一種醋氯芬酸的藥物組合物及其醫(yī)藥用圖
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種醋氯芬酸的藥物組合物及其醫(yī)藥用途，本發(fā)明提供的醋氯芬酸的藥物組合物中含有醋氯芬酸和一種從大黃的干燥根中分離得到的結(jié)構(gòu)新穎的天然產(chǎn)物化合物（Ⅰ），醋氯芬酸和該天然產(chǎn)物化合物（Ⅰ）單獨(dú)作用時(shí)，對(duì)慢性腎炎的治療效果較弱；二者聯(lián)合作用時(shí)，對(duì)慢性腎炎的治療效果顯著提高，可以開(kāi)發(fā)成治療慢性腎炎的藥物，與現(xiàn)有技術(shù)相比具有突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著的進(jìn)步。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
一種醋氯芬酸的藥物組合物及其醫(yī)藥用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及醋氯芬酸的新用途，具體涉及一種醋氯芬酸的藥 物組合物及其醫(yī)藥用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 醋氯芬酸是一種新型、強(qiáng)效解熱、鎮(zhèn)痛、抗關(guān)節(jié)炎藥物，臨床上適用于治療風(fēng)濕性 關(guān)節(jié)炎、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、脊椎炎等，也適用于各種疾病引起的疼痛和發(fā)熱。
[0003] 本品為一新合成的口服有效的非類(lèi)固醇類(lèi)，苯乙酸類(lèi)抗炎、解熱、鎮(zhèn)痛藥物。在結(jié) 構(gòu)上，與雙氯芬酸、阿氯芬酸和芬氯芬酸有關(guān)。在臨床實(shí)踐中，本品的藥理作用與其他非類(lèi) 固醇類(lèi)藥物(NSAIDs)相比，它在急、慢性炎癥實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭幸跃哂忻黠@廣泛的抗炎作用、強(qiáng)力 的鎮(zhèn)痛和解熱以及胃毒性作用為特征。
[0004] 抗炎作用。本品對(duì)大鼠由注射愛(ài)蘭苔膠引起的水腫和膿腫的發(fā)展顯示高效的抑制 作用。它也減輕小鼠由腹腔注射醋酸引起的血管通透性增加以及大鼠由愛(ài)蘭苔膠引起的胸 膜炎的水腫和細(xì)胞成分的炎癥反應(yīng)。本品對(duì)急性炎癥的抗炎作用的強(qiáng)度與高效NSAIDs吲哚 甲新和雙氯芬酸相似。而比萘普生、保泰松作用強(qiáng)?？诜酒奉A(yù)防和治療也使犬關(guān)節(jié)內(nèi)注射 尿酸鈉引起的病理性步態(tài)產(chǎn)生劑量依賴性得到改善。本品的抗炎作用也在棉花小球肉芽腫 實(shí)驗(yàn)中得以證實(shí)。在這種實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)類(lèi)固醇比NSAIDs更有效，對(duì)鼠慢性佐劑關(guān)節(jié)炎，本品有 與吲哚甲新、雙氯芬酸相似的、顯著的抗關(guān)節(jié)炎作用。在臨床上已證實(shí)對(duì)慢性關(guān)節(jié)炎的有效 性。
[0005] 鎮(zhèn)痛作用。對(duì)許多由化學(xué)性、機(jī)械性或關(guān)節(jié)炎的刺激引起的動(dòng)物疼痛模型，本品的 效能類(lèi)似于雙氯芬酸或吲哚甲新，而強(qiáng)于萘普生和保泰松。尤其本品對(duì)注入硝酸銀引起的 鼠爪關(guān)節(jié)炎和犬關(guān)節(jié)注射尿酸鈉所致的骨膜炎疼痛顯示強(qiáng)力的抗傷害作用。在臨床上，本 品的鎮(zhèn)痛作用已被不同起因的疼痛病人證實(shí)。本品與其它NSAIDs-樣具有突出的周?chē)枣?zhèn) 痛機(jī)制?？赡苁怯捎谝种苾?nèi)源性疼痛介質(zhì)的形成。
[0006] 解熱作用。本品可明顯地減輕大鼠由注射布魯爾氏酵母引起的體溫升高。即使口 服最低劑量〇.25mg/kg，它的解熱作用也大于它的抗炎作用8倍。本品的高效解熱作用，提示 它除了抑制體內(nèi)前列腺素的合成或釋放外，還可能由于對(duì)下丘腦的抑制。
