一種用于靶向治療的多肽和核酸偶聯(lián)化合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公布了一種用于靶向治療的多肽和核酸偶聯(lián)化合物。在作為效應分子的核酸和作為靶分子的多肽[D?Lys6]GnRH上分別引入炔烴基團和疊氮基團，然后通過click點擊化學反應，合成具有靶向作用的多肽和核酸偶聯(lián)化合物，可應用于腫瘤的靶向治療。
【專利說明】
一種用于靶向治療的多肽和核酸偶聯(lián)化合物
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領域，具體涉及一種多肽和核酸的偶聯(lián)化合物及其制備方 法，以及該化合物在疾病靶向治療中的應用。
【背景技術】
[0002] 1998年，F(xiàn)ire等發(fā)現(xiàn)了RNA干擾(RNA interference，RNAi)能特異性的降解目的基 因的mRNA(Fire A，Xu S，Montgomery MK，Kostas SA，Driver SE，Mello CC.Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans .Nature · 1998; 391:806-11 ·)。介導該現(xiàn)象的是雙鏈的siRNAJOOI年，Elbashir等 成功的用體外合成的雙鏈s iRNA沉默了哺乳動物細胞內(nèi)相關基因的表達，為s iRNA類基因治 療型藥物的發(fā)展奠定了基礎（Elbashir SM，Harborth J，Lendeckel W，Yalcin A，Weber K, Tuschl T.Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells.Nature.2001 ;411:494-8.)。但是，由于siRNA相對分子量較大（14000Da 左右)且?guī)в写罅康呢撾姾?，無法順利穿越細胞膜到達細胞內(nèi)，并容易從尿內(nèi)排出，再外加 siRNA自身的不穩(wěn)定性、易被降解、半衰期短、易引起免疫反應、難以從核內(nèi)體中逃逸等因 素，這些都導致siRNA生物利用度降低，影響其臨床應用。如何提高siRNA體內(nèi)的生物利用 度，是siRNA能否廣泛利用的關鍵。利用載體遞送siRNA，是一種有效的方法。脂質(zhì)體和聚合 物都可用于siRNA的載體，但都面臨像毒性大、靶向性不強甚至脫靶以及微粒大小控制困難 等問題。而蛋白類載體可以很好地克服這些問題，其中最常見的有細胞穿透肽和單鏈抗體。 Andaloussi等設計了一種新型的多肽PepFect 6(PF6)(Andaloussi SE，Lehto T,Mager I， Rosenthal-Aizman K，Oprea，11，Simonson OE,et al.Design of a peptide-based vector,PepFect6,for efficient delivery of siRNA in cell culture and systemically in vivo.Nucleic Acids Res.2011;39:3972_87.)，PF6與HPRTl (hypoxanthine phosphoribosyltransferasel)siRNA通過非共價復合形成PF6/siRNA混合 物，該復合物在體外實驗展現(xiàn)出很高的遞送效率，并且在動物試驗中，通過靜脈注射PF6/ siRNA可以有效地沉默肝、腎和肺部的HPRTlmRNA水平。但因為該多肽和核酸形成的是混合 物，導致混合物的形成條件、保存以及標準化都帶來非常大的困難。
