腫瘤抑制因子Menin的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及Menin蛋白的應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]Menin由MENl基因編碼，最初被認(rèn)定為一種多發(fā)性內(nèi)分泌腫瘤的抑制因子。我們先前的報(bào)告表明，Menin可以增強(qiáng)PPARa轉(zhuǎn)錄活性和防止肝臟甘油三酯積聚。
[0003]非酒精性脂肪肝病(NAFLD)或肝脂肪變性，特征是甘油三酯(TG)堆積在肝細(xì)胞中，已成為世界性的重要的公共健康問(wèn)題。在中國(guó)，其患病率在成人中達(dá)到約15%。然而，NAFLD進(jìn)程的潛在分子機(jī)制幾無(wú)闡明。
[0004]在一般情況下，肝的TG穩(wěn)態(tài)由TG合成、β氧化和極低密度脂蛋白(VLDL) -TG嚴(yán)格控制。肝脂肪生成的速率取決于多種生脂酶，這是由幾個(gè)核轉(zhuǎn)錄因子，包括固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白lc(SREBP-lc)中、碳水化合物反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(ChREBP基因)，過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體a (PPARalpha)肝X受體(LXRa)和法尼酯X受體(FXR)調(diào)節(jié)。LXRa，核受體超家族的一個(gè)成員，已知誘導(dǎo)SREBP-1c和ChREBP基因的表達(dá)。其結(jié)果是，LXRa由激動(dòng)化合物激活后上調(diào)生脂酶的表達(dá)，從而導(dǎo)致甘油三酯合成和肝脂肪變性。
[0005]Menin是MENl腫瘤抑制基因的產(chǎn)物，參與許多細(xì)胞過(guò)程，包括細(xì)胞增殖，細(xì)胞凋亡和DNA損傷。我們以前的研究發(fā)現(xiàn)，Menin在肥胖小鼠的肝臟中表達(dá)下調(diào)，表明Menin可能參與了肝TG動(dòng)態(tài)平衡的調(diào)控。Menin的腺病毒介導(dǎo)的過(guò)表達(dá)成功的改善了在瘦素受體缺陷(的db/db)小鼠的肝甘油三酯積累。然而，Menin為何能調(diào)節(jié)肝脂肪生成基本上還未闡明。因此，關(guān)于Menin在與肝臟細(xì)胞相關(guān)的應(yīng)用上，亦未被本領(lǐng)域的研究人員所知。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種Menin在使HEK293T細(xì)胞和肝細(xì)胞中內(nèi)源性固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白Ic表達(dá)下降的應(yīng)用,其特征在于:其包括使Menin過(guò)表達(dá)的步驟。
[0007]本發(fā)明的另一目的在于，提供一種Menin在抑制HEK293T細(xì)胞和肝X受體LXRa轉(zhuǎn)錄活性中的應(yīng)用，其特征在于:其包括使Menin過(guò)表達(dá)的步驟。
[0008]本發(fā)明的再一個(gè)目的在于，提供一種Menin在抑制HEK293T細(xì)胞和肝X受體LXR a的靶基因的表達(dá)中的應(yīng)用，其特征在于:其包括使Menin過(guò)表達(dá)并與LXRa相結(jié)合的步驟。
[0009]本發(fā)明的又一個(gè)目的在于，提供一種Menin在下調(diào)HEK293T細(xì)胞和肝細(xì)胞中的脂肪酸合酶，硬脂酰輔酶A去飽或酶-1的基因表達(dá)中的應(yīng)用。
[0010]本發(fā)明的又一個(gè)目的在于，提供一種Menin在降低HEK293T細(xì)胞和肝臟細(xì)胞中甘油三酯的積聚的應(yīng)用，其特征在于，包括:使HEK293T細(xì)胞或肝細(xì)胞中的Menin過(guò)表達(dá)并與LXRa相結(jié)合的步驟。
[0011]本發(fā)明的又一個(gè)目的在于，提供一種Menin在提取LXRa中的應(yīng)用。
[0012]本項(xiàng)目是國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目和上海市自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目資助的:
[0013]2012國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目青年科學(xué)基金項(xiàng)目Menin通過(guò)PPARalpha調(diào)節(jié)肝臟甘油三酯代謝的分子機(jī)制批準(zhǔn)號(hào):81200296項(xiàng)目負(fù)責(zé)人程鵬
[0014]2012年度上海市自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目Menin通過(guò)PPARalpha調(diào)節(jié)肝臟甘油三酯代謝的分子機(jī)制批準(zhǔn)號(hào):12ZR1437800項(xiàng)目負(fù)責(zé)人程鵬
[0015]發(fā)明作用與效果
[0016]根據(jù)本發(fā)明的Menin的用途，將為研究和治療脂肪肝提供新的研究方法和試劑，并對(duì)未來(lái)治療脂肪肝提供了新的途徑。
【附圖說(shuō)明】
[0017]圖1是本發(fā)明的Menin抑制LXRa的轉(zhuǎn)錄活性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；
[0018]圖2是本發(fā)明的Menin的過(guò)度表達(dá)抑制了 LXRa目標(biāo)基因的表達(dá)水平的實(shí)驗(yàn)結(jié)果;
[0019]圖3是本發(fā)明的Menin下調(diào)導(dǎo)致LXRa靶基因上調(diào)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；
[0020]圖4是本發(fā)明的Menin和LXR a的相互作用的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；
[0021]圖5是本發(fā)明的Menin與LXRa的轉(zhuǎn)錄功能共激活因子相競(jìng)爭(zhēng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0022]以下結(jié)合附圖來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
[0023]下列實(shí)施例中未注明具體實(shí)驗(yàn)條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0024]材料與方法
