基 因能抑制腫瘤轉(zhuǎn)移而對(duì)原發(fā)腫瘤生長(zhǎng)無(wú)影響，在轉(zhuǎn)移病灶中常通過(guò)甲基化或轉(zhuǎn)錄翻譯后修 飾等一系列機(jī)制表現(xiàn)為表達(dá)下調(diào)。為了更好地了解腫瘤轉(zhuǎn)移，人們?cè)噲D進(jìn)一步揭示腫瘤轉(zhuǎn) 移抑制基因在腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生過(guò)程中的作用。顯而易見(jiàn)，尋找腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因需要通過(guò)降 低腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)。但是，由于沒(méi)有可靠的降低表達(dá)手段，長(zhǎng)期以來(lái)只確定了 非常有限的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，目前只有匪23、謂11、1(1331、11(1(4、8-31、6 &81等有限的基 因符合腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因的定義標(biāo)準(zhǔn)，其中最為明確的是匪23和KNI1。從而使得對(duì)腫瘤轉(zhuǎn) 移抑制基因的研究、開(kāi)發(fā)、利用無(wú)法進(jìn)行，極大地限制了對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的了解、診斷和治療。
[0005] Crispr/cas9的工作原理是crRNA(CRISPR-derived RNA)通過(guò)喊基配對(duì)與 tracrRNA(trans-activating RNA)結(jié)合形成tracrRNA/crRNA復(fù)合物，此復(fù)合物引導(dǎo)核酸酶 Cas9蛋白在與crRNA配對(duì)的序列靶位點(diǎn)剪切雙鏈DNA。而通過(guò)人工設(shè)計(jì)這兩種RNA，可以改造 形成具有引導(dǎo)作用的sgRNA( Singleguide RNA)，足以引導(dǎo)Cas9對(duì)DNA的定點(diǎn)切割。
[0006] 作為一種RNA導(dǎo)向的dsDNA結(jié)合蛋白，Cas9效應(yīng)物核酸酶是已知的第一個(gè)統(tǒng)一因子 (unifying factor)，能夠共定位RNA、DNA和蛋白，從而擁有巨大的改造潛力。將蛋白與無(wú)核 酸酶的Cas9(Cas9nuclease-null)融合，并表達(dá)適當(dāng)?shù)膕gRNA，可革E定任何dsDNA序列，而 sgRNA的末端可連接到目標(biāo)DNA，不影響Cas9的結(jié)合。因此，Cas9能在任何dsDNA序列處帶來(lái) 任何融合蛋白及RNA，這為生物體的研究和改造帶來(lái)巨大潛力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一種基于Crispr/cas9技術(shù)、通過(guò)定點(diǎn) 切割腫瘤轉(zhuǎn)移促進(jìn)基因、以降低腫瘤轉(zhuǎn)移能力的抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的方法。
[0008]本發(fā)明提供一種抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的方法，采用Crispr/cas9技術(shù)定點(diǎn)敲除腫瘤細(xì)胞 的DP103基因。DP103基因又稱(chēng)為DDX20或GEMIN3,其N(xiāo)CBI數(shù)據(jù)庫(kù)（National Center for Biotechnology Inf ormation，http : //www .ncbi.nlm.nih. gov/)上記載的Gene ID 為 11218〇
[0009] DP103是DEAD-box家族蛋白成員之一，命名來(lái)源于其中Asp-Glu-Ala-Asp在解旋酶 中的位置，DEAD-box家族蛋白，是一個(gè)ATP依賴(lài)的RNA解旋酶家族，參與RNA的各種代謝過(guò)程 如RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)變換、轉(zhuǎn)錄起始、線粒體RNA剪接、核糖體和剪接體裝配、mRNA降解以及維持 mRNA的穩(wěn)定性等，參與胚胎發(fā)育、精子發(fā)生以及細(xì)胞的生長(zhǎng)和分裂等過(guò)程。近期研究發(fā)現(xiàn)該 家族成員之一的DP103基因在轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)。
