一種多肽疫苗的水合鹽及其制備方法和含有該鹽的藥物制品的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬于制藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種多肽化合物及其制備方法，特別是涉及KIFGSLAFL三氟乙酸水合鹽及其制備方法和含有該鹽的藥物制品。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
一種多肽疫苗的水合鹽及其制備方法和含有該鹽的藥物制品
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于制藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種多肽化合物及其制備方法，特別是涉及 KIFGSLAFL三氟乙酸水合鹽及其制備方法和含有該鹽的藥物制品。
【背景技術(shù)】
[0002] 乳腺癌(BCa)是女性最常見(jiàn)的癌癥診斷并且是女性中與癌癥相關(guān)死亡的第二主導(dǎo) 因素（RiesLAG等人，SEER Cancer Statistics Review，1975_2003，National Cancer Institute，BetheSda，MD)。過(guò)去20年間在乳腺癌治療中的主要進(jìn)展使得無(wú)疾病生存(DFS) 率顯著提高。例如，已經(jīng)將利用對(duì)腫瘤相關(guān)抗原有反應(yīng)性的抗體療法用于阻斷特定的細(xì)胞 過(guò)程以減緩疾病進(jìn)展或者預(yù)防疾病復(fù)發(fā)。盡管近來(lái)在乳腺癌治療上有所進(jìn)展，但是相當(dāng)數(shù) 量的患者最終將死于復(fù)發(fā)疾病。因此，需要預(yù)防或者減緩或者抑制復(fù)發(fā)疾病的發(fā)生的治療。
[0003] 疫苗由于易于給藥，以及因?yàn)樗麄冊(cè)诟腥拘约膊≈杏^察到的高成功率而是對(duì)此種 治療和預(yù)防引人注意的模型。構(gòu)建癌癥疫苗的基本原理在理論上是直接的。然而實(shí)踐中，有 效的實(shí)體瘤癌癥疫苗的開(kāi)發(fā)僅存有限的成功。
[0004] KIFGSLAFL (氨基酸序列組成為L(zhǎng)ys-Il e-Phe-Gly-Ser-Leu-Ala-Phe-Leu 的九肽， 也稱(chēng)之為HER2/neu 369-377)是HER2/neu原癌基因家族的肽序列，具有細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞 (CTL)應(yīng)答作用，預(yù)用于預(yù)防和/或治療癌癥的疫苗，目前正在相關(guān)的用于臨床實(shí)驗(yàn)研究 (Zaks T等人，Immunization with a peptide epitope(369-377)from HER-2/neu leads to peptide specific cytotoxic T lymphocytes that fail to recognize HER-2/neu+ tumors , Cancer Research ,1998,58(21)： 4902-8； Knutson KL 等人，Immunization of cancer patients with HER-2/neu，HLA_A2peptide，p369-377，fesults in short-lived peptide-specific immunity, Cl in Cancer Res 2002,8(5):1014-1018。
[0005] 然而，現(xiàn)有技術(shù)公開(kāi)的臨床試驗(yàn)使用的KIFGSLAFL樣品是DMS0溶液狀態(tài)，在室溫下 穩(wěn)定性差，需要在-20°C低溫保存，使用前再解凍。至今未見(jiàn)該多肽室溫穩(wěn)定的化合物或混 合物報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的之一在于提供KIFGSLAFL三氟乙酸水合鹽，大幅改善原料純度、吸潮 性、水溶性和穩(wěn)定性。
[0007] 其中，所述KIFGSLAFL是指氨基酸序列為以下組成的九肽：
[0008] Lys-Ile-Phe-Gly-Ser-Leu-Ala-Phe-Leu
[0009] 1 5 9
[0010] 也稱(chēng)之為HER2/neu 369-377。