[0007] 慢性腎炎是由多種原因引起的原發(fā)于腎小球的一組免疫炎癥性疾病。近年來(lái)，由 于免疫熒光技術(shù)及電子顯微鏡的應(yīng)用，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)慢性腎炎的免疫發(fā)病機(jī)理、病理形態(tài)及 功能改變都進(jìn)行了系統(tǒng)而深入的研究，但在治療方面，尚缺乏特效藥物。
[0008]迄今為止，尚未見(jiàn)醋氯芬酸的藥物組合物與慢性腎炎的相關(guān)性報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的在于提供一種醋氯芬酸的藥物組合物，該藥物組合物中含有醋氯芬 酸和一種從草本中分離得到的結(jié)構(gòu)新穎的天然產(chǎn)物，醋氯芬酸和該天然產(chǎn)物可以協(xié)同治療 慢性腎炎。
[0010] 本發(fā)明的上述目的是通過(guò)下面的技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的： 一種具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物（I)，
一種醋氯芬酸的藥物組合物，包括醋氯芬酸、如上所述的化合物（I)和藥學(xué)上可以接受 的載體。
[0011] 如上所述的化合物（I)的制備方法，包含以下操作步驟：（a)將大黃的干燥根粉碎， 用70~80%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無(wú)醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水飽和 的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步驟(a)中正 丁醇取物用大孔樹(shù)脂除雜，先用8%乙醇洗脫6個(gè)柱體積，再用70%乙醇洗脫8個(gè)柱體積，收集 70%洗脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中70%乙醇洗脫濃縮物用正相硅膠 分離，依次用體積比為50:1、25:1、15:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到4個(gè)組分；（d) 步驟(c)中組分4用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為10:1、5:1和2:1的二氯甲烷-甲醇 梯度洗脫得到3個(gè)組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積 百分濃度為70%的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~12個(gè)柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到化 合物(I)。
[0012] 進(jìn)一步地，步驟(a)中，用75%乙醇熱回流提取，合并提取液。
[0013]進(jìn)一步地，所述大孔樹(shù)脂為D101型大孔吸附樹(shù)脂。
[0014] 如上所述的化合物(I)在制備治療慢性腎炎的藥物中的應(yīng)用。
[0015] 如上所述的醋氯芬酸的藥物組合物在制備治療慢性腎炎的藥物中的應(yīng)用。
[0016] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)： 本發(fā)明提供的醋氯芬酸的藥物組合物中含有醋氯芬酸和一種從草本中分離得到的結(jié) 構(gòu)新穎的天然產(chǎn)物，醋氯芬酸和該天然產(chǎn)物單獨(dú)作用時(shí)，對(duì)慢性腎炎的治療效果較弱;二者 聯(lián)合作用時(shí)，對(duì)慢性腎炎的治療效果顯著提高，可以開(kāi)發(fā)成治療慢性腎炎的藥物。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容。
[0018] 實(shí)施例1:化合物(I)分離制備及結(jié)構(gòu)確證 試劑來(lái)源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷為分析純，購(gòu)自上海凌峰化學(xué)試 劑有限公司，甲醇，分析純，購(gòu)自江蘇漢邦化學(xué)試劑有限公司。