[00?0] 應(yīng)當(dāng)說(shuō)明的是，Crispr/cas9技術(shù)，是通過(guò)人工設(shè)計(jì)成具有引導(dǎo)作用的gRNA(guide RNA)靶向于目的基因，引導(dǎo)核酸酶Cas9蛋白對(duì)DNA定點(diǎn)切割，致使目的基因不能正常表達(dá)。 在使用該技術(shù)時(shí)需要先對(duì)目的基因的基因組進(jìn)行分析，在該基因的外顯子區(qū)域?qū)ふ褻AS9酶 的作用識(shí)別位點(diǎn)NGG，其中N可以是A、T、C、G中的任意一種，實(shí)驗(yàn)中根據(jù)作用位點(diǎn)前20個(gè)堿基 設(shè)計(jì)合成gRNA的序列正義鏈和反義鏈，即基因敲除引物。兩條單鏈退火成雙鏈后構(gòu)建至 gRNA-cas9克隆載體，進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞或者包裝成病毒，隨后感染細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)靶向目 的基因?qū)ζ溥M(jìn)行切割，使得該基因失活，從而達(dá)到基因敲除的目的。
[0011]進(jìn)一步的，包括以下步驟：
[0012] S1、設(shè)計(jì)并合成靶向于DP103基因的一組基因敲除引物；
[0013] S2、將步驟S1中的一組基因敲除引物退火成雙鏈DNA;
[0014] S3、慢病毒載體酶切；
[0015] S4、將步驟S2獲得的雙鏈DNA與慢病毒載體連接，得到質(zhì)粒；
[0016] S5、將步驟S4獲得的質(zhì)粒與慢病毒包裝輔助質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染細(xì)胞，包裝成慢病毒顆 粒，濃縮純化后感染腫瘤細(xì)胞。
[0017] 應(yīng)當(dāng)說(shuō)明的是，DP103基因共有11個(gè)外顯子構(gòu)成，本發(fā)明中步驟S1中設(shè)計(jì)并合成的 基因敲除引物靶向于DP103基因的第一外顯子。與其他部分的外顯子相比，第一外顯子為轉(zhuǎn) 錄的起始部分，選擇其作為靶點(diǎn)，可以最大程度上提高對(duì)DP103基因的敲除效率，使得該基 因完全失活。
[0018]其中，DP103基因的第一外顯子的基因序列為：
[0020] 基因敲除引物靶向DP103基因的序列為前述序列中下劃線的部分，即：
[0021] ggacccgcacggggg(SEQ ID N0：2)
[0022] 具體而言，該方法中所采用的基因敲除引物如SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4所示。 具體序列為：DP103-sgRNA-lF: CACCGCATCCCCCGTGCGGGTCCG(SEQ ID NO: 3)和DP103-sgRNA-1R：AAACCGGACCCGCACGGGGGATGC(SEQ ID N0：4)〇
[0023]應(yīng)當(dāng)說(shuō)明的是，雖然CAS9普通質(zhì)粒很多時(shí)候也能達(dá)到實(shí)驗(yàn)效果，但是質(zhì)粒轉(zhuǎn)染具 有效率低、作用時(shí)間短暫性等缺點(diǎn)。病毒的出現(xiàn)解決了質(zhì)粒這些問(wèn)題，常用的病毒主要有慢 病毒和腺病毒，慢病毒常用質(zhì)粒如addgene(lentiCRISPR v2、lentiGuide_Puro、 lentiCaS9-Blast)，慢病毒載體介導(dǎo)的基因表達(dá)作用持續(xù)且穩(wěn)定，原因是目的基因整合到 宿主細(xì)胞基因組中，并隨細(xì)胞基因組的分裂而分裂。另外，慢病毒載體能有效感染并整合到 非分裂細(xì)胞中。以上特性使慢病毒載體與其它病毒載體相比，比如不整合的腺病毒載體、整 合率低的腺相關(guān)病毒載體、只整合分裂細(xì)胞的傳統(tǒng)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，有很大的優(yōu)勢(shì)?，F(xiàn)今， 慢病毒載體介導(dǎo)的目的基因長(zhǎng)期表達(dá)的組織或細(xì)胞包括腦、肝臟、肌肉、視網(wǎng)膜、造血干細(xì) 胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等。
[0024]具體而言，該方法步驟S3中所述的慢病毒載體為L(zhǎng)enti-crispr V2。
[0025] 具體而言，步驟S5中質(zhì)粒與慢病毒包裝輔助質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染至293T或293FT細(xì)胞。
[0026] 本發(fā)明提供一種重組慢病毒載體制劑，包括有效劑量的前述慢病毒顆粒。
[0027] 進(jìn)一步的，還包括維持所述制劑的pH值范圍的緩沖液以及糖類(lèi)。所述糖類(lèi)選自單 糖和非還原性二糖中的至少一種。更優(yōu)選所述糖類(lèi)選自葡萄糖、果糖、海藻糖和鹿糖中的至 少一種。以重組慢病毒載體制劑為基準(zhǔn)，所述糖類(lèi)含量的質(zhì)量體積百分比范圍為2-10% (w/ v) 〇
[0028] 借由上述方案，本發(fā)明至少具有以下優(yōu)點(diǎn)：通過(guò)定點(diǎn)切割腫瘤轉(zhuǎn)移促進(jìn)基因 DP103，可以有效降低腫瘤轉(zhuǎn)移能力。
[0029] 上述說(shuō)明僅是本發(fā)明技術(shù)方案的概述，為了能夠更清楚了解本發(fā)明的技術(shù)手段， 并可依照說(shuō)明書(shū)的內(nèi)容予以實(shí)施，以下以本發(fā)明的較佳實(shí)施例并配合附圖詳細(xì)說(shuō)明如后。