[0011] 所述KIFGSLAFL三氟乙酸水合鹽分子式為CmHysNkjOu · nTFA · XH2O,其中n=卜2，x =1-4，了?4代表三氟乙酸。（其中，優(yōu)選11 = 1，1.5或2;優(yōu)選1=1-2，特別是1 = 1，1.5或2)。所 述的三氟乙酸是指分子式為F3CC00H的酸。
[0012]上述KIFGSLAFL三氟乙酸水合鹽通過(guò)本發(fā)明的優(yōu)選方法制備得到，具有非常高的 藥用純度，純度2 95%，還可進(jìn)一步優(yōu)選達(dá)到2 98%，特別優(yōu)選純度2 99%。對(duì)于保證藥物 的有效性和安全性具有重要意義，具有良好的商業(yè)開(kāi)發(fā)價(jià)值。
[0013] 上述KIFGSLAFL三氟乙酸水合鹽的吸濕性能與X值大小有關(guān)。當(dāng)X小于1，如x = 0或 者0.5時(shí)，樣品能迅速?gòu)母稍锟諝?例如RH35% )中吸收水分，使X含量明顯增加，這樣為樣品 的轉(zhuǎn)移和準(zhǔn)確稱(chēng)量帶來(lái)不便。當(dāng)x=l-4之間時(shí)，樣品的吸濕速度明顯慢得多，暴露在常規(guī)的 干燥環(huán)境中（如RH50%)短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)移和稱(chēng)量無(wú)須額外的濕度控制措施。而且，為了制 備X小于0.5的樣品，往往需要更高的干燥溫度和更長(zhǎng)的干燥時(shí)間，導(dǎo)致樣品的雜質(zhì)偏高。當(dāng) X大于4,例如x = 5時(shí)，樣品在長(zhǎng)期常溫保存時(shí)，雜質(zhì)增加較x = l-4的樣品明顯要大一些。
[0014] 因合成KIFGSLAFL過(guò)程中產(chǎn)生數(shù)量眾多的雜質(zhì)，使制備高純度的KIFGSLAFL鹽存在 明顯的技術(shù)難度，難以得到高純度的單鹽純品。
[0015] 本發(fā)明通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)優(yōu)選得到的制備KIFGSLAFL三氟乙酸水合鹽的方法，包括以 下步驟：
[0016] (1)、KIFGSLAFL 粗品的制備
[0017]采用Fmoc固相合成方法，按照氨基酸序列(9-1)的順序，合成制備KIFGSLAFL肽樹(shù) 月旨，然后經(jīng)三氟乙酸裂解，得到KIFGSLAFL粗品，具體包括以下步驟：
[0018] (1.1)、以連接有Fmoc-Leu-ΟΗ的酸性敏感樹(shù)脂（如Wang樹(shù)脂或者2-氯-三苯甲基-樹(shù)脂)為原料，與哌啶溶液反應(yīng)，脫去Fmoc保護(hù)基，溶劑洗滌后得到Leu-樹(shù)脂。
[0019] (1.2)、按照固相多肽合成的方法，Leu-樹(shù)脂依次與Fmoc保護(hù)的氨基酸反應(yīng)，獲得 九肽KIFGSLAFL-樹(shù)脂。期間依次使用常用的縮合劑進(jìn)行接肽反應(yīng)，經(jīng)溶劑洗滌后用哌啶溶 液脫去Fmoc保護(hù)基，經(jīng)溶劑洗滌后再進(jìn)行下一個(gè)Fmoc保護(hù)的氨基酸的縮合。
[0020] 與Leu-樹(shù)脂進(jìn)一步縮合反應(yīng)的Fmoc保護(hù)的氨基酸依次為：？111〇(3-?116-0!1、？111〇(3-Ala-〇H、Fmoc-Leu-〇H、Fmoc-Ser(tBu)-〇H、Fmoc-Gly-〇H、Fmoc-Phe-〇H、Fmoc-Ile-〇H、Fmoc-Lys(Boc)-〇H〇
[0021] 縮合劑優(yōu)選包括擬1'1]、邢1'1]、80?、？780?、01(：/!108丨、01(：/!1(^七等。
[0022] (1.3)、用三氟乙酸裂解溶液處理KIFGSLAFL-樹(shù)脂，得到KIFGSLAFL的三氟乙酸溶 液。加入乙醚析出沉淀，經(jīng)離心和乙醚洗滌后得到KIFGSLAFL粗品。
[0023]三氟乙酸裂解溶液是指含有50-95% (v/v)的三氟乙酸，其余為二氯甲烷，或可進(jìn) 一步加入1-10% (ν/V)的水、苯酚、對(duì)甲基酚、苯甲醚、苯甲硫醚、1，2_乙二硫醇、三異丙基硅 烷(TIS)等碳正離子俘獲試劑。
[0024] (2)、KIFGSLAFL 的純化
[0025] 將步驟（1)制備得到的KIFGSLAFL粗品溶解乙腈和水的混合溶液中，過(guò)濾，濾液用 反相高效液相色譜純化，得純品的乙腈/水溶液。
