一株粘質(zhì)沙雷氏菌及其在抑制腫瘤中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一株粘質(zhì)沙雷氏菌，及其在抑制腫瘤中的應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] WHO《全球癌癥報告2014》數(shù)據(jù)顯示，2012年全球癌癥患者和死亡病例都在增加，新 增病例近一半出現(xiàn)在亞洲，其中大部分在中國、印度。在肝、食道、胃和肺等4種惡性腫瘤中， 中國新增病例和死亡人數(shù)均居世界首位。手術(shù)治療有效，但多數(shù)患者就診時已經(jīng)錯過手術(shù) 時機，只能依賴化療、放療，療效不佳。尋找新機制的治療方法是領(lǐng)域內(nèi)不懈的追求。二十世 紀(jì)八十年代，有人發(fā)現(xiàn)細(xì)菌感染者的皮膚癌、淋己癌和白血病患病幾率較低，且發(fā)現(xiàn)運些細(xì) 菌注入動物體內(nèi)會導(dǎo)致腫瘤萎縮，從此細(xì)菌及其產(chǎn)物治療腫瘤成為熱口課題之一。
[0003] 沙雷氏菌是眾多具有抑瘤效果的細(xì)菌之一。有關(guān)沙雷氏菌治療惡性腫瘤實驗研究 和臨床研究均不乏報道，1997年斬小青等發(fā)現(xiàn)粘質(zhì)沙雷氏菌S311抑制小鼠艾氏腹水癌，小 鼠 P388白血病，小鼠 B16黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移和小鼠 Lewis肺癌腫瘤細(xì)胞;2003年斬小青采用小 鼠模型研究粘質(zhì)沙雷氏菌苗的抑制腫瘤的效果，提示腹腔注射可明顯抑制小鼠 HCA的原發(fā) 灶和轉(zhuǎn)移灶、抑制腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。1993年化vas HF首先將粘質(zhì)沙雷氏菌復(fù)方制劑用至臨 床11例難治性惡性腫瘤，發(fā)現(xiàn)1例輕微反應(yīng)，1例部分反應(yīng)，4例病情暫時穩(wěn)定，5例病情進(jìn)展， 其中一例艾滋病Kaposi's肉瘤患者病情得到改善。有關(guān)粘質(zhì)沙雷氏菌治療腫瘤的報道資料 國內(nèi)多于國外，1999年徐永茂等通過胸、腹腔內(nèi)注射觀察了粘質(zhì)沙雷氏菌S311的療效，發(fā)現(xiàn) 在5例癌性胸水患者中4例完全緩解，在9例癌性腹水患者中5例完全緩解。2000年顧建慶將 粘質(zhì)沙雷氏菌S311制劑進(jìn)行了 I期臨床試驗，結(jié)果提示制劑對胸水有效。2000年張巧平臨床 資料報道粘質(zhì)沙雷氏菌S311制劑對惡性胸腔積液有效率為88.6%，完全緩解率48.6%，尤 其對少、中量積液療效較好。2001年朱允中在n臨床試驗中對241惡性胸水做了觀察，總有 效率92.1 %，且部分胸水癌細(xì)胞轉(zhuǎn)陰。2002年茅國新報道粘質(zhì)沙雷氏菌制劑控制癌性胸腔 積液有效率達(dá)90.6 %，生活質(zhì)量改善率為84.4%，0.5年、1年、1.5年生存率分別是:93.8%、 62.5 %、40.6%，毒副反應(yīng)為胸痛（18.8 % )和發(fā)熱（15.6 % )。2007年王慶蓉對18例腦神經(jīng)膠 質(zhì)細(xì)胞瘤術(shù)后患者進(jìn)行觀察，采用化療囊瘤內(nèi)注射，發(fā)現(xiàn)1、2、4年的生存率分別為72.2%、 55.68 %、55.68%，高于對照組。2002年何曉文采用改良端粒重復(fù)序列擴增(TRAP)-銀染方 法檢測20例膀脫移行上皮細(xì)胞癌腫瘤組織粘質(zhì)沙雷氏菌制劑灌注前后的端粒酶活性，發(fā)現(xiàn) 粘質(zhì)沙雷氏菌制劑可使腫瘤組織端粒酶活性降低。
