專利名稱：用于增強疫苗免疫原性的肽、偶聯(lián)物及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及疫苗領(lǐng)域，例如抗癌癥或傳染性疾病的疫苗。特別是，本發(fā)明提供一種含有衍生于破傷風(fēng)毒素的肽的免疫原，當(dāng)施用于具有抗破傷風(fēng)毒素的抗體的受試者時，該免疫原用于誘導(dǎo)有效的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。
背景技術(shù)：
幾乎所有的新疫苗都沒有所需要的那樣有效，特別是當(dāng)感染已經(jīng)自行建立時。最好的疫苗是以經(jīng)驗觀察為基礎(chǔ)的。這些例如被殺死或減弱的微生物。一般的說，這種疫苗含有用于誘導(dǎo)有效的和保護性的免疫應(yīng)答所需的所有成分。然而，這些疫苗通常界定不明確。此外，它們含有許多未知的成分，作用機制通常在很大程度上不為人所知，它們不能可繁殖的被制備并且因此不能符合現(xiàn)代藥劑的標(biāo)準(zhǔn)。應(yīng)用它們僅由于目前無法獲得更好的。因為不能接受利用來自于天然的材料(即癌細(xì)胞)，在利用疫苗抵抗癌癥時情況甚至變得更 復(fù)雜。為了使疫苗引起保護性的抗微生物病原體的免疫應(yīng)答，例如樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的抗原提呈細(xì)胞(APC)需要攝取足夠有效的疫苗。APC必須將抗原內(nèi)化并將它們轉(zhuǎn)運至特定區(qū)域的引流淋巴結(jié)，在這里它們分別在MHC I類分子和MHC II類分子上加工和提呈抗原肽用于活化CD8+T細(xì)胞和0)4+T細(xì)胞(Zinkernagel等(1999) Immunol Rev156:199-209;Banchereau 和 Steinman(1998)Nature 392:245-252)。然而，由于APC攝取不足，幾種疫苗有有限的免疫原性，即使它們由在人中為抗原的蛋白質(zhì)所組成。攝取不足可能是因為溶液中的許多免疫蛋白以及微粒子疫苗缺少能夠被APC識別用于進(jìn)行內(nèi)化和加工的標(biāo)記，因此這種疫苗的攝取僅由隨機的內(nèi)噬作用介導(dǎo)進(jìn)入APC，從而使得疫苗的有效性降低(Abdel-Motal 等(2009) Vaccine 27:3072-3082)。當(dāng)施用作為具有與其相應(yīng)的IgG抗體的免疫復(fù)合物的疫苗時，諸如破傷風(fēng)毒素的微生物疫苗的免疫原性顯示被促進(jìn)(Raveth和Clynes (1998) AnnuRev Immunol16:421-432;Schuurhuis 等(2002)J Immunol 168:2240-2246;Gosselin 等(1992)JImmunol 149:3477-3481)。然而，不利的是，這種免疫復(fù)合物必須由具有Fe結(jié)構(gòu)域的抗體形成，該Fe結(jié)構(gòu)域能有效的結(jié)合到APC上的Fe-伽馬受體，然而許多單克隆抗體的Fe結(jié)構(gòu)域與APC上的Fe-伽馬受體的相互作用薄弱。另外一個不利的是在這個復(fù)合物中免疫顯性肽表位可能是被掩蓋的，因而導(dǎo)致了弱的免疫原性。WO 2008/118487論述了另外一種增強疫苗免疫原性的方案，其中，公開了一種載有a -gal表位(Gal a l-3Gal β 1_4 (3) GlcNAc-R)的流感病毒，導(dǎo)致了增強的病毒顆粒子對APC的靶向定位以及升高的對流感的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。