[0026]反相高效液相色譜的純化條件優(yōu)選C4、C8、C18烷基鍵合硅膠為固定相，進(jìn)一步優(yōu) 選C18烷基鍵合硅膠;柱溫優(yōu)選20-35°C，進(jìn)一步優(yōu)選25-30°C ;流動(dòng)相為含有三氟乙酸的乙 腈/水溶液，其中三氟乙酸濃度為〇. 02 % -0.5 % (v/v)，優(yōu)選0.05 % -0.2 % (v/v)。流動(dòng)相中 乙腈的體積百分比優(yōu)選10 %至80 %，由低濃度向高濃度梯度洗脫，進(jìn)一步優(yōu)選從20 %至 50% 〇
[0027] (3)、脫酸(成一三氟乙酸水合鹽）
[0028] 將上述步驟(2)制得的KIFGSLAFL純品溶液用乙腈/水溶液為流動(dòng)相的反相高效液 相色譜處理，得到KIFGSLAFL-三氟乙酸水合鹽溶液。
[0029] 脫酸條件采用的反相高效液相色譜優(yōu)選C4、C8、C18烷基鍵合硅膠為固定相，進(jìn)一 步優(yōu)選C18烷基鍵合硅膠;柱溫優(yōu)選20-35°C，進(jìn)一步優(yōu)選25-30°C;流動(dòng)相為乙腈/水溶液， 流動(dòng)相中乙腈的體積百分比優(yōu)選2%至80%，由低濃度向高濃度梯度洗脫，進(jìn)一步優(yōu)選先用 2%至4%等度或梯度洗脫至少一個(gè)柱體積，再用20%至50%由低到高梯度洗脫。
[0030] (4)、去除溶劑得到KIFGSLAFL三氟乙酸水合鹽固體。
[0031] 將上述步驟（2)制得的KIFGSLAFL三氟乙酸水合鹽溶液減壓濃縮和干燥，得到 KIFGSLAFL · 2TFA固體。
[0032] 將上述步驟（3)制得的KIFGSLAFL三氟乙酸水合鹽溶液減壓濃縮和干燥，得到 KIFGSLAFL · TFA固體。
[0033] 將上述步驟(2)和（3)制得的KIFGSLAFL三氟乙酸水合鹽溶液按照不同比例混合， 然后減壓濃縮和干燥，得到KIFGSLAFL · nTFA(l < η < 2)固體。
[0034] 通過(guò)控制后期干燥溫度和時(shí)間，得到不同χ值的產(chǎn)品。其中后期干燥溫度為30-60 °C，優(yōu)選40-50°C。干燥時(shí)間通過(guò)檢測(cè)樣品的含水量來(lái)確定?？梢允褂每?費(fèi)休等水分測(cè)定 法確定含水量。
[0035] 其中，n = 2的水合鹽，可通過(guò)上述方法去除步驟(3)而直接進(jìn)行步驟(4)制備得到。 [0036]本發(fā)明的另一目的之一在于所提供KIFGSLAFL三氟乙酸水合鹽為無(wú)定形固體，其 X-射線衍射譜圖無(wú)晶體特征的吸收峰。
[0037]例如當(dāng)η = 2，χ = 1時(shí)的水合鹽的X-射線衍射譜圖如圖1所示，無(wú)晶體特征的吸收 峰。
[0038]與游離肽相比，無(wú)定形固體的KIFGSLAFL三氟乙酸水合鹽可明顯提高水溶性和穩(wěn) 定性，更易于藥物的制劑，特別是注射給藥制劑的使用。
[0039]其中，X-射線衍射譜圖通過(guò)采用如下方法檢測(cè)得到，儀器型號(hào):銳影(EmpyrearOX-射線衍射儀;測(cè)試條件:Cu靶Κα?射線，電壓40kv，電流40mA，2Θ范圍3° -50°，發(fā)散狹縫1/32°， 防散射狹縫1/16°，防散射狹縫7.5mm，步長(zhǎng)0.02°，每步停留時(shí)間40S。
[0040] 當(dāng)n = 1，x = 1時(shí)，即KIFGSLAFL-三氟乙酸一水合鹽無(wú)定形固體，其采用KBr壓片法 IR光譜檢測(cè)條件檢測(cè)，其紅外吸收如圖2所示，在3281 cm-1、3089cm-1、2960cm-1、2928cm-l、、 1630cm-1、153 lcm-1、1402cm-1、1204cm-1、1140cm- 1、722cm-1 和 700cm-1 處有峰（誤差允許 ± 2cm 4)。當(dāng)x從1增加至4時(shí)，上述特征吸收基本不變，只觀察到3400-3500(31^1左右的寬大的"形 似面包峰"變大。
[0041 ] 當(dāng)n = 2, x=l時(shí)，即KIFGSLAFL二三氟乙酸一水合鹽無(wú)定形固體，其采用KBr壓片法 IR光譜檢測(cè)條件檢測(cè)，其紅外吸收如圖3所示，在3292cm-\3087cm-^2962011^1641011^ 1531cm-\ 1203cm-\ 1139cm-\722cm-1和 700cm-1處有峰（誤差允許 ± 2cm-4。當(dāng) χ從 1 增加至4 時(shí)，上述特征吸收基本不變，只觀察到3400-3500〇1^左右的寬大的"形似面包峰"變大。