【附圖說(shuō)明】
[0030] 圖1是本發(fā)明中不同細(xì)胞中DP103基因表達(dá)檢測(cè)結(jié)果圖；
[0031 ]圖2是本發(fā)明中不同細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)48小時(shí)后細(xì)胞的迀移面積結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0032]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)描述。以下實(shí)施 例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。
[0033] 實(shí)施例1
[0034] 本發(fā)明一較佳實(shí)施例提供一種抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的方法，具體包括以下步驟：
[0035] S1、在腫瘤細(xì)胞中檢測(cè)DP103基因的表達(dá)
[0036] 提取常見(jiàn)腫瘤細(xì)胞和非腫瘤細(xì)胞的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用QPCR的方法檢測(cè) DP103基因在各細(xì)胞系中的表達(dá)量。以非腫瘤細(xì)胞HEK293細(xì)胞做為對(duì)照細(xì)胞。檢測(cè)結(jié)果如圖 1所示，可見(jiàn)各腫瘤細(xì)胞內(nèi)DP103基因存在不同程度的高表達(dá)，其中尤以惡性黑素瘤細(xì)胞系 A375中DP103基因的表達(dá)值最高。
[0038] S2、設(shè)計(jì)并合成針對(duì)DP103基因的靶向序列
[0039] 根據(jù)crispr/cas9祀點(diǎn)設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)并合成革E1向于DP103基因的單鏈核苷酸 (oligo)：
[0042] DP103基因的核苷酸序列為：
gtaaccagtga(SEQ ID NO：7)
[0044]其中，前述序列中下劃線的位置為單鏈核苷酸的靶向區(qū)域。
[0045] DP103基因的氨基酸序列為：
[0047] S3、單鏈核苷酸退火成雙鏈DNA
[0048]將合成的兩條單鏈核苷酸，用超純水溶解成20uM/ml的溶液，各取3ul與14ul超純 水配制成20ul反應(yīng)體系于200ul PCR管中，置于PCR儀中按照95°C:10分鐘，90°C:5分鐘，85 °C : 5分鐘，80°C : 5分鐘，75°C : 5分鐘，70°C : 5分鐘，65°C : 5分鐘，60°C : 5分鐘，55°C : 5分鐘，50 。(：：5分鐘，45 °C : 5分鐘，40 °C : 5分鐘，35 °C : 5分鐘，30 °C : 5分鐘，25 °C : 5分鐘，20 °C : 5分鐘。將 兩條單鏈退火成雙鏈DNA。
[0049] S4、慢病毒載體酶切
[0050] 將Lenti-crispr V2載體用BsmBI(NEB，R0580S)酶切，體系如下：
[0051 ] BsmBI(NEB,R0580S)lul；
[0052] Lenti-crispr V2載體質(zhì)粒3ug;
[0053] NEBuffer3 2ul；
[0054] 補(bǔ)水至 20ul。
[0055] 55°C水浴反應(yīng)lh，用濃度1%瓊脂糖凝膠電泳回收目的載體約12Kb。
[0056] S5、含靶點(diǎn)序列的雙鏈DNA和慢病毒載體連接
[0057] 將退火雙鏈DNA 8ul、Lenti-crispr V2用BsmBI酶切膠回產(chǎn)物6ul、5X T4 DNA Ligase buffer(invitrogen)4ul、T4 DNA Ligase(invitrogen)2ul，配制為總體積20ul的 反應(yīng)體系，置于1.5mlEP管中，25°C水浴反應(yīng)1小時(shí)。
[0058] 取10ul轉(zhuǎn)化100ul DH5a感受態(tài)細(xì)胞，涂板(AMP+)，37°C恒溫培養(yǎng)過(guò)夜。
[0059] S6、慢病毒包裝及感染腫瘤細(xì)胞
[0060] 將步驟S5獲得的DH5a細(xì)胞，提取質(zhì)粒后，與慢病毒包裝輔助質(zhì)粒helperl和質(zhì)粒 helper2共同轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，將其包裝成慢病毒顆粒，并進(jìn)行濃縮純化。隨后感染三株高表 達(dá)DP103基因的腫瘤細(xì)胞（MB231，A375和BT549)和三株低表達(dá)DP103基因的腫瘤細(xì)胞 (SGC7901、MCF7，A549)。
[0061 ] S7、細(xì)胞基因組提取
[0062]提取步驟S6中慢病毒感染后的腫瘤細(xì)胞基因組，進(jìn)行基因組PCR。其引物為：
[0065] 擴(kuò)增產(chǎn)物為485bp，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化回收。