然而，與合成常規(guī)的肽相比，合成a -gal表位更加困難，其結(jié)果是更加昂貴。Volk 等(1984，Infect. Immun. 45:604-609)公開了含有毒素重鏈 N-末端部分的破傷風(fēng)毒素片段及其抗體，該毒素重鏈N-末端部分含有序列GITELKKL，該序列如在SEQ IDNO 3所示的覆蓋該毒素重鏈第383至第390位殘基。
Raju等(1996, J. Autoimmun. 9:79_88)公開了每個長度為20個殘基的重疊合成肽，用于確定人類⑶4+T細(xì)胞的表位組成成分。其中一個覆蓋破傷風(fēng)毒素重鏈的第371-390位的殘基，完整的含有序列GITELKKL的肽被所述細(xì)胞識別。Demotz等(1989，J. Immunol. 142:394-402)公開了結(jié)合于破傷風(fēng)毒素B片段以及含有序列GITELKKL的重組片段744-1315和604-1315的單克隆抗體。Engstrom等(J. Immunoassays 16:231-245)公開了一種“妝20”,含有序列GITEL，可以被人類抗體IgG和IgA識別。WO 2004/000873公開了一種偶聯(lián)物，該偶聯(lián)物含有衍生自破傷風(fēng)重鏈序列830-843的含有序列GITE的破傷風(fēng)表位。
Fischer 等(1994，Mol. Immunol. 31:1141-1148)公開了來自于小鼠和兔的破傷風(fēng)類毒素抗體的表位圖譜，并且公開了來自于覆蓋破傷風(fēng)類毒素重鏈的350-400位殘基的區(qū)域的六肽表現(xiàn)出與抗體高度的反應(yīng)性。然而，現(xiàn)有技術(shù)均沒有教導(dǎo)或表明含有來自于破傷風(fēng)毒素的線性表位的肽，人群中頻繁出現(xiàn)抵抗破傷風(fēng)毒素的循環(huán)抗體?，F(xiàn)有技術(shù)也沒有教導(dǎo)或表明利用這些肽來偶聯(lián)需要免疫應(yīng)答以對其進(jìn)行抵抗的抗原，以便于提高誘導(dǎo)期望的免疫應(yīng)答的效率。因此，本技術(shù)領(lǐng)域仍需要增強疫苗免疫原性的方法和手段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一種實施方式涉及一種偶聯(lián)物，該偶聯(lián)物含有偶聯(lián)于抗原、免疫原或含有抗原或免疫原的載體的肽，其中，所述肽含有(i )具有氨基酸序列GITELKKL的SEQ IDNO 3的至少10個氨基酸殘基；或，(ii)與(i)中提供的氨基酸序列有至少80%序列一致性的氨基酸系列，并且其中，當(dāng)將肽施用于來自至少10名已用破傷風(fēng)類毒素接種的人類受試者的血清樣本時，如在破傷風(fēng)毒素或類毒素酶聯(lián)免疫法(Tettox ELISA)中確定的，肽在至少50%的血清樣本中通過來自于血清樣本的抗體結(jié)合；并且其中，所述肽不是破傷風(fēng)毒素β鏈。在第二種實施方式中，所述肽含有少于100個的氨基酸殘基。第三種實施方式涉及根據(jù)第一種或第二種實施方式所述的偶聯(lián)物，其中，抗原、免疫原或含有抗原或免疫原的載體偶聯(lián)于所述肽的C-末端。第四種實施方式涉及根據(jù)前述實施方式所述的偶聯(lián)物，其中，2至20個肽結(jié)合于抗原、免疫原或含有抗原或免疫原的載體。