[0042]對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，前述紅外吸收的誤差允許指的是采用相應(yīng)方法得 到的同晶型樣品采用相同的儀器和檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，吸收峰誤差通常在所述范圍以 內(nèi)，并且，當(dāng)大部分吸收峰，如超過(guò)80%以上的吸收峰誤差在此范圍內(nèi)，而偶然有個(gè)別少數(shù) 的吸收峰的誤差超出該范圍，均應(yīng)認(rèn)為屬于相同的紅外吸收峰譜圖，紅外光譜所對(duì)對(duì)應(yīng)的 物質(zhì)相同。
[0043] 所述的KIFGSLAFL-三氟乙酸水合鹽和KIFGSLAFL二三氟乙酸水合鹽無(wú)定形固體 采用ESI質(zhì)譜檢測(cè)，結(jié)果如圖4和圖5所示，其分子離子峰為995.6，符合KIFGSLAFL的分子量 計(jì)算值。
[0044] 將KIFGSLAFL三氟乙酸水合鹽無(wú)定形固體用乙腈和水(體積比=5:95)混合溶液溶 解，采用以下高效液相色譜檢測(cè)條件分析:C18鍵合硅膠(250 X 4.6mm，5μπι)為固定相，流動(dòng) 相Α為乙腈，流動(dòng)相Β為0. lmo 1/L磷酸二氫鈉(磷酸調(diào)pH至3.0)水溶液，梯度洗脫(流動(dòng)相Α從 5%到45%，洗脫時(shí)間20min;然后改流動(dòng)相A45%等度洗脫），流速lmL/min。檢測(cè)波長(zhǎng)195nm (0-8min)和220nm(8-25min)。三氟乙酸和目標(biāo)肽KIFGSLAFL的出峰時(shí)間分別約為4.8min和 20min〇
[0045]本發(fā)明的再一目的在于提供一種多肽疫苗的藥物制品，包含前述的KIFGSLAFL三 氟乙酸水合鹽，它適宜用藥學(xué)上可接受的溶媒重新配制為一種可注射的藥用產(chǎn)品，通過(guò)注 射途徑給予患者。所述藥學(xué)上可接受的溶媒包括注射用水、無(wú)菌水、無(wú)菌生理鹽水和無(wú)菌葡 萄糖的水溶液等。
[0046]因本發(fā)明的KIFGSLAFL三氟乙酸水合鹽，特別是其無(wú)定形固體具有良好的純度和 穩(wěn)定性，以及優(yōu)越的水溶性，極大的提高了該藥物制品的用藥有效性和安全性。
[0047] 所述藥物制品可以含有或者不含有一種以上的可藥用的賦形劑。本發(fā)明的藥物制 品可以是非胃腸道給藥的任何粉末形式，例如凍干粉末、混懸型、乳制品注射劑等。
[0048] 所述藥物制品可優(yōu)選用于預(yù)防和治療乳腺癌及乳腺癌復(fù)發(fā)。
[0049]本發(fā)明中的KIFGSLAFL三氟乙酸水合鹽，除有特別指定外，均是指分子式為 CsoHTsNwOn · nTFA · χΗ20(η =卜2，x =卜4)的KIFGSLAFL三氟乙酸水合鹽。
[0050]本發(fā)明各試劑的縮寫(xiě)為如下定義：
[0052]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下突出的優(yōu)點(diǎn)及有益效果：
[0053] 1、本發(fā)明提供的KIFGSLAFL三氟乙酸水合鹽，相對(duì)于KIFGSLAFL堿、KIFGSLAFL硫酸 鹽極大地提高藥物純度、水溶性和優(yōu)良的抗吸潮性，充分保證藥用安全和有效性。其中水分 子相對(duì)于肽的摩爾比例為1-4時(shí)，進(jìn)一步表現(xiàn)出更好的抗吸潮性和化學(xué)穩(wěn)定性。
[0054] 2、本發(fā)明提供的無(wú)定形固體的KIFGSLAFL三氟乙酸水合鹽，具有良好水溶性和穩(wěn) 定性，易于注射給藥等途徑使用時(shí)的藥物快速?gòu)?fù)溶，充分保證藥物制劑的方便使用，用藥安 全和有效。相比之下，溶液狀態(tài)的KIFGSLAFL三氟乙酸鹽在常溫時(shí)的化學(xué)穩(wěn)定性較差，且容 易染菌;而在低溫保存時(shí)由于結(jié)冰導(dǎo)致局部濃度不同，使用時(shí)需要充分融化和混勻，才能獲 得均一的溶液。
[0055] 3、本發(fā)明提供了一種高純度KIFGSLAFL三氟乙酸水合鹽的制備方法，克服現(xiàn)有技 術(shù)制鹽和提高純度的技術(shù)困難，該方法條件溫和，易于重現(xiàn)，大幅降低產(chǎn)業(yè)化成本。
【附圖說(shuō)明】
[0056]圖1，KIFGSLAFL二三氟乙酸水合鹽無(wú)定形固體的X-ray衍射光譜圖。