[0019]分離方法：（a)將大黃的干燥根(2kg)粉碎，用75%乙醇熱回流提?。?0LX 3次），合 并提取液，濃縮至無(wú)醇味(4L)，依次用石油醚(4L X 3次）、乙酸乙酯(4L X 3次)和水飽和的正 丁醇（4LX 3次）萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步驟 (a )中乙酸乙酯萃取物用D101型大孔樹(shù)脂除雜，先用8%乙醇洗脫6個(gè)柱體積，再用70%乙醇洗 脫8個(gè)柱體積，收集70%洗脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中70%乙醇洗脫 濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為50:1 (8個(gè)柱體積）、25:1 (8個(gè)柱體積）、15:1 (8個(gè)柱 體積)和5:1(10個(gè)柱體積）的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到4個(gè)組分；（d)步驟(c)中組分4用 正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為10:1 (8個(gè)柱體積）、5:1 (10個(gè)柱體積)和2:1 (5個(gè)柱體 積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分;（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反 相硅膠分離，用體積百分濃度為70%的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~12個(gè)柱體積洗脫液，洗 脫液減壓濃縮得到化合物（I) (525mg，HPLC歸一化純度大于98%)。
[0020] 結(jié)構(gòu)確證:黃色固體;HR-ESI-MS顯示[M+H]+為m/z 541.3119，結(jié)合核磁特征可得 分子式為C32H44O7,不飽和度為11。核磁共振氫譜數(shù)據(jù)SH(ppm，DMS0-^，600MHz) :H-l(5.97， d,/=12.7Hz),H-2(5.82,d,/=12.7Hz),H-4(4.59,dt,/=12.2,6.5Hz),H-5(2.18,m),H-6 (4·43，?，/=4·4Ηζ)，Η-7(1·43，πι)，Η-7(1·48，πι)，Η-8(2·27，(Μ，/=13·1，4·9Ηζ)，Η-11(1·38， m),H-ll(2.21,dd,/=11.0,6.8Hz),H-12(1.42,m),H-12(1.71,m),H-15(1.29,dd,/=14.2, 4.3Hz),H-15(2.33,dd,/=14.2,7.9Hz),H-16(5.33,td,/=7.2,4.3Hz),H-16b(2.06,s),H-17(2.44,m),H-18(1.16,s),H-19(0.98,d,/=4.0Hz),H-19(1.84,d,/=4.0Hz),H-20(2.51, m),H-21(0.86,d,/=6.9Hz),H-24aa(6.02,s),H-24ab(5.90,s),H-25(2.92,m),H-26(1.05, d J=6.8Hz)，H-27( 1.10，(1，/=6· 8Hz)，H-28( 1.59，(1，/=6· 6Hz)，H-30( 1.01，s);核磁共振碳 譜數(shù)據(jù) Sc(ppm，DMS〇-c/i；，150MHz) :151.5(CH，卜 C)，118.9(CH，2-C)，168.2(C，3-C)，79.3(CH， 4-C)，47.7(CH，5-C)，66.2(CH，6-C)，32.8(CH2,7-C)，40.3(CH，8-C)，30.0(C，9-C)，35.2(C， 10-C)，28.5(CH2，11-C)，32.6(CH2，12-C)，45.8(C，13-C)，47.3(C，14-C)，47.5(CH2，15-C)， 77.1(CH，16-C)，170.2(C，16a-C)，22.7(CH 3，16b-C)，50.5(CH，17-C)，19.2(CH3，18-C)，36.3 (CH2，19-C)，32.5(CH，20-C)，12.6(CH 3,21-C)，203.7(C，22-C)，195.2(C，23-C)，154.3(C， 24-C)，120.3(CH2,24a-C)，30.7(CH，25-C)，22.1(CH3,26-C)，21.9(CH 3,27-C)，18.5(CH3， 28-〇,20.7(〇13,30-〇。11?