第五種實施方式涉及根據(jù)前述實施方式所述的偶聯(lián)物，該偶聯(lián)物作為藥劑使用。優(yōu)選地，這種偶聯(lián)物在具有抗破傷風(fēng)毒素或破傷風(fēng)類毒素的抗體的受試者中作為藥劑使用。更優(yōu)選地，該藥劑為預(yù)防性的或治療性的疫苗。第六種實施方式涉及根據(jù)第一種至第四種實施方式中任意一種實施方式所述的偶聯(lián)物，用于在受試者中預(yù)防或治療癌癥或傳染性疾病。第七種實施方式涉及根據(jù)第一種至第四種實施方式中任意一種實施方式所述的偶聯(lián)物在制造用于在受試者中預(yù)防或治療癌癥或傳染性疾病的藥劑中應(yīng)用。優(yōu)選地，所述偶聯(lián)物在具有抗破傷風(fēng)毒素或破傷風(fēng)類毒素的抗體的受試者中作為藥劑使用。在第八種實施方式中，所述偶聯(lián)物在施用所述偶聯(lián)物至少兩周前已被施用用于產(chǎn)生破傷風(fēng)毒素的循環(huán)抗體的疫苗的受試者中作為藥劑使用。在第九種實施方式中，所述偶聯(lián)物或其作為藥劑的應(yīng)用用于抗體介導(dǎo)的抗原靶向作用(antigen-targeting)ο在第十種實施方式中，所述偶聯(lián)物或其作為藥劑的應(yīng)用用于癌癥的治療，其中，所述治療進(jìn)一步含有外科手術(shù)、化學(xué)療法和/或放射療法。在第十一種實施方式中，所述偶聯(lián)物或其作為藥劑的應(yīng)用用于治療已經(jīng)用破傷風(fēng)類毒素免疫的具有抗破傷風(fēng)毒素或破傷風(fēng)類毒素的抗體的，已經(jīng)具有針對破傷風(fēng)的暴露后預(yù)防和/或已經(jīng)患有破傷風(fēng)的受試者。在第十二種實施方式中，在本發(fā)明所述的偶聯(lián)物中，抗原或免疫原含有T細(xì)胞表位。更優(yōu)選地，抗原或免疫原含有細(xì)胞毒性T細(xì)胞和/或輔助性T細(xì)胞表位。 在第十三種實施方式中，在本發(fā)明所述的偶聯(lián)物中，肽和抗原，免疫原或含有抗原或免疫原的載體通過連接體偶聯(lián)。優(yōu)選地，所述連接體是氨基己酸-生物素化的賴氨酸。在另一種實施方式中，在本發(fā)明所述的偶聯(lián)物中，肽和抗原，免疫原或含有抗原或免疫原的載體是在沒有連接體的情況下偶聯(lián)在一起的。在優(yōu)選的實施方式中，在本發(fā)明所述的偶聯(lián)物中，肽和抗原，免疫原或含有抗原或免疫原的載體是通過共價鍵偶聯(lián)在一起的。在第十四種實施方式中，本發(fā)明涉及一種肽，所述肽含有(i)具有氨基酸序列GITELKKLES的SEQ ID NO :3中的至少12個氨基酸殘基；或，(ii )與(i )中提供的氨基酸序列有至少80%序列一致性的至少12個氨基酸殘基的氨基酸序列，并且其中，當(dāng)將肽施用于來自至少10名已用破傷風(fēng)類毒素接種的人類受試者的血清樣本時，如在Tettox ELISA中確定的，肽在至少50%的血清樣本中通過來自于血清樣本的抗體結(jié)合；其中,所述肽含有少于100個的氨基酸。在第十五種實施方式中，本發(fā)明涉及一種肽，所述肽含有(i)如SEQID NO :4_24的任意一個中提供的氨基酸序列；或( )與SEQ ID NO :4-24中提供的氨基酸序列有至少80%序列一致性的氨基酸序列，并且其中，當(dāng)將肽施用于來自至少10名已用破傷風(fēng)類毒素接種的人類受試者的血清樣本時，如在Tettox ELISA中確定的，肽在至少50%的血清樣本中通過來自于血清樣本的抗體結(jié)合。