[0057] 圖2，KIFGSLAFL-三氟乙酸水合鹽無(wú)定形固體的IR光譜圖。
[0058] 圖3，KIFGSLAFL二三氟乙酸水合鹽無(wú)定形固體的IR光譜圖。
[0059] 圖4，KIFGSLAFL二三氟乙酸水合鹽無(wú)定形固體的ESI質(zhì)譜圖。
[0060] 圖5，KIFGSLAFL-三氟乙酸水合鹽無(wú)定形固體的ESI質(zhì)譜圖。
[0061] 實(shí)施方式
[0062] 以下實(shí)施例和附圖用于解釋本發(fā)明，但絕不限制本發(fā)明。
[0063] 實(shí)施例1KIFGSLAFL粗品的制備
[0064] (1)、稱(chēng)取Fmoc-Leu-Wang樹(shù)脂（取代度為0 · 8mmol/g)40g，加入DMF300mL溶脹樹(shù)脂 30min。抽濾去DMF，加入20 %哌啶/DMF溶液300mL反應(yīng)30min。抽濾，用DMF 6 X 150mL洗滌樹(shù) 脂。
[0065] (2)、加入Fmoc-Phe-〇H 24.8g，H0Bt 8.6g和DMF 150mL，攪拌均勻，再加入DIC 9.5mL，于28-30 °C水浴中攪拌4~5h。經(jīng)Kaiser法檢測(cè)，樹(shù)脂呈無(wú)色后，抽濾，用DMF 2 X 200mL洗滌樹(shù)脂。加入20%哌啶/DMF溶液300mL反應(yīng)30min，抽濾，用DMF 6 X 200mL洗滌樹(shù)脂。 [0066] (3、參考步驟2，依次偶聯(lián)下一個(gè)氨基酸。后續(xù)氨基酸順序及用量為:Fmoc-Ala-OH 19.9g，F(xiàn)moc_Leu-〇H 22.6g，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-〇H 24.5g，F(xiàn)moc_Gly-〇H 19.0g，F(xiàn)moc-Phe_0H 24.8g，F(xiàn)moc_Ile-〇H 22.6g和Fmoc_Lys(Boc)-〇H 30.0g。
[0067] (4)、依次用二氯甲烷和甲醇洗滌樹(shù)脂，真空干燥，得KIFGSLAFL肽樹(shù)脂。
[0068] (5)、稱(chēng)取 10g肽樹(shù)脂，加入 100mL裂解溶液(TFA/TIS/H20 = 95/2 · 5/2 · 5，v/v/v)，室 溫?cái)嚢?h。過(guò)濾樹(shù)脂，適量裂解溶液洗滌樹(shù)脂。洗滌液與濾液合并，攪拌下加入乙醚1L，析出 沉淀。經(jīng)離心和乙醚洗滌幾遍后，真空干燥得到KIFGSLAFL粗品。
[0069] 實(shí)施例2KIFGSLAFL粗品的純化
[0070] 將實(shí)施例1得到的KIFGSLAFL粗品5g溶解在100mL含有40%體積比乙腈的水中，過(guò) 濾。濾液用C18柱純化，填料高度250mm，直徑150mm，流動(dòng)相A為含有0.1 %體積比三氟乙酸的 水，流動(dòng)相B為含有0.1 %體積比三氟乙酸的乙腈，梯度洗脫(B 20-50 %，洗脫時(shí)間60min)， 流速600mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)230nm。收集主峰成分。用分析型高效液相色譜檢測(cè)收集液的純 度。合并純度大于98 %的部分，得KIFGSLAFL · 2TFA純品溶液，旋蒸濃縮，凍干即得固體。最 后在50°C下真空干燥至水分含量1.5%左右(w/w，卡爾-費(fèi)休水分測(cè)定法）。用分析型高效液 相色譜檢測(cè)收集液的純度，純度98.6%，收率45%。樣品中三氟乙酸的重量百分?jǐn)?shù)按無(wú)水物 計(jì)算約為18.8%(計(jì)算得1 = 1，11 = 2)。
[0071 ] X-ray衍射光譜檢測(cè)條件:儀器型號(hào):銳影(Empyrean)X_射線衍射儀;測(cè)試條件:Cu 靶Κα?射線，電壓40kv，電流4OmA，20范圍3°-50°，發(fā)散狹縫1/32°，防散射狹縫1/16°，防散射 狹縫7.5_，步長(zhǎng)0.02°，每步停留時(shí)間40S。X-ray衍射光譜如附圖1所示。
[0072] KBr壓片法得到的IR光譜如附圖3所示。
[0073] ESI質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果如圖4所示，其中995.6m/z峰為M+H+，與KIFGSLAFL的分子量計(jì)算 值一致。