[0003] 單鏈抗體（single chain of variable fragments,scFv)由于具備革巴向性好、分 子量小、穿透性強等特點而被用作siRNA載體。由于scFv與siRNA結合性較差，常需要一個多 肽充當連接器。其中富含堿性氨基酸具備與核酸結合功能的魚精蛋白截短體(truncated protamine，tp)是最常見的連接器。具體方法就是將scFv與tp通過基因重組獲得scFv-tp融 合蛋白。scFv-tp同時具有scFv的革El向性和tp的siRNA結合性，從而成為穩(wěn)定的siRNA遞送載 體。scFv-tp依托scFv的特異性，通過與細胞表面的特異性受體結合進而將siRNA遞送至靶 細胞內(nèi)，減少了siRNA的脫靶效應。早在2005年，Song等就用gpl60-scFv(F105)與tp的融合 蛋白F105-P作為載體將EGFP siRNA遞送至小鼠體內(nèi)被HIV感染的CD4T細胞中，有效地沉默 目的基因的表達，抑制了HIV病毒復制，并且在動物模型中，F(xiàn)105-P介導的多種原癌基因 siRNA的體內(nèi)遞送也收獲巨大的成功（Song E，Zhu P，Lee SK，Chowdhury D，Kussman S, Dykxhoorn DM,et al.Antibody mediated in vivo delivery of small interfering RNAs via cell-surface receptors.Nat Biotechnol.2005;23:709-17·)。這些結果強有 力的證明了 scFv-tp作為siRNA載體在體內(nèi)遞送的可靠性和高效特異性。之后，Yao等用類似 的方法用人類表皮生長因子2(human epidermal growth factor receptor 2，Her2)受體 的scFv^p融合蛋白將PLKl-siRNA成功遞送至Her2+的乳腺癌細胞系中，并且在動物模型中 也能有效地抑制腫瘤的增殖和轉移(Yao YD，Sun TM，Huang SY，Dou S，Lin L，Chen JN，et al. Targeted delivery of PLKl-siRNA by ScFv suppresses Her2+breast cancer growth and metastasis.Science translational medicine.2012;4:130ra48.) 〇在這些 應用中，都用到了基因技術，包括基因克隆、細菌表達、分離純化等復雜步驟，過程復雜、技 術難度大，對人體和環(huán)境還可能帶來一些安全問題。
[0004] 由上可見，多肽或者蛋白可以作為核酸的載體，用于把短的siRNA帶入體內(nèi)，發(fā)揮 其基因沉默作用，特異性的沉默靶基因的表達從而達到治療的目的。為了更好地發(fā)揮多肽 的載體作用，還需要克服一系列的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種多肽和核酸偶聯(lián)的化合物，其中多肽結構部分賦予其靶 向性，引導該化合物定向達到靶分子，核酸作為效應分子，可以沉默目的基因，抑制腫瘤的 生長，發(fā)揮腫瘤治療作用。
[0006] 本發(fā)明的多肽和核酸偶聯(lián)化合物包括共價連接的多肽和核酸兩部分，其結構如下 式I所示"
[0007；
[0008] 式I中，nucleic acid代表核酸，是具有治療效應的分子，如siRNA、反義核酸、 aptamer(核酸適配體)等；多肽部分是[D-Lys6]GnRH(見序列表中SEQ ID No:l)，具有革巴向 作用，通過D-Lys殘基上的一個氨基與式I中所示羰基形成酰胺鍵。
[0009] GnRH(Gonadotropin_Releasing Hormone，促性腺激素釋放激素）也稱作LHRH (Luteinising-hormone releasing hormone，促黃體激素釋放激素），是體內(nèi)自然存在的一 種激素，最初是從哺乳類下丘腦分離出的一種十肽激素，其基本生理功能是調(diào)節(jié)垂體前葉 促性腺激素的分泌，在控制和調(diào)節(jié)哺乳動物生殖功能中發(fā)揮重要作用。GnRH發(fā)揮其生物學 功能必須要通過GnRHR(GnRH-Receptor，GnRH受體)來介導。GnRHR屬于類視紫紅質(zhì)G蛋白偶 聯(lián)受體家族(GPCR)中的一員，是具有7次跨膜結構的蛋白受體。近年的研究發(fā)現(xiàn)，卵巢、子宮 內(nèi)膜、前列腺、等生殖系統(tǒng)腫瘤細胞表面均有GnRH結合位點，GnRH受體(GnRHR)表達量較高， 而高表達的GnRHR是為抗腫瘤治療提供了潛在靶點。