在第十六種實施方式中，本發(fā)明涉及根據(jù)第十五種實施方式所述的肽，其中，所述肽具有SEQ ID NO 24中提供的氨基酸序列或由SEQ ID NO 24中提供的氨基酸序列組成。在第十七種實施方式中，本發(fā)明涉及根據(jù)第十四種至第十六種實施方式中任意一種實施方式所述的肽，其中，所述肽含有少于50個的氨基酸殘基。在第十八種實施方式中，本發(fā)明涉及根據(jù)第十四種至第十七種實施方式中任意一種實施方式所述的肽，其中，所述肽在SEQ ID NO 4或SEQ IDNO 24的C-末端含有另外的
氣基酸殘基。在第十九種實施方式中，本發(fā)明涉及根據(jù)第十八種實施方式所述的肽，其中，所述另外的氨基酸殘基不是衍生自破傷風(fēng)毒素β鏈。
具體實施例方式定義術(shù)語“免疫應(yīng)答”在此用于表征產(chǎn)生抗體和/或細(xì)胞(例如T淋巴細(xì)胞)，所述抗體和/或細(xì)胞用于直接抵抗，或者協(xié)助分解或抑制特定的抗原表位。短語“有效的免疫保護性應(yīng)答”、“免疫保護”以及類似的短語，為了本發(fā)明的目的，意思是在接種了疫苗的受試者中直接抵抗病原體的一個或多個抗原表位或抵抗癌細(xì)胞的一個或多個抗原表位以保護抵抗由病原體引起的感染或抵抗癌癥的免疫應(yīng)答。為了本發(fā)明的目的，保護抵抗由病原體引起的感染或保護抵抗癌癥不僅僅含有對感染或癌癥的完全的抵御，也含有例如與未接種過疫苗的感染的受試者相比，在接種了疫苗的受試者中由病原體引起的感染或癌癥的任何可探知的程度上或比例上的減輕，或任何可探知的由病原體引起的感染或癌癥所導(dǎo)致的疾病的嚴(yán)重性或任何癥狀或狀況的減輕。在癌癥情況下有效的免疫保護應(yīng)答也含有清除癌細(xì)胞，從而減小腫瘤的尺寸或甚至清除腫瘤。為了達(dá)到此目的，接種也被稱為治療性接種。可以在先前未受病原體感染和/或在疫苗接種時未受病原體感染以及未患有癌癥的受試者中誘導(dǎo)有效的免疫保護應(yīng)答。也可以在疫苗接種時已經(jīng)感染病原體或已經(jīng)患有癌癥的受試者中誘導(dǎo)有效的免疫保護應(yīng)答。
根據(jù)本發(fā)明，在此普遍使用的術(shù)語“抗原”表示任何特異性結(jié)合于抗體的分子。這個術(shù)語也表示任何可以被MHC分子結(jié)合并提呈給T細(xì)胞受體的分子或分子片段?？乖梢允抢绲鞍踪|(zhì)類分子，即多聚氨基酸序列，任意含有非蛋白基團如碳水化合物部分和/或脂類部分或抗原可以為例如非蛋白質(zhì)類的分子如碳水化合物。抗原可以為例如蛋白質(zhì)的任何部分(肽，部分蛋白質(zhì)，全長的蛋白)，其中，蛋白質(zhì)為天然產(chǎn)生或合成衍生，細(xì)胞組分(全細(xì)胞，細(xì)胞裂解物或破裂的細(xì)胞)，有機體(完整的有機體，裂解或破裂的細(xì)胞)或者碳水化合物或其它分子，或其部分，能夠在特定受試者中誘發(fā)抗原特異性的免疫應(yīng)答(體液和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答)，免疫應(yīng)答優(yōu)選能夠通過試驗或方法進(jìn)行測量。術(shù)語“抗原”在此可以用術(shù)語“免疫原”進(jìn)行替換，在此用于描述蛋白、肽、細(xì)胞組分、組織或其他誘發(fā)體液免疫和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答(即，是抗原的)的分子，使得免疫原施用于受試者(例如，通過本發(fā)明的疫苗)發(fā)動免疫原特異性的免疫應(yīng)答抵御在受試者組織中遇到的相同或相似的免疫原/抗原。