[0074]分析高效液相色譜檢測(cè)三氟乙酸和目標(biāo)肽含量的條件是：創(chuàng)新通恒LC300高效液 相色譜儀，C18鍵合硅膠(250\4.6臟，5以111)為固定相，流動(dòng)相4為乙腈，流動(dòng)相8為0.1111〇1/1 磷酸二氫鈉(磷酸調(diào)pH至3.0)水溶液。梯度洗脫(流動(dòng)相A從5 %到45 %，洗脫時(shí)間20min;然 后改流動(dòng)相A45%等度洗脫），流速lmL/min。檢測(cè)波長(zhǎng)195nm(0-8min)和220nm(8-25min)。三 氟乙酸和目標(biāo)肽的出峰時(shí)間分別約為4.9min和20min。
[0075]分析高效液相色譜檢測(cè)目標(biāo)肽純度的條件是：創(chuàng)新通恒LC300高效液相色譜儀， C18鍵合硅膠(250 X4.6mm，5μπι)為固定相，流動(dòng)相為0. lmol/L磷酸二氫鈉(磷酸調(diào)pH至3.0) 水溶液和乙腈的混合液(體積比7:3)。流速lmL/min。檢測(cè)波長(zhǎng)230nm。目標(biāo)肽的出峰時(shí)間約 為10min〇
[0076]實(shí)施例3游離肽KIFGSLAFL固體的制備
[0077] 實(shí)施例2得到的KIFGSLAFL · 2TFA溶液冷卻至0-5°C，攪拌下滴加 5%Na0H水溶液調(diào) 節(jié)pH至7~8。減壓濃縮至析出大量膠狀沉淀。離心，用少量冰水洗滌。沉淀經(jīng)凍干得白色固 體，水分含量1.8%左右(w/w)，純度98.1 %，三氟乙酸的重量百分?jǐn)?shù)約為0.2%。
[0078] 實(shí)施例4KIFGSLAFL-三氟乙酸水合鹽的制備(n = l，x = l)
[0079] 將實(shí)施例2得到的KIFGSLAFL · 2TFA溶液用C18柱純化，填料高度250mm，直徑 150mm。先用3 %體積比乙腈的水溶液洗脫1 Omi η，流速800mL/mi η。然后用流動(dòng)相A為水，流動(dòng) 相B為乙腈，梯度洗脫(B:20%-40%，洗脫時(shí)間50min)，檢測(cè)波長(zhǎng)230nm。收集主峰成分，得 KIFGSLAFL-三氟乙酸水合鹽溶液，濃縮后凍干即得白色固體，最后在40°C下真空干燥至水 分含量1.6%左右(w/w，卡爾-費(fèi)休水分測(cè)定法），收率91 %。
[0080] 按實(shí)施例2的分析高效液相色譜檢測(cè)，樣品中三氟乙酸的重量百分?jǐn)?shù)按無(wú)水物計(jì) 算約為10%(計(jì)算得叉=1，11 = 1)。1(正631^^1^的純度99.5%。
[0081] KBr壓片法得到的IR光譜如附圖2所示。
[0082] ESI質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果如圖5所示，其中995.6m/z峰為M+H+，與KIFGSLAFL的分子量計(jì)算 值一致。
[0083] 實(shí)施例5. KIFGSLAFL倍半三氟乙酸水合鹽的制備(η = 1.5，X = 4)
[0084] 將實(shí)施例2得到的KIFGSLAFL · 2TFA溶液平分成2份。一份用C18柱純化，填料高度 250mm，直徑150mm。先用3 %體積比乙腈的水溶液洗脫1 Omin，流速800mL/min。然后用流動(dòng)相 A為水，流動(dòng)相B為乙腈，梯度洗脫(B: 20%-40%，洗脫時(shí)間50min)，檢測(cè)波長(zhǎng)230nm。收集主 峰成分，得KIFGSLAFL-三氟乙酸水合鹽溶液。兩份溶液合并后濃縮，凍干，后期在30°C下真 空干燥至水分含量約5.8% (w/w)，得白色KIFGSLAFL倍半三氟乙酸水合鹽固體，收率95%。 [0085]按實(shí)施例2的分析高效液相色譜檢測(cè)，樣品中三氟乙酸的重量百分?jǐn)?shù)按無(wú)水物計(jì) 算約為15% IIFGSLAFL的純度99.1 %。
[0086] 實(shí)施例6KIFGSLAFL二三氟乙酸水合鹽的制備
[0087] 參照實(shí)施例2的操作，在后期真空干燥階段，縮短干燥時(shí)間，并用卡爾-費(fèi)休水分測(cè) 定法監(jiān)測(cè)產(chǎn)品的水分，當(dāng)水分含量降至2.9% (w/w)左右時(shí)停止干燥。所得的三氟乙酸的重 量百分?jǐn)?shù)按無(wú)水物計(jì)算約為18.8 %。計(jì)算得η = 2，X = 2。
[0088] 實(shí)施例7KIFGSLAFL倍半三氟乙酸水合鹽的制備