GnRH類似物已經(jīng)被廣泛用于生殖系統(tǒng) 疾病的治療，其中以[D-Lys 6]GnRH為基本骨架的類似物最為常見。而siRNA作為一種廣泛存 在的基因調(diào)控機制，理論上可以沉默任何高表達的基因。腫瘤通常都會找到一些腫瘤相關 基因的高表達，這些基因的表達對腫瘤的生長、轉移起重要作用，如果敲除這些基因，能夠 有效地抑制腫瘤的生長和轉移。在本發(fā)明的一些具體實施例中，通過[D-Lys 6]GnRH作為靶 分子，把效應分子siRNA帶到表達GnRH受體的腫瘤細胞，以siRNA特異性的模式沉默腫瘤相 關基因，達到靶向治療腫瘤的目的。
[0010]本發(fā)明的多肽和核酸偶聯(lián)化合物是通過如下方法制備的:在作為效應分子的核酸 和作為靶分子的多肽上分別引入炔烴基團和疊氮基團，然后通過click點擊化學反應，形成 均一穩(wěn)定的化合物。反應式如下所示：
[0011
[0012] 上述CI ick點擊化學反應可以以二甲亞砜(DMSO)、叔丁醇（t-BuOH)和水作為溶劑， CuS〇4 · 5H2〇-TBTA配合物和抗壞血酸鈉作為催化劑，室溫下反應2~5小時。
[0013]為了方便GnRH的疊氮修飾，在GnRH的第六位通過多肽合成引入D-Lys，D-Lys的一 個氨基用于形成氨基酸殘基之間的肽鍵，另個氨基用于引入疊氮基團。[D-Lys6]GnRH與疊 氮戊酸發(fā)生?；磻?，從而在多肽上引入疊氮基團，反應方程式如下：
[0014]
L〇〇15」對于效應分子，在其5'或：T端偶聯(lián)上炔烴基團。例如對于一段siRNA雙鏈，為了減 少引入的炔烴基團對siRNA干擾效率的影響，采用亞磷酰胺的固相合成法，通過siRNA與3-丁炔-1-醇反應，從而將丁炔基引入核酸正義鏈的5 '末端或3 '末端。
[0016]通過c lick反應，將上述經(jīng)過修飾的多肽和核酸聯(lián)合到一起，再通過產(chǎn)物的分離純 化，最終獲得目標產(chǎn)物。
[0017]本發(fā)明通過在效應分子核酸上引入炔烴基團，在[D-Lys6]GnRH多肽上引入疊氮基 團，通過click反應，得到一個穩(wěn)定的化合物，該化合物保留了 [D-Lys6]GnRH的靶向性，和效 應分子核酸的基因沉默作用。作為特異性靶向藥物，本發(fā)明的多肽和核酸偶聯(lián)化合物可應 用于腫瘤的靶向治療。
【附圖說明】
[0018]圖1為實施例1中不同濃度的[D-Lys6(FITC) ]GnRH和細胞上受體的結合曲線。
[0019]圖2為實施例1中確定[D-Lys6(FITC) ]GnRH和細胞最佳結合濃度的驗證曲線。
[0020] 圖3顯示了實施例1中[D-Lys6(FITC) ]GnRH與普通GnRH競爭抑制實驗結果，橫坐標 代表8個實驗，從第1至第8個實驗[D-Lys6(FITC) ]GnRH與GnRH濃度比依次為1:0，I: I，1:2，1 :4，1:8，1:16，1:32和0:0〇
[0021] 圖4顯示了實施例1中[D-Lys6(FITC) ]GnRH和GnRHR抗體封閉抑制試驗結果。
[0022]圖5為實施例2合成化合物的化學反應式。
[0023] 圖6為實施例2合成的[D-Lys6]GnRH-siRNA用UPLC分離純化的色譜峰。
[0024] 圖7為實施例2合成的化合物[D-Lys6]GnRH-siRNA用UPLC-ESI-MS驗證的質(zhì)譜圖。
[0025]圖8顯示了實施例3驗證[D-Lys6]GnRH-siRNA具有生物學活性的實驗結果，說明該 化合物可以敲除目的基因。
[0026]圖9.顯示了實施例3測試[D-Lys6]GnRH-siRNA對靶基因沉默作用的量效關系的結 果。
[0027]圖10顯示實施例3中化合物[D-Lys6]GnRH-siRNA對靶基因的沉默作用可以通過封 閉細胞表面的受體而阻止，說明其沉默效果是受體依賴性的特異性沉默。
【具體實施方式】
[0028]以下通過實施例對本發(fā)明做進一步說明，以便更好地理解本發(fā)明，但本發(fā)明并不 局限于此。