[0004] 有關(guān)沙雷氏菌的抑瘤現(xiàn)象已被諸多實驗資料證實，但是其療效機制至今研究不 明；綜合諸多資料，其抑瘤機制可歸納為兩個主要途徑，抑瘤機制之一是粘質(zhì)沙雷氏菌胞壁 含有多種對腫瘤細(xì)胞直接細(xì)胞毒活性，具有直接殺傷腫瘤細(xì)胞的作用，比如1994年趙虎等 人發(fā)現(xiàn)粘質(zhì)沙雷氏菌能夠直接殺傷體外培養(yǎng)的SMMC-7721細(xì)胞株、HeLa細(xì)胞株、KM3細(xì)胞株、 SO肉瘤細(xì)胞株等腫瘤細(xì)胞，對正常組織細(xì)胞無明顯的影響作用。還有些人認(rèn)為粘質(zhì)沙雷氏 菌抑制腫瘤的療效與其在28°C產(chǎn)生的靈菌紅素有關(guān)，且進(jìn)行了提純，新合成的PG衍生物 GX15-070,作為多種癌癥的治療藥物，已進(jìn)入臨床n期研究。根據(jù)NIC公布的數(shù)據(jù)，靈菌紅素 對人60個常見癌細(xì)胞株的平均IC50值約為2.化M，靈菌紅素NSC編號為47147-F。抑瘤機制之 二則認(rèn)為粘質(zhì)沙雷氏菌的抑瘤效果與免疫調(diào)節(jié)機制有關(guān)。資料提示，粘質(zhì)沙雷氏菌制劑具 有巨隧細(xì)胞及T淋己系統(tǒng)刺激活性，可誘導(dǎo)巨隧細(xì)胞吞隧功能增強和分泌腫瘤壞死因子 (TNF)、干擾素（IFN)、白介素I(IL-I)及IL-2等免疫因子，可增強NK細(xì)胞殺傷活性，可抑制腫 瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因nm23-l和Tiam-I的表達(dá)。比如粘質(zhì)沙雷氏菌DNA含有的乂 pG結(jié)構(gòu)"，具有強 大的免疫調(diào)節(jié)作用，能活化NK細(xì)胞、巨隧細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等抗原提呈細(xì)胞，使之產(chǎn)生IFN 和IL-12等化1細(xì)胞因子，從而抑制化2細(xì)胞因子化-4、比-5的產(chǎn)生，并阻斷I巧的合成，從而 有效抑制反應(yīng)原誘導(dǎo)的高反應(yīng)性及變態(tài)反應(yīng)性改變，改善免疫功能的素亂。同時粘質(zhì)沙雷 氏菌可W提高外周血及局部灌注周圍組織的T細(xì)胞亞群的功能，CD4+和CD8+細(xì)胞增加，改善 機體免疫功能低下，激活免疫系統(tǒng)，糾正細(xì)胞免疫及體液免疫的異常，從而促進(jìn)疾病的恢 復(fù)。
[0005] 總之，對于粘質(zhì)沙雷氏菌，前人雖然已做了許多研究，也公開過多個專利資料，但 終因療效不夠突出至今沒有發(fā)展成真正的臨床藥物，一直停留在實驗室研究階段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對上述現(xiàn)有技術(shù)，為了獲得更加突出的抑瘤效果的沙雷氏菌，本發(fā)明對引自中 國菌種庫的沙雷氏菌進(jìn)行了紫外誘變，并采用抑瘤實驗、觀察抑瘤效果，篩選獲得了一株對 A549實體瘤和S180腹水瘤療效非常突出的粘質(zhì)沙雷氏突變菌株，而且療效是在不產(chǎn)生靈菌 紅素的情況下產(chǎn)生的。經(jīng)16S rDNA測序、比對，確定所篩選菌株為粘質(zhì)沙雷氏菌。
[0007] 本發(fā)明是通過W下技術(shù)方案實現(xiàn)的：
[000引一株粘質(zhì)沙雷氏菌，該菌株分類命名為沙雷氏菌Serratia SP.，已于2016年Ol月 11日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、，保藏編號為CGMCC NO.11987。
[0009] 所述粘質(zhì)沙雷氏菌的16S rDNA序列，經(jīng)與Genbank中其它菌的16S rDNA序列相比 對，此菌株與Genbank中Serratia SP.CH-B17同源性為99.79% ;與Serratiasp.E化4相似率 99.78% ,Serratia marcescens strainTCCC11387相似率99.77% ,Serratia marcescens 8付日;[]141]1209相似率99.76%，56祥日1:13 1]1日1'。63。6]13 8化日;[]1沈1?1相似率99.437%，運些 菌株同屬于粘質(zhì)沙雷氏菌。
[0010] 所述粘質(zhì)沙雷氏菌，經(jīng)實驗證明，對A549實體瘤和S180腹水瘤的抑制效果明顯，療 效非常突出，因此，可W W該粘質(zhì)沙雷氏菌為原料制備用于抑制腫瘤的藥物，比如:培養(yǎng)該 菌獲得培養(yǎng)物，并添加或不添加其它藥物、輔料等加工制備成菌劑。本發(fā)明為研究沙雷氏菌 的抑制腫瘤機制、用途、藥物開發(fā)等提供了優(yōu)良的菌種資源。
【附圖說明】