[0025]細(xì)胞培養(yǎng)與試劑
[0026]HEK293T和HepG2細(xì)胞從中國(guó)科學(xué)院(CAS，上海，中國(guó))的典型培養(yǎng)物保藏的細(xì)胞庫(kù)購(gòu)買(mǎi)。細(xì)胞培養(yǎng)在Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基中，補(bǔ)充有10%胎牛血清(Gibco公司，中國(guó)上海)，100IU/ml青霉素(Gibco公司)和100mg/ml鏈霉素(Gibco)。小鼠原代肝細(xì)胞是從8-10周齡的C57BL/6小鼠中使用膠原酶灌注并通過(guò)離心進(jìn)行純化制備得到。合成LXRa激動(dòng)劑T0901317購(gòu)自Sigma-Aldrich公司(Sigma公司，圣路易斯，MO，美國(guó))。
[0027]腺病毒，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和熒光素酶報(bào)告基因分析
[0028]腺病毒表達(dá)鼠Menin通過(guò)Invitrogen公司(上海，中國(guó))的與全長(zhǎng)Menin互補(bǔ)DNA(cDNA)的編碼序列獲得。小鼠的SREBP-1c的啟動(dòng)子克隆到PGL4.15質(zhì)粒(Promega公司，威斯康星州，美國(guó))中。所有通過(guò)脂質(zhì)體Lipofectamine2000 (Invitrogen)進(jìn)行的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染按制造商的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，具體實(shí)驗(yàn)步驟如下:
[0029]1.準(zhǔn)備細(xì)胞:
[0030]貼壁細(xì)胞:轉(zhuǎn)染前24hrs，在500 μ L無(wú)抗完全培養(yǎng)基中接種0.5-2X105個(gè)細(xì)胞，轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞融合度為80-90%。(注:鋪板時(shí)要將細(xì)胞消化完全混勻，避免細(xì)胞堆積生長(zhǎng)。)
[0031]2.對(duì)于每個(gè)轉(zhuǎn)染樣品，按下面的方法準(zhǔn)備:
[0032]I)用 50 μ L Opt1-MEM(來(lái)自 Life Technologies)稀釋 0.8 μ g 質(zhì)粒 DNA,輕輕吹吸3-5次混勻。
[0033]2)輕輕顛倒混勻轉(zhuǎn)染試劑，用50 μ L Opt1-MEM稀釋2.0 μ LLipofectamine?(購(gòu)自 invitrogen 公司)
[0034]2000,輕輕吹吸3-5次混勻，室溫下靜置5min。
[0035]3)混合轉(zhuǎn)染試劑和質(zhì)粒DNA稀釋液，輕輕吹吸3_5次混勻，室溫下靜置20min，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。
[0036]4)轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到24孔細(xì)胞板中，100 μ L/孔，前后輕搖細(xì)胞板混合均勻。
[0037]5)將細(xì)胞板置于37°C、5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18_48小時(shí)。轉(zhuǎn)染4_6小時(shí)后可換新鮮培養(yǎng)基。
[0038]對(duì)熒光素酶報(bào)告基因的分析中，將H印G2細(xì)胞接種在24孔板中，并共轉(zhuǎn)染200ng的SREBP-1c的啟動(dòng)子的質(zhì)粒和Menin表達(dá)質(zhì)?；蚩蛰d體(EV)共轉(zhuǎn)染的具體實(shí)驗(yàn)步驟同上。在轉(zhuǎn)染后36小時(shí)收獲細(xì)胞。采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)(Promega，USA)對(duì)熒光素酶活性進(jìn)行測(cè)定。
[0039]RNA提取和實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析
[0040]使用TRIzol試劑(Invitrogen,上海，中國(guó))從細(xì)胞的中提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄使用Takara RNA PCR試劑盒(Takara,大連，中國(guó))按照制造商的說(shuō)明進(jìn)行,具體步驟如下:
[0041]1.RNA 的抽提
[0042]I)收細(xì)胞，加入Iml的TRIzoI試劑裂解，然后加入0.2ml的氯仿，蓋緊管蓋。手動(dòng)劇烈振蕩管體15秒后，15到30°C孵育2到3分鐘。4°C下12000rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相，中間層以及無(wú)色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時(shí)加入的TRIzol試劑的60%。
[0043]2) RNA沉淀將水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈無(wú)RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA，混勻后15到30°C孵育10分鐘后，于4°C下12000rpm離心10分鐘。此時(shí)離心前不可見(jiàn)的RNA沉淀將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊。
[0044]3)1?仏清洗移去上清液，每11111了1?1201試劑裂解的樣品中加入至少I(mǎi)ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH20配制)，清洗RNA沉淀。混勻后，4°C下7000rpm離心5分鐘。
[0045]4) RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5_10分鐘。
[0046]5)溶解RNA沉淀溶解RNA時(shí)，先加入無(wú)RNA酶的水40 μ I用槍反復(fù)吹打幾次，使其完全溶解，獲得的RNA溶液保存于_80°C待用。
[0047]2熒光定量PCR
[0048]I)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA
[0049]2)配置實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系
[0050]SYBR Green I 染料 10 μ I
[0051]上游引物Ιμ?