[0029] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法;下述實施例中所 用的試劑、材料等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0030] 實施例1疊氮標記的GnRH多肽具有靶向性和特異性
[0031] 選取GnRHR高表達的Hela細胞作為實驗細胞，來驗證Hela細胞對不同濃度梯度的
[D-Lys6]GnRH的結合情況。將Hela細胞接種于6孔板中，待細胞匯合度達到70%~80%時， 分別加入不同濃度的熒光標記的[D-Lys6(FITC) ]GnRH(購自北京中科亞光生物科技有限公 司），6h后，用胰酶將細胞消化下來，離心棄上清;再用PBS重懸，離心棄上清（重復三次），去 除未結合的[D-Lys 6(FITC)]GnRH，最后加入0.5mL PBS，重懸，上流式細胞儀(BD公司）檢測， 流式結果使用Flowjo 7.6.1軟件進行分析，結果見圖1。從圖1可見，[D-Lys6(FITC) ]GnRH和 細胞上受體的結合是劑量依賴性的，直到把細胞上所有的受體都結合。緊接著，我們進一步 驗證了 [D-Lys6(FITC) ]GnRH飽和結合濃度，如圖2所示，當濃度達到300yg/mL時，平均熒光 強度達到最大值，隨著濃度增加，熒光強度不在相應增加，因此，我們判斷300yg/mL為飽和 結合濃度。
[0032]驗證完[D_Lys6]GnRH與Hela細胞結合的最佳濃度后，我們通過競爭性抑制實驗進 一步驗證了 [D-Lys6]GnRH與GnRHR的特異性。競爭抑制實驗又分為正常GnRH競爭抑制跟 GnRHR抗體競爭抑制。在以正常的GnRH作為競爭劑的抑制試驗中，先將Hela細胞接種于12孔 板中，在細胞匯合度達到70%~80%時，加入終濃度為300yg/mL的[D-Lys 6(FITC) ]GnRH，再 加入不同濃度比例的GnRH( [D-Lys6(FITC) ]GnRH與GnRH濃度比分別為1:0,1:1，1:2,1:4,1: 8，1:16，1:32以及0:0) Ah后，收集細胞，用I3BS洗三次，和上文一致，上流式細胞儀檢測。結 果如圖3所示，隨著GnRH比例的逐漸增加，平均熒光強度不斷降低，由此可以看出[D-Lys 6] GnRH與GnRH可以競爭性結合GnRHR，也即是說[D-Lys6]GnRH可以特異性結合GnRHR。
[0033] 在抗體抑制試驗中，將細胞平均分成三組，分別為control組，anti-GnRHR( + )組和 ant i -GnRHR (-)組。在細胞匯合度達到70%~80%時，Contro 1組不做任何處理;ant i -GnRHR (_)組加入終濃度為 300yg/mL 的[D-Lys6(FITC)]GnRH;anti-GnRHR( + )組提前用 5%BSA 在 37 °C條件下封閉30分鐘后用過量的GnRHR單克隆抗體再預處理2小時，再加入終濃度為300yg/ mL的[D-Lys6(FITC) ]GnRH Ah后，收集細胞，用PBS洗三次，上流式細胞儀檢測，結果如圖4所 示。從圖4可以看出，[D-Lys6(FITC) ]GnRH多肽和受體的結合可以被抗體阻止。
[0034] 實施例2[D-Lys6]GnRH-siRNA的合成、分離、純化和驗證
[0035] 本實施例通過click反應合成[D-Lys6]GnRH-siRNA，然后通過UPLC對產(chǎn)物進行分 離純化，并通過UPLC-MS對產(chǎn)物進行驗證。
[0036] 實驗材料及試劑：[D_Lys6(azidopentanonicacid) ]GnRH(由北京中科亞光生物科 技有限公司合成），正義鏈5 '端丁炔基修飾的PLKl siRNA(正義鏈：5 ' -CH三C-CH2-CH2 (mU) GAAGAAGA(mU) (mC)A(mC) (mC) (mC) (mU) (mC) (mC) (mU) (mU)A dTdT-3 '（序列中 "m" 代表2 ' 位 甲氧基修飾即2'-0Me，下同，參見SEQIDNo:2)，反義鏈：5'-UAAGGAGGGUGAUCUUCUUCA dTdT-3'（SEQIDNo :3)，購自廣州銳博生物科技有限公司），二甲亞砜(DMS0)，CuS04·5H20， 叔丁醇（t _BuOH)，TBTA(tris(benzyltriazolylmethyl)amine)，UPLC，ESI_Orbitrap MS。