[0011] 一株粘質(zhì)沙雷氏菌SM-1，該菌株分類命名為沙雷氏菌Serratia SP.，已于2016年 Ol月11日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、，保藏編號為CGMCC NO. 11987，保藏地址為:北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，郵編：100101。
[001 ^ 圖1:正常對照組動物腹腔洗液涂片（200 X )。
[0013]圖2:正常對照組動物腹腔洗液涂片(400 X )。
[0014] 圖3:模型組動物腹水涂片(200 X )。
[0015] 圖4:模型組動物腹水涂片(400 X )。
[0016] 圖5:多西他賽對照組動物腹水涂片(200X )。
[0017] 圖6:多西他賽對照組動物腹水涂片(400X )。
[001引圖7: A群鏈球菌對照組動物腹水涂片(200 X )。
[0019] 圖8:4群鏈球菌對照組動物腹水涂片（400乂）。
[0020] 圖9: SMl組組動物腹水涂片(200 X )。
[0021] 圖10: SMl組動物腹水涂片(400 X )。
[0022] 圖11:模型對照組長出腫瘤的小鼠圖。
[0023] 圖12:模型組死亡的小鼠。
[0024] 圖13:接種A549細(xì)胞各組小鼠的腫瘤照片，其中，A為模型對照組，B為多西他賽治 療組，C為A群鏈球菌治療組，D為SM3組，E為SMl，F(xiàn)為SM5組。
[00巧]圖14:實驗組脾臟組織增大。
[00%]圖15:進(jìn)化樹示意圖。
【具體實施方式】
[0027] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
[0028] 下述實施例中所設(shè)及的儀器、試劑、材料等，若無特別說明，均為現(xiàn)有技術(shù)中已有 的常規(guī)儀器、試劑、材料等，可通過正規(guī)商業(yè)途徑獲得。下述實施例中所設(shè)及的實驗方法，檢 測方法等，若無特別說明，均為現(xiàn)有技術(shù)中已有的常規(guī)實驗方法，檢測方法等。
[0029] 實施例1菌種誘變
[0030] ( - )菌種誘變方法
[0031] 1.菌種擴增
[0032] 菌種源自中國普通微生物菌種保藏管理中屯、保藏的粘質(zhì)沙雷氏菌，保藏號： CGMCC1.0589。無菌條件下，取原菌種10倍梯度稀釋后分別涂布在LB斜面培養(yǎng)基上37°C培養(yǎng) 2地。選擇菌落數(shù)目約為20個的平板，挑取較大、界限清晰、呈乳白色長勢良好的單菌落作為 紫外誘變的出發(fā)菌株，取其菌體于生理鹽水和玻璃珠的S角瓶中制成無菌菌懸液SOOmL，30 °C、250巧m水浴地，制備成IO 6CFlVmL的誘變菌懸液，備用。
[0033] 2.菌株誘變
[0034] 紫外燈預(yù)熱25min，分別取菌懸液IOmL置于多個平板(D = 9cm)中，均勻放置紫外燈 下25cm處照射不同的時間（0，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60s )，然后分別從每個平 板中取出ImL的菌懸液W生理鹽水定容至IOmL,逐級稀釋至1〇-1、1〇-2、1〇- 3、1〇-4、1〇-5、1〇-6 倍，取各個梯度的稀釋液10化L在暗處涂布于平板固體培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)2地;取出，挑取 長勢良好的菌落，試管斜面固體培養(yǎng)基保存，進(jìn)行高產(chǎn)菌株的篩選。同時，用未照射的菌懸 液做空白對照，計算紫外誘變致死率。
[0035] 致死率=紫外誘變菌懸液的菌落數(shù)/未誘變菌懸液的菌落數(shù)。
[0036] 3.菌株選擇一一根據(jù)細(xì)菌生長狀況選擇
[0037] 3.1.平板初篩
[003引根據(jù)紫外誘變選取照射30s的誘變菌懸液生理鹽水稀釋至10-1、10-2、10- 3、10-4、10 4、1(T6倍，分別涂布于平板固體培養(yǎng)基，37°c培養(yǎng)24h。^菌落大小和生長狀態(tài)為觀測指標(biāo) 選取單菌落35株，試管斜面?zhèn)鞔?次后，穩(wěn)定生長的共6株，分別命名為SMl~6。
[0039] 3.2.搖瓶復(fù)篩
[0040] ①菌種：SMl、SM2、SM3、SM4、SM5、SM6。
[0041 ]②方法步驟:將上述菌株與出發(fā)菌株SMO分別采用10 %的接種量置于裝有LB液體 培養(yǎng)基的S角瓶(25mL/100mL)中、37°C培養(yǎng)2化，搖床