[0089] 參照實(shí)施例5的操作，在后期真空干燥階段，縮短干燥時(shí)間，并用卡爾-費(fèi)休水分測(cè) 定法監(jiān)測(cè)產(chǎn)品的水分含量至7.2% (w/w)左右。所得的三氟乙酸的重量百分?jǐn)?shù)按無(wú)水物計(jì)算 約為15 %。計(jì)算得η = 1.5，X = 5。
[0090] 實(shí)施例8ΚIFGSLAFL倍半三氟乙酸水合鹽的制備
[0091] 參照實(shí)施例5的操作，在后期真空干燥階段，干燥溫度60°C，并用卡爾-費(fèi)休水分測(cè) 定法監(jiān)測(cè)產(chǎn)品的水分含量至0.7% (w/w)左右。所得的三氟乙酸的重量百分?jǐn)?shù)按無(wú)水物計(jì)算 約為 15 %。計(jì)算得η = 1.5，X = 0.5。
[0092] 實(shí)施例9KIFGSLAFL-三氟乙酸倍半水合鹽的制備
[0093]參照實(shí)施例4的操作，在后期40°C真空干燥階段用卡爾-費(fèi)休水分測(cè)定法監(jiān)測(cè)產(chǎn)品 的水分含量至2.5% (w/w)左右。所得的三氟乙酸的重量百分?jǐn)?shù)按無(wú)水物計(jì)算約為10%。計(jì) 算得η = 1，χ = 1.5。
[0094] 實(shí)施例10KIFGSLAFL硫酸鹽的制備
[0095]將實(shí)施例3所得固體，用適量40 %濃度的乙腈溶解，加入等摩爾硫酸，攪拌0.5h。減 壓濃縮，凍干，后期50°C真空干燥，得到白色KIFGSLAFL硫酸鹽固體，水分含量1.7%。
[0096] 實(shí)施例11KIFGSLAFL二鹽酸鹽的制備
[0097]將實(shí)施例3所得固體，用適量40 %濃度的乙腈溶解，加入2倍摩爾鹽酸，攪拌0.5h。 減壓濃縮，凍干，后期50°C真空干燥，得到白色KIFGSLAFL二鹽酸鹽固體，水分含量1.8%。 [0098]實(shí)施例12、吸潮性對(duì)比試驗(yàn)
[0099] 各實(shí)施例得到的化合物分別稱(chēng)取20mg，在無(wú)菌環(huán)境25 °C和RH 50 %下，測(cè)量不同時(shí) 間后樣品的質(zhì)量。：
[0100]試驗(yàn)結(jié)果如下：
[0103] 從上表試驗(yàn)可知，實(shí)施例4的一三氟乙酸水合鹽，實(shí)施例2、6的二三氟乙酸水合鹽， 和實(shí)施例5的倍半三氟乙酸水合鹽的增重相對(duì)最小，而實(shí)施例10的硫酸鹽和實(shí)施例11的二 鹽酸鹽的增重明顯高于上述樣品。說(shuō)明本發(fā)明的一三氟乙酸水合鹽、倍半三氟乙酸水合鹽 和二三氟乙酸水合鹽具有更好的抗吸濕性能。
[0104] 實(shí)施例13、熱穩(wěn)定性測(cè)定
[0105] 把樣品置于50°C密閉容器中，經(jīng)過(guò)不同時(shí)間后測(cè)試其純度。HPLC測(cè)試條件同實(shí)施 例2。
[0106]
[0107]上述實(shí)施例6的溶液為實(shí)施例6的樣品0. lg溶解在50ml無(wú)菌水中。
[0108]從上表試驗(yàn)可看出，10天后上述KIFGSLAFL的各種固體三氟乙酸水合鹽的純度下 降在3%以內(nèi)，而水溶液、游離肽、硫酸鹽和二鹽酸鹽的純度下降均大于4% IIFGSLAFL的各 種三氟乙酸水合鹽的熱穩(wěn)定性明顯高于游離肽、硫酸鹽和二鹽酸鹽。上述各種固體三氟乙 酸水合鹽中，實(shí)施例6、5、7樣品的純度下降幅度依次增大，提示含水量x = 5較高不利于樣品 的穩(wěn)定性。
[0109]實(shí)施例14、溶解速度實(shí)驗(yàn)
[0110]分別把固體樣品20mg(按無(wú)水物計(jì)算）加到10ml 25°C的注射用水中，置于恒溫?fù)u 床中振蕩，記錄固體溶清的時(shí)間。結(jié)果如下：
[0112] 上述結(jié)果顯示，當(dāng)實(shí)施例8的樣品（x = 0.5)的含水量較低時(shí)，溶解時(shí)間明顯比x = 1-4的樣品要延長(zhǎng)。
[0113] 通過(guò)實(shí)施例12、13和14總體上可以得出：本發(fā)明的水合鹽（C5QH78N 1Q0n · nTFA · 義112〇，其中11 = 1-2，1=1-4)相對(duì)于游離肽、硫酸鹽、鹽酸鹽和1〈1或者1>4的三氟乙酸水合物 鹽，表現(xiàn)出更好的抗吸潮性，化學(xué)穩(wěn)定性，以及優(yōu)越的水溶解性，更有利于該藥物的應(yīng)用。
[0114] 實(shí)施例15、多肽疫苗制品的制備