[0037] 色譜柱：Jupiter 300A 5u C18(150X4.6mm)
[0038] 合成步驟如下：吸取50yL，lOmmol/L的[D_Lys6(azidopentanonicacid) ]GnRH(溶 劑為DMSO/t-BuOH:3/1，體積比）加入至IOOyL 0·5mmol/L的SiRNA-CH2-CH2-C三CH水溶液中， 再分別加入4yL 0.1M的CuS〇4 · 5H2〇-TBTA配合物（體積比1/1)(配合物溶劑為出0/^30八-BuOH: 13.5/3.5/3，體積比）和4yL 0.8M的抗壞血酸鈉水溶液，室溫下攪拌三個小時?；瘜W反 應方程式見圖5。
[0039]反應結束后，使用3KD的超濾管(購自德國millipore)處理反應體系，收集截留物。 再使用UPLC進行分離純化，分離條件如下:流動相A = O.02M TEAA(三乙胺醋酸鹽，pH=7.4) 的H20/CH3CN(體積比95/5)溶液;流動相B = MeOH;洗脫梯度為100%A lmin，100/0~20/80 (八/13)3〇111；[11，100%13 6111；[11;流速：111117111；[11;進樣量：1(^1^分離純化的結果見色譜圖6。純化 完后凍干，加水溶解后再使用UPLC-ESI-MS驗證純化產(chǎn)物的分子量，結果見圖7，正義鏈測量 值 8912.68(111/2,2 = 4,2227.17;標準值8911.57)，反義鏈測量值7322.82(111/2,2 = 4， 1829 · 45;標準值7322 · 50)，總鏈測量值 16234 · 49(m/z，z = 6，2704 · 75;標準值 16234 · 07)。 [0040] 實施例3CLICK反應后的[D-Lys6]GnRH-siRNA活性驗證
[0041 ] 為了驗證click反應后的產(chǎn)物[D-Lys6]GnRH-siRNA的生物學活性，我們通過將[D-Lys6]GnRH_siRNA轉染Hela細胞后通過qPCR來檢測plkl的表達水平來驗證。Hela細胞在轉 染前一天接種至24孔板中，每孔細胞數(shù)目為5 X 104,轉染時要求細胞密度能達到30%~ 50%。轉染時將細胞平均分為四組，分別為空白組(Blank)、陰性對照組(NC)、PLK1組(P+)和 click產(chǎn)物組(Click+)?？瞻捉M不經(jīng)過任何處理，陰性對照組使用lipofectamine 2000(以 下簡寫為lip2000)轉染穩(wěn)定的無關序列的siRNA(正義鏈5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3' (SEQIDNo :4);反義鏈：5'-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3'（SEQIDNo :5))，P+組用 lip2000轉染正常的PLKlsiRNA(正義鏈5 ' -(mU)GAAGAAGA(mU) (mC)A(mC) (mC) (mC) (mU) (mC) (mC)(mU)(mU)A dTdT-3'（SEQ ID No:2);反義鏈：5'-UAAGGAGGGUGAUCUUCUUCAdTdT-3'（SEQ ID如：3))，(：1丨^^+組使用1丨？2000轉染(31丨^^產(chǎn)物[0-1^8 6]611冊-8丨1?嫩，各組8丨1?嫩的終濃 度為90nM。轉染后4h換液，30h進行細胞總RNA提取，進而再用qPCR來分析各組的PLKlmRNA的 表達含量。
[0042] 如圖8所示，P+組跟click+組相比于NC組PLKlmRNA水平顯著性降低(p〈0.01)，且P+ 與click+組無顯著性差異，實驗結果表明，click產(chǎn)物[D-Lys6]GnRH-siRNA具有完整的 PLKl s iRNA生物學活性的基礎。
[0043] GnRH-s iRNA 特異性驗證