因此，為了接種受試者抵抗特異性的抗原方法，在一種實施方式中，誘發(fā)免疫應(yīng)答抵御該抗原或其免疫原部分作為使用此種抗原的結(jié)果。接種優(yōu)選地導(dǎo)致防御或治療作用，其中，后續(xù)的暴露于抗原(或抗原的來源)誘發(fā)抵御抗原(或來源)的免疫應(yīng)答，該免疫應(yīng)答在受試者中降低或預(yù)防疾病或癥狀。接種的概念在本技術(shù)領(lǐng)域是為人所熟知的。與未施用疫苗的情況相比，由施用本發(fā)明的預(yù)防性的或治療性的組合物誘發(fā)的免疫應(yīng)答可以為在免疫狀況的任何方面的任何可探知的變化(例如，細(xì)胞應(yīng)答，體液應(yīng)答，細(xì)胞因子產(chǎn)生)。此處“表位”可以定義為足以在受試者中引起免疫應(yīng)答的在給定的抗原/免疫原中的單獨的免疫原的位點。本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識到T細(xì)胞表位的大小和組成與B細(xì)胞表位不同，并且T細(xì)胞表位通過MHC I類途徑來提呈不同于通過MHC II類途徑提呈的表位。依賴于免疫應(yīng)答的類型，表位可以是線性的序列或結(jié)構(gòu)性表位(保守結(jié)合區(qū)域)?？乖梢孕≈羻蝹€的表位，或更大，并且可以包括復(fù)合的表位。例如，抗原的大小可以小至5-12個氨基酸(例如，肽)并大至全長的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)含有多聚體和融合蛋白，嵌合蛋白，全細(xì)胞，完整的微生物，或它們的部分(例如，全細(xì)胞的裂解物或微生物的提取物)。此處所用的術(shù)語“抗體”的意思是能夠特異性的結(jié)合于特定抗原的免疫球蛋白分子或免疫球蛋白分子的片段。抗體對于免疫學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員是眾所周知的。
在此術(shù)語疫苗的“免疫原性”定義為有能力在受試者中誘導(dǎo)和活化T細(xì)胞(細(xì)胞毒性T細(xì)胞和輔助性T細(xì)胞)及誘發(fā)抗體產(chǎn)生。術(shù)語“抗體介導(dǎo)的抗原靶向作用”在此用于表示抗原傳遞系統(tǒng)，該系統(tǒng)利用通過在APC (例如樹突狀細(xì)胞(DC)和巨噬細(xì)胞)的細(xì)胞表面表達(dá)的Fe受體的抗體(例如IgG)介導(dǎo)的抗原靶向作用。通過利用抗原特異性的抗體，可以在體外和體內(nèi)形成這些抗體與蛋白質(zhì)抗原的復(fù)合物。這些復(fù)合物(稱為免疫復(fù)合物(IC))可以通過這些Fe受體結(jié)合于APC，及接下來被獲取，抗原被加工并且由其衍生的肽將被提呈給特異性的T細(xì)胞。重要的是，在抗體介導(dǎo)的抗原靶向作用中IC也將活化APC并且導(dǎo)致對特異性的T細(xì)胞的最適的刺激(Schuurhuis等，J Immunol. 168，2240-2246，2002)。因此,在抗體介導(dǎo)的抗原祀向作用中在人中循環(huán)的特異性抗體用于選擇性的定位抗原來刺激細(xì)胞免疫系統(tǒng)。在此處使用的術(shù)語“肽”被定義為氨基酸殘基的鏈，通常具有特定的序列。此處使用的術(shù)語肽是可以與術(shù)語“多肽”和“蛋白質(zhì)”互換的。在本發(fā)明的語境中，術(shù)語“肽”被定義為含