譜圖中的3455 〇11-1、1715〇11-1與1694 〇11-1吸收帶表明該化合物 結(jié)構(gòu)中存在-〇H、羰基與共輒羰基;UV譜圖中的最大吸收207nm與245nm說(shuō)明結(jié)構(gòu)中存在共輒 雙鍵。氫譜核磁數(shù)據(jù)表明該結(jié)構(gòu)中不飽和度是由2個(gè)C-C雙鍵結(jié)構(gòu)，4個(gè)羰基結(jié)構(gòu)以及5個(gè)環(huán) 狀骨架組成。知1.84與δ Η 〇. 98的偶合常數(shù)為4.0Hz，是存在環(huán)丙烷結(jié)構(gòu)的證據(jù)。碳譜核磁數(shù) 據(jù)與DEPT譜數(shù)據(jù)表明：該化合物結(jié)構(gòu)中含有32個(gè)碳，其中有七個(gè)甲基(S C22.7、19.2、12.6、 22.1、21.9、18.5與2〇.7)，六個(gè)亞甲基0。32.8、28.5、32.6、47.5、36.3與12〇.3)，十個(gè)次甲 基（3。151.5、118.9、79.3、47.7、66.2、40.3、77.1、50.5、32.5與30.7)，九個(gè)叔碳（3。168.2、 3〇.〇、35.2、45.8、47.3、154.3、17〇.2、2〇3.7與195.2)，兩個(gè)酮基0。2〇3.7與195.2)，兩個(gè) 酯羰基（δ^168·2與170.2)，三個(gè)連氧叔碳（6。79.3、66.2與77.1)，四個(gè)烯碳（6。151.5與 118.9;154.3與12〇.3)。!!\?(：譜中!1-60[ 14.43)與(：-8(5。40.3)和(：-100。35.2)的相關(guān)性，以 及COSY譜中Η-6和Η-5(δ Η2.18)的相關(guān)性表明C-6(Sc66.2)位連有一個(gè)羥基。通過(guò)HMBC解析可 知δ[170.2的羰基碳與δ Η2.06的H-16b甲基組成乙?；瑫r(shí)δΗ5.33的H-16與δ[170.2羰基碳 也存在相關(guān)性，表明了乙酰基連接的位置;知203.7的碳信號(hào)與δ Η2.51的Η-20存在相關(guān)性，說(shuō) 明C-22為羰基。通過(guò)N0ESY譜數(shù)據(jù)解析δΗ 4.59的Η-4、δΗ 1.59的Η-28與δΗ2.18的Η-5及δ η4.43的Η-6關(guān)系可以說(shuō)明28-甲基相對(duì)立體構(gòu)型。綜合氫譜、碳譜、HMBC譜和N0ESY譜，以及 文獻(xiàn)關(guān)于相關(guān)類(lèi)型核磁數(shù)據(jù)，可基本確定該化合物如下，立體構(gòu)型進(jìn)一步通過(guò)ECD試驗(yàn)確 定，理論值與實(shí)驗(yàn)值基本一致。
[0021]實(shí)施例2:對(duì)大鼠慢性腎炎模型的治療作用 實(shí)驗(yàn)采用的是的方法改良的陽(yáng)離子化牛血清白蛋白（誘發(fā)的慢性腎小球腎炎模型，該 模型是目前研究治療藥物時(shí)首選的動(dòng)物模型之一。陽(yáng)性對(duì)照藥物選取的是雷公藤多苷片。 檢測(cè)實(shí)驗(yàn)大鼠的尿蛋白、血清肌酐、尿素氮等生化指標(biāo)的變化，腎臟組織制作染色病理切 片，在光鏡下觀察其病理變化。
[0022] -、實(shí)驗(yàn)材料 (一）、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠90只（健康清潔級(jí)），雌雄各半，體重標(biāo)準(zhǔn):200 ± 15g。購(gòu)自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí) 驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK黑2014-004。實(shí)驗(yàn)室具備排氣通風(fēng)設(shè)施，自然光照明 暗周期，籠具天消毒一次，墊料與飼料均購(gòu)自佳木斯大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。