[0044] 本實驗主要目的是驗證click產(chǎn)物[D-Lys6]GnRH-siRNA是否保留了 GnRH作為載體 的特異性。
[0045] 同上，我們也是運用了qPCR的方法來驗證click產(chǎn)物[D-Lys6]GnRH_siRNA是否可 以借助自身的[D_Lys6]GnRH的特異性而穿透細胞膜進入細胞內(nèi)起到特異性的沉默作用。首 先，我們探索了 [D-Lys6]GnRH-siRNA的特異性沉默PLKl的量效關系，將Hela細胞接種于24 孔板，當細胞匯合度到達50%時，直接加入不同終濃度的[D-Lys6]GnRH-siRNA(終濃度分別 為3〇1^，6〇1^，90碰，12〇1^，15〇1^)，3011后，進行總1?祖提取以及9?0?分析，量效關系結果如 圖9所示，當[D-Lys 6]GnRH-siRNA濃度達到90nM時，PLKl沉默效果最佳。
[0046]細胞平均分為四組，分別為1313111<:組，？11<:1組，(]1;[01^1'0組以及(]1;[01<:+3111:;[組。 Blank組不做任何處理;Plkl組將正常的PlklsiRNA在不加載體的情況下直接加入培養(yǎng)基中 (終濃度為90nM);Clickpro組是將click產(chǎn)物[D-Lys 6]GnRH-siRNA(終濃度為90nM)直接加 入培養(yǎng)基中；Click+anti組將細胞提前用5%BSA在37°C條件下封閉30分鐘后，用過量的 GnRHR單克隆抗體再預處理2小時提，移除抗體，加入新鮮培養(yǎng)基，再加入[D-Lys6]GnRH-siRNA(終濃度為90碰）。2411后，提取總RNA，繼而進行qPCR實驗和分析。結果見圖10,首先， Clickpro組相比于Plkl組，PLKlmRNA水平顯著性降低，說明[D-Lys6]GnRH-siRNA可以不借 助載體亦能沉默目的基因的表達，其次，Clickpro組相比于Cl ick+anti組，PLKlmRNA水平也 顯著性降低，也就是說[D-LyS6]GnRH-siRNA對靶基因的沉默作用可以通過封閉細胞表面的 受體而阻止，說明其沉默效果是受體依賴性的特異性沉默。
【主權項】
1. 一種多肽和核酸偶聯(lián)化合物，包括共價連接的多肽和核酸兩部分，其結構式I所示：式I中，nucleic acid代表核酸，多肽部分是[D-Lys6]GnRH，其D-Lys殘基上的一個氨基 與式I中所示羰基形成酰胺鍵。2. 如權利要求1所述的多肽和核酸偶聯(lián)化合物，其特征在于，所述核酸的連接位置在其 5'端或3'端。3. 如權利要求1所述的多肽和核酸偶聯(lián)化合物，其特征在于，所述核酸是siRNA、反義核 酉愛或aptamer。4. 如權利要求3所述的多肽和核酸偶聯(lián)化合物，其特征在于，所述核酸是PLK1 siRNA。5. 權利要求1所述多肽和核酸偶聯(lián)化合物的制備方法，在核酸和多肽上分別引入炔烴 基團和疊氮基團，然后通過click點擊化學反應形成所述化合物，反應式如下：6. 如權利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述click點擊化學反應以二甲亞砜、叔 丁醇和水作為溶劑，CuS〇4 · 5H2〇-TBTA配合物和抗壞血酸鈉作為催化劑，室溫下反應2~5小 時。7. 如權利要求5所述的制備方法，其特征在于，首先合成[D-Lys6]GnRH多肽，然后將其與 疊氮戊酸發(fā)生?；磻?，從而在多肽上引入疊氮基團，反應式如下：8. 如權利要求5所述的制備方法，其特征在于，在核酸上引入炔烴基團的方式是采用亞 磷酰胺的固相合成法，通過siRNA與3-丁炔-1-醇反應，從而將丁炔基引入核酸正義鏈的5' 末端或3'末端。9. 權利要求1~4任一所述的多肽和核酸偶聯(lián)化合物在制備特異性靶向藥物中的應用。10. 如權利要求9所述的應用，其特征在于，所述特異性靶向藥物為腫瘤治療藥物。
【文檔編號】C07K7/06GK105859834SQ201610224190
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年4月12日
【發(fā)明人】李軍, 陳中華, 朱德生
【申請人】北京大學