[0115] 于無(wú)菌環(huán)境中按照實(shí)施例4的操作制備得到的KIFGSLAFL-三氟乙酸水合鹽。精密 稱(chēng)量（以KIFGSLAFL堿計(jì)lmg/份），分裝于無(wú)菌玻璃瓶中，密閉包裝，得多肽疫苗制品。
[0116] 上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. KIFGSLAFL三氟乙酸水合鹽，其分子式為C5QH78N1QO 11 · nTFA · χΗ20,其中n=l-2(優(yōu)選 n = l，1.5或2)，x = l-4(優(yōu)選x = l-2,特別是x = l，1.5或2)，TFA代表三氟乙酸。2. 根據(jù)權(quán)利要求1的三氟乙酸水合鹽，其特征在于，所述KIFGSLAFL三氟乙酸水合鹽的 純度2 95%，優(yōu)選2 98%，更優(yōu)選2 99%。3. 根據(jù)權(quán)利要求1至2任一權(quán)利要求所述的三氟乙酸水合鹽，其特征在于，所述三氟乙 酸水合鹽為無(wú)定形固體，其X-射線衍射譜圖無(wú)晶體特征的吸收峰。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的三氟乙酸水合鹽，其特征在于，n = 1，紅外吸收在32810114、 3089cm-1、2960cm-1、2928cm- 1、1630cm-1、1531 cm-1、1402cm-1、1204cm-1、1140cm- 1、722cm-1 和 700cm-1處有峰，誤差± 2cm-1。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的三氟乙酸水合鹽，其特征在于，n = 2,紅外吸收在3292CHT1、 3087cm-\2962cm-1、1641cm- 1、1531cm-1、1203cm-1、1139cm-\722cm-1 和 700cm-1 處有峰，誤差 ±2cm-、6. -種多肽疫苗的藥物制品，其特征在于，包含權(quán)利要求1至5任一權(quán)利要求所述的 KIFGSLAFL三氟乙酸水合鹽，它適宜用藥學(xué)上可接受的溶媒重新配制為一種可注射的藥用 產(chǎn)品，通過(guò)注射途徑給予患者。7. 根據(jù)權(quán)利要求6的制品，其特征在于，所述溶媒包括注射用水、無(wú)菌水、無(wú)菌生理鹽水 和無(wú)菌葡萄糖的水溶液。8. -種制備權(quán)利要求1至5任一權(quán)利要求所述的KIFGSLAFL三氟乙酸水合鹽的方法，其 特征在于，包括如下步驟： (1) 采用Fmoc固相合成方法，按照氨基酸序列（9-1)的順序，合成KIFGSLAFL肽樹(shù)脂，然 后經(jīng)三氟乙酸裂解，得到KIFGSLAFL粗品； (2) 將KIFGSLAFL粗品溶解，過(guò)濾，以含三氟乙酸的乙腈/水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行反相高效 液相色譜純化，收集主峰成分； (3) 將步驟(2)所得的主峰成分以乙腈/水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行反相高效液相色譜脫酸， 收集主峰成分； (4) 、減壓濃縮，經(jīng)干燥得到。9. 一種制備權(quán)利要求1、2、3和5任一權(quán)利要求所述的KIFGSLAFL三氟乙酸水合鹽的方 法，其特征在于，所得水合鹽η = 2，包括如下步驟： (1) 采用Fmoc固相合成方法，按照氨基酸序列（9-1)的順序，合成KIFGSLAFL肽樹(shù)脂，然 后經(jīng)三氟乙酸裂解，得到KIFGSLAFL粗品； (2) 將KIFGSLAFL粗品溶解，過(guò)濾，以含三氟乙酸的乙腈/水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行反相高效 液相色譜純化，收集主峰成分； (3) 減壓濃縮，經(jīng)干燥得到。10. 根據(jù)權(quán)利要求8或9的制備方法，其特征在于，步驟(2)純化和步驟(3)脫酸條件分別 以C4、C8或C18烷基鍵合硅膠為固定相;柱溫20-35°C ;步驟(2)純化使用流動(dòng)相中三氟乙酸 濃度為 〇·〇2%-〇·5%(v/v)。
【文檔編號(hào)】A61K39/00GK105884885SQ201610072791
【公開(kāi)日】2016年8月24日
【申請(qǐng)日】2016年2月1日
【發(fā)明人】譚端明, 田茂奎, 孫寶金
【申請(qǐng)人】深圳信立泰藥業(yè)股份有限公司