[0023](二）、實(shí)驗(yàn)儀器與試劑 1、實(shí)驗(yàn)儀器 大鼠金屬代謝籠（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心），TGL-16G-C型高速臺(tái)式冷凍離心 機(jī)(上海安婷科學(xué)儀器廠），電子天平（長(zhǎng)沙市八方科學(xué)儀器廠），ALC-201.4型分析天平(德 國(guó)賽多利斯集團(tuán)），XH_C型旋禍混合器(金壇市醫(yī)療儀器廠），M0DULY0D型真空冷凍干燥儀， 電熱恒溫水浴箱(天津市泰斯特儀器有限公司），KQ5200型超聲清洗器(昆山市超聲儀器有 限公司），NS-500A型半自動(dòng)生化分析儀（四川美生科技有限公司），透析袋(美國(guó)公司），大鼠 灌胃針(北京金泉水科技有限公司），TSJ-1A型自動(dòng)組織脫水機(jī)(天津天利航空機(jī)電有限公 司），KD-2508型輪轉(zhuǎn)切片機(jī)(浙江金華市科迪儀器設(shè)備有限公司），KPJ-1A型烤片機(jī)(天津天 利航空機(jī)電有限公司），BMJ-1型生物組織包埋機(jī)(天津航空機(jī)電公司），CX31RTSF型OLYMPUS 倒置顯微鏡（日本OLYMPUS株式會(huì)社）。
[0024] 2、實(shí)驗(yàn)試劑 無(wú)水乙二胺(上海阿拉丁試劑有限公司），牛血清白蛋白（上海阿拉丁試劑有限公司）， 醋酸鈉(天津市凱通化學(xué)試劑有限公司），弗氏不完全佐劑(上海阿拉丁試劑有限公司），鹽 酸(上海阿拉丁試劑有限公司），醋酸（天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開(kāi)發(fā)有限公司），甘油三醋干 粉試劑盒(北京市北北康泰臨床試劑有限公司），血清肌酐試劑盒(南京建成生物工程研究 所），血清尿素氮脲酶法試劑盒(南京建成生物工程研究所），總膽固醇試劑盒(北京市北北 康泰臨床試劑有限公司），低密度脂蛋白膽固醇試劑盒(北京康泰臨床試劑有限公司）。 [0025] 3、實(shí)驗(yàn)藥物 雷公藤多苷片（l〇mg/片)購(gòu)自黃石飛云制藥有限公司。醋氯芬酸購(gòu)自上海極威生物科 技有限公司?；衔?I)自制，制備方法見(jiàn)實(shí)施例1。
[0026] 二、實(shí)驗(yàn)方法 (一）、制備陽(yáng)離子化牛血清白蛋白（C-BSA) 按照Border的方法改良，將67ml無(wú)水乙二胺液溶解于500ml雙蒸水，繼續(xù)緩慢添加 350ml鹽酸(6mol/l)，調(diào)整上述溶液pH至4.75。攪拌均勻，待其冷卻至25°C后，加入25ml天然 牛血清白蛋白（N-BSA)0.2g/ml水溶液，攪拌后再加1.8g炭化二亞胺鹽酸鹽，維持25°C，持續(xù) 攪拌2h，保持pH值4.75，最后加入4mo 1/1的醋酸緩沖液30ml，終止反應(yīng)，即得等電點(diǎn)提高的 C-BSA溶液。將C-BSA溶液置于透析袋中，用4°C雙蒸水透析72h，4h換水1次。將所得溶液冷凍 干燥48h，即可獲得BSA干粉，將其保存于-30°C冰箱中備用。
[0027](二）、制備不完全弗氏佐劑(FIA) 將羊毛脂l〇g和液體石蠟40ml置于研缽中，在108°C下消毒15分鐘，然后在紫外燈下照 射2h。隨后在超凈工作臺(tái)上把羊毛脂和液體石錯(cuò)按質(zhì)量體積比1:3的比例混合，均勻研磨， 即可完成不完全弗氏佐劑的制備。將成品儲(chǔ)存于4°C冰箱中備用。
[0028](三）、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及模型復(fù)制 1、動(dòng)物的適應(yīng)性飼養(yǎng)及初次分組 SD大鼠90只（健康清潔級(jí)），雌雄各半，體重200土 15g。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將其置于代謝 籠中收集尿液，兩次測(cè)定尿蛋白均為陰性。在其體表使用苦味酸法進(jìn)行編號(hào)標(biāo)記后進(jìn)行隨 機(jī)分組，隨機(jī)選取16只大鼠作為正常組，剩余大鼠則用于下一步造模。
[0029] 2、模型復(fù)制 (1)預(yù)免疫 實(shí)驗(yàn)第1周，將C-BSA與FIA按1:1混合，混勻成乳白色懸液。使用2. Omg上述懸液對(duì)造模 大鼠頸部、背部、腹股溝及腋下進(jìn)行皮下注射。正常組則注射等量生理鹽水。
[0030] (2)免疫 在實(shí)驗(yàn)第2周至第4周，將C-BSA與FIA按1:1混合，混勻成乳白色懸液。使用2.Omg上述懸 液對(duì)造模大鼠頸部、背部、腹股溝及腋下進(jìn)行皮下注射。然后將混勻乳白色的懸液對(duì)造模大 鼠進(jìn)行尾靜脈注射。首次對(duì)大鼠進(jìn)行尾靜脈注射量為〇.5mg/只，每隔1日進(jìn)行尾靜脈注射1 次。每隔次注射時(shí)給藥劑量逐漸遞增〇. 5mg，3周內(nèi)將尾靜脈注射量增加至2.5mg，正常組注 射等量生理鹽水。