[0052]下游引物Ιμ?
[0053]dNTP I μ I
[0054]Taq 聚合酶 2 μ I
[0055]cDNA 5 μ I
[0056]3)將配制好的PCR反應(yīng)溶液置于Real time PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件為:93°C 2分鐘預(yù)變性，然后按93°C I分鐘，55°C I分鐘，72°C I分鐘，共40做個(gè)循環(huán)，最后72°C 7分鐘延伸。
[0057]為了定量目的基因的轉(zhuǎn)錄，在ABI7500儀(ABI，CA，USA)上使用SYBR Green預(yù)混物Ex Taq (Takara公司)進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。36B4的表達(dá)被用作內(nèi)部對(duì)照。
[0058]Western 雜交
[0059]步驟如下:
[0060]1.細(xì)胞在放射免疫沉淀(RIPA)緩沖液中進(jìn)行裂解，緩沖液含有50mM的Tris-鹽酸，150MM 的 NaCl，5mM 的氯化鎂，2mM 的 EDTA，ImM 的氟化鈉，I % NP40 和 0.1 % SDS。
[0061]2.在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。100°C水浴加熱3-5分鐘，以充分變性蛋白。
[0062]3.冷卻到室溫后，把蛋白樣品直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)。
[0063]4.電泳結(jié)束后將膠條割至合適大小，用轉(zhuǎn)膜緩沖液平衡，5minX3次。轉(zhuǎn)膜裝置從下至上依次按陽(yáng)極碳板、濾紙、硝酸纖維素膜、凝膠、濾紙、陰極碳板的順序放好，濾紙、凝膠、硝酸纖維素膜精確對(duì)齊，每一步去除氣泡，接通電源，恒流轉(zhuǎn)移1.5hr。
[0064]5.轉(zhuǎn)膜完畢后，用5%脫脂牛奶的PBS封閉后，將膜用抗體標(biāo)記，隨后加入辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)二抗。使用了以下抗體:抗Menin (Santa Cruz公司，加利福尼亞州，美國(guó))，抗LXRa (Santa Cruz公司)，抗Flag (Abeam公司，馬薩諸塞州，美國(guó))，抗HA (Santa Cruz公司)，抗GAPDH (Abeam公司)。GAPDH蛋白質(zhì)被用作上樣對(duì)照。
[0065]6.通過(guò)化學(xué)發(fā)光底物試劑盒(Millipore公司，比爾里卡，MA)檢測(cè)信號(hào)。
[0066]免疫共沉淀反應(yīng)
[0067]具體步驟如下:
[0068]1.HEK293T細(xì)胞用Flag-Menin或HA-LXRa轉(zhuǎn)染48小時(shí)，可收獲細(xì)胞，加入適量細(xì)胞裂解緩沖液(此緩沖液是含有50mM的pH為7.5的Tris_HCl，150mM的氯化鈉，0.5%的Nonidet P40，和蛋白酶抑制劑的混合物)，冰上裂解30min，細(xì)胞裂解液于4°C，最大轉(zhuǎn)速離心30min后取上清；
[0069]2.取少量裂解液以備Western blot分析,剩余裂解液加I μ g相應(yīng)的抗體加入到細(xì)胞裂解液，4°C緩慢搖晃孵育過(guò)夜；
[0070]3.取10μ1 protein A瓊脂糖珠,用適量裂解緩沖液洗3次,每次3000rpm離心3min ；
[0071]4.將預(yù)處理過(guò)的10 μ I protein A瓊脂糖珠加入到和抗體孵育過(guò)夜的細(xì)胞裂解液中4°C緩慢搖晃孵育2-4h，使抗體與protein A瓊脂糖珠偶連；
[0072]5.免疫沉淀反應(yīng)后，在4°C以3，OOOrpm速度離心3min，將瓊脂糖珠離心至管底；將上清小心吸去，瓊脂糖珠用Iml裂解緩沖液洗3 — 4次；最后加入15