[0066] S8、錯(cuò)配法檢測(cè)基因敲除結(jié)果
[0067] 將步驟S7中獲得的PCR純化產(chǎn)物，用步驟S2中的引物進(jìn)行PCR測(cè)序，退火后用T7E1 酶（NEB)進(jìn)行酶切，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因敲除結(jié)果，可以檢測(cè)出484bp、137bp和 344bp三條DNA條帶。
[0068] S9、劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DP103基因敲除后對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響
[0069] 將等密度的DP103基因敲除的腫瘤細(xì)胞和未進(jìn)行基因敲除的腫瘤細(xì)胞傳于細(xì)胞培 養(yǎng)皿中，傳代后24小時(shí)后細(xì)胞密度約90%，進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)。48小時(shí)后計(jì)算細(xì)胞迀移的面積， 并進(jìn)行對(duì)比。
[0070] 如圖2所示，高表達(dá)DP103基因的腫瘤細(xì)胞在將該基因敲除后轉(zhuǎn)移速度明顯低于未 敲除該基因的腫瘤細(xì)胞。而非高表達(dá)DP103基因的腫瘤細(xì)胞在將該基因敲除后，細(xì)胞轉(zhuǎn)移速 度也有不同程度的降低。
[0071] 實(shí)施例2
[0072] 本發(fā)明一較佳實(shí)施例提供一種重組慢病毒載體制劑，包括有效劑量的前述慢病毒 顆粒。
[0073] 還包括維持制劑的pH值范圍的緩沖液以及作為穩(wěn)定劑的糖類(lèi)。糖類(lèi)選自單糖和非 還原性二糖中的至少一種。更優(yōu)選糖類(lèi)選自葡萄糖、果糖、海藻糖和鹿糖中的至少一種。以 重組慢病毒載體制劑為基準(zhǔn)，糖類(lèi)含量的質(zhì)量體積百分比范圍為2-10%(w/v)。
[0074] 以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，并不用于限制本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技 術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和 變型，這些改進(jìn)和變型也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的方法，其特征在于:采用Crispr/cas9技術(shù)定點(diǎn)敲除腫瘤細(xì)胞的 DP103基因。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的方法，其特征在于:包括以下步驟： 51、 設(shè)計(jì)并合成靶向于DP103基因的一組基因敲除引物； 52、 將步驟Sl中的一組基因敲除引物退火成雙鏈DNA; 53、 慢病毒載體酶切； 54、 將步驟S2獲得的雙鏈DNA與慢病毒載體連接，得到質(zhì)粒； 55、 將步驟S4獲得的質(zhì)粒與慢病毒包裝輔助質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染細(xì)胞，包裝成慢病毒顆粒，濃 縮純化后感染腫瘤細(xì)胞。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的方法，其特征在于:步驟Sl中設(shè)計(jì)并合成的基 因敲除引物靶向于DP103基因的第一外顯子。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的方法，其特征在于:步驟Sl中設(shè)計(jì)并合成的基 因敲除引物靶向于如SEQ ID N0:2所示的序列。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的方法，其特征在于:所采用的基因敲除引物如 SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的方法，其特征在于:步驟S3中所述的慢病毒載 體為L(zhǎng)enti-crispr V2〇7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的方法，其特征在于:步驟S5中質(zhì)粒與慢病毒包 裝輔助質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染至293T或293FT細(xì)胞。8. -種重組慢病毒載體制劑，其特征在于:包括有效劑量的根據(jù)權(quán)利要求2所述的抑制 腫瘤轉(zhuǎn)移的方法得到的慢病毒顆粒。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的重組慢病毒載體制劑，其特征在于:還包括維持所述制劑的pH 值范圍的緩沖液以及糖類(lèi)。
【文檔編號(hào)】C12N15/867GK105886534SQ201610280023
【公開(kāi)日】2016年8月24日
【申請(qǐng)日】2016年4月29日
【發(fā)明人】劉駿, 王滿平
【申請(qǐng)人】蘇州溯源精微生物科技有限公司