[0031] 3、動(dòng)物二次分組 尾靜脈注射C-BSA結(jié)束后（即實(shí)驗(yàn)第4周后），檢測(cè)實(shí)驗(yàn)大鼠24小時(shí)尿蛋白，結(jié)果顯示造 模大鼠的尿蛋白大量增加，與正常組相比較有顯著性差異(P<〇.05)，確認(rèn)造模成功。造模 結(jié)束后，正常組大鼠存活15只，造模大鼠存活60只。將60只復(fù)制C-BSA模型成功且存活的大 鼠隨機(jī)分為5組，即醋氯芬酸治療組，化合物（I)治療組、醋氯芬酸與化合物（I)組合物治療 組，慢性腎炎模型對(duì)照組(模型組），雷公藤多苷治療組（陽(yáng)性對(duì)照組），每組12只，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué) 分析P>0.05,即說(shuō)明這組在尿蛋白的輕重程度上，無(wú)顯著性差異，有可比性，具備統(tǒng)計(jì)學(xué)意 義。醋氯芬酸、化合物(I)及其組合物先用少量DMS0超聲溶解，再用蒸餾水溶解稀釋灌胃。
[0032](四）給藥方案設(shè)定 正常組:蒸餾水2ml，每日1次晚間8點(diǎn)灌胃。
[0033]模型組:蒸餾水2ml，每日1次晚間8點(diǎn)灌胃。
[0034]陽(yáng)性對(duì)照組:藥液2ml(相當(dāng)于10g/kg/d)，每日1次晚間8點(diǎn)灌胃。
[0035]醋氯芬酸治療組:藥液2ml(相當(dāng)于5g/kg/d)，每日1次晚間8點(diǎn)灌胃。
[0036] 化合物（I)治療組:藥液2ml(相當(dāng)于5g/kg/d)，每日1次晚間8點(diǎn)灌胃。
[0037] 醋氯芬酸與化合物（I)組合物治療組:藥液2ml【相當(dāng)于2.5g/kg/d醋氯芬酸+2.5g/ kg/d化合物(I)】，每日1次晚間8點(diǎn)灌胃。
[0038]以上各組均連續(xù)給藥4周，每周測(cè)試1次24h尿蛋白，測(cè)量之前各組均禁食不禁水1 次，持續(xù)時(shí)間為12h，其余時(shí)間自由取食、飲水。
[0039](五）、生化指標(biāo)檢測(cè)及病理切片制作 1、尿標(biāo)本檢測(cè) 在造模前，實(shí)驗(yàn)第4、5、6、8周，將大鼠置于代謝籠中（釆樣前禁食不禁水121!，收集大鼠 的24小時(shí)尿液。使用雙縮脲測(cè)量大鼠的尿蛋白含量，然后使用半自動(dòng)生化分析儀，在波長(zhǎng) 540nm下，測(cè)定各管吸光度值，并換算成實(shí)際尿蛋白含量并記錄。
[0040] 2、血清樣本檢測(cè) 采集血樣前禁食12h。實(shí)驗(yàn)第4周，對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠麻醉后進(jìn)行眼內(nèi)齜取血0.5ml，在37 °C水 浴中靜置2h后，以3000rpm離心10分鐘，棄去上清液，收集血清，使用試劑盒法測(cè)定各指標(biāo)數(shù) 值并記錄;實(shí)驗(yàn)第8周末，將實(shí)驗(yàn)大鼠麻醉后，剖開(kāi)腹腔，找到腹主動(dòng)脈后取血8ml，釆取血樣 在37°C水浴中靜置2h后，以3000rpm離心10分鐘，棄去上清液，收集血清。使用試劑盒測(cè)定各 指標(biāo)數(shù)值并記錄。
[0041 ] 3、腎組織病理切片制作 (1)大鼠腎臟的初步處理 實(shí)驗(yàn)大鼠麻醉后用斷椎法處死，將其固定于鼠臺(tái)上，于大鼠背部旁下1.5cm處作縱切 口，暴露出腎臟，將雙腎取出，分離血管，脂肪及表面包膜，用醋酸緩沖液(PBS)液沖洗，然后 置于10%福爾馬林固定24h。
[0042] (2)組織脫水及包埋 將腎臟標(biāo)本從10%福爾馬林液中取出，使用蒸懷水反復(fù)沖洗5min。然后使用自動(dòng)脫水 機(jī)脫水:在濃度為70%乙醇液中放置6h，轉(zhuǎn)入濃度為80%的乙醇液中放置6h，轉(zhuǎn)入濃度為95% 的乙醇液中放置12h，轉(zhuǎn)入濃度100%的乙醇液中放置4h，轉(zhuǎn)入二甲苯溶液1中放置1 Omin，然 后轉(zhuǎn)入二甲苯溶液2中放置lOmin，繼續(xù)轉(zhuǎn)入60°C石錯(cuò)1號(hào)中放置15min，轉(zhuǎn)入60°C石錯(cuò)2號(hào)中 放置15min。上述步驟完成后，立即取出脫水標(biāo)本，放入組織包埋機(jī)的浸蠟盒中，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行 石蠟包埋，標(biāo)號(hào)，然后按組別標(biāo)記。
[0043] (3)制作病理切片及HE染色 使用切片機(jī)將已包錯(cuò)標(biāo)本制成厚度約為3μπι的薄片，在55°C展片機(jī)中展片，將薄片均勻 貼于載玻片上。然后將其放入烤箱中60°C下烤30min直至組織蠟完全融解，而后進(jìn)行脫蠟處 理，使用蒸傭水反復(fù)清洗，隨后在二甲苯1、2液中各浸泡lOmin，經(jīng)不同濃度的乙醇液中（從 濃度為100%至70%)逐級(jí)脫水，而后在蘇木素染液中放置lmin，自來(lái)水沖洗，1%HCL酒精分化， 于95%伊紅酒精染液中放置lmin，然后進(jìn)行脫水、透明，使用中性樹(shù)膠封片。在光學(xué)顯微鏡下 觀察腎組織病變程度、形態(tài)改變，并使用光學(xué)顯微攝像系統(tǒng)照相。
[0044] (4)數(shù)據(jù)處理統(tǒng)計(jì)方法 全部實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（X 土 S)表示，組間比較采 用t檢驗(yàn)及方差分析，計(jì)數(shù)資料使用卡方檢驗(yàn)，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0045]三、試驗(yàn)結(jié)果 1、 24h尿蛋白量的變化 與正常組比較，造模組尿蛋白明顯升高，具有顯著差異(P<〇.01)，提示造模成功。實(shí)驗(yàn) 第5周至第8周，除正常組外，各治療組24小時(shí)尿蛋白含量隨時(shí)間呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，模型組的下 降幅度很小，與模型組比較，各治療組的尿蛋白呈現(xiàn)顯著下降趨勢(shì)(P<〇.01)。醋氯芬酸與 化合物（I)組合物治療組與陽(yáng)性對(duì)照組比較無(wú)顯著差異(P>〇.05)，醋氯芬酸治療組和化合 物（I)治療組與陽(yáng)性對(duì)照組比較有顯著差異(P<〇.05)，說(shuō)明：醋氯芬酸與化合物（I)組合物 能顯著降低腎炎大鼠的尿蛋白含量，與陽(yáng)性藥效果接近;醋氯芬酸或化合物（I)單獨(dú)作用 時(shí)，有一定治療作用，但是效果明顯不如醋氯芬酸與化合物(I)組合物及陽(yáng)性藥。
[0046] 結(jié)果見(jiàn)下表(實(shí)驗(yàn)大鼠24h尿蛋白結(jié)果，mg/24h)。
[0047]
2、 血清肌酐(Cr)的變化 實(shí)驗(yàn)第4周至第8周，正常組與模型組的Cr無(wú)明顯變化，醋氯芬酸治療組、化合物（I)治 療組、醋氯芬酸與化合物（I)組合物治療組及陽(yáng)性對(duì)照組的Cr均下降，統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著差異 (P<0.01)，但是，醋氯芬酸治療組、化合物（I)治療組對(duì)Cr的下降作用不如醋氯芬酸與化合 物（I)組合物治療組及陽(yáng)性對(duì)照組。結(jié)果見(jiàn)下表(對(duì)大鼠 Cr水平的影響，μπι〇1/1)。
[0048] 3、血清尿素氮(BUN)的變化 實(shí)驗(yàn)第4周至第8周，正常組與模型組的BUN無(wú)明顯變化，醋氯芬酸治療組、化合物（I)治 療組、醋氯芬酸與化合物（I)組合物治療組及陽(yáng)性對(duì)照組的BUN均下降，統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著差 異(P<0.01)，但醋氯芬酸治療組、化合物(I)治療組對(duì)BUN的下降作用不如醋氯芬酸與化合 物（I)組合物治療組及陽(yáng)性對(duì)照組。結(jié)果見(jiàn)下表(對(duì)大鼠 BUN水平影響，mmol/1)。
[0049] 4、腎組織病理形態(tài)學(xué)的觀察 肉眼觀察:正常組大鼠的腎臟外觀呈深紅色，表面光滑柔軟，皮質(zhì)、髓質(zhì)界面清楚;模型 組大鼠的腎臟呈淡紅色，皮質(zhì)增厚，腫脹明顯，部分大鼠的皮質(zhì)髓質(zhì)邊界不清;治療組大鼠 的腎臟大多數(shù)呈紅色，有輕度腫脹，皮質(zhì)略增厚，皮質(zhì)、髓質(zhì)界面清楚；陽(yáng)性對(duì)照組大鼠的腎 臟大多數(shù)呈淡紅色，少數(shù)呈紅色;有輕度腫脹，皮質(zhì)略增厚，皮質(zhì)、髓質(zhì)界面清楚。
[0050] 光鏡下觀察:正常組大鼠腎組織的腎小球細(xì)胞、腎小管結(jié)構(gòu)及間質(zhì)形態(tài)正常，結(jié)構(gòu) 清晰，未見(jiàn)間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤(rùn)、水腫及纖維化，系膜細(xì)胞及基質(zhì)無(wú)增殖;模型組大鼠腎組織見(jiàn) 腎小球腫脹，大多數(shù)腎小球毛細(xì)血管狹窄，體積增大明顯，細(xì)胞數(shù)增多，系膜基質(zhì)增生明顯， 大量腎小管管腔擴(kuò)張，腎間質(zhì)出現(xiàn)纖維化，且有炎細(xì)胞浸潤(rùn);各治療組的腎小球內(nèi)壁光滑， 間質(zhì)增生明顯減少，有少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)。
[0051] 上述結(jié)果表明，醋氯芬酸和本發(fā)明提供的化合物（I)單獨(dú)作用時(shí)，對(duì)慢性腎炎的治 療效果較弱;醋氯芬酸和本發(fā)明提供的化合物(I)聯(lián)合作用時(shí)，對(duì)慢性腎炎的治療效果顯著 提高，可以開(kāi)發(fā)成治療慢性腎炎的藥物。
[0052] 上述實(shí)施例的作用在于說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明的保護(hù) 范圍。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換， 而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物（I)，2. -種醋氯芬酸的藥物組合物，其特征在于:包括醋氯芬酸、如權(quán)利要求1所述的化合 物(I)和藥學(xué)上可以接受的載體。3. 權(quán)利要求1所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于，包含以下操作步驟：（a)將大 黃的干燥根粉碎，用70~80%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無(wú)醇味，依次用石油醚、乙 酸乙酯和水飽和的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物； (b)步驟(a)中正丁醇取物用大孔樹(shù)脂除雜，先用8%乙醇洗脫6個(gè)柱體積，再用70%乙醇洗脫8 個(gè)柱體積，收集70%洗脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中70%乙醇洗脫濃 縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為50:1、25:1、15:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得 到4個(gè)組分；（d)步驟(c)中組分4用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為10:1、5:1和2:1的 二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅 膠分離，用體積百分濃度為70%的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~12個(gè)柱體積洗脫液，洗脫液 減壓濃縮得到化合物(I)。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:步驟(a)中，用75%乙醇熱 回流提取，合并提取液。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:所述大孔樹(shù)脂為DlOl型 大孔吸附樹(shù)脂。6. 權(quán)利要求1所述的化合物（I)在制備治療慢性腎炎的藥物中的應(yīng)用。7. 權(quán)利要求2所述的醋氯芬酸的藥物組合物在制備治療慢性腎炎的藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C07J73/00GK105884858SQ201610321332
【公開(kāi)日】2016年8月24日
【申請(qǐng)日】2016年5月16日
【發(fā)明人】徐珍
【申請(qǐng)人】蘇州畢諾佳醫(yī)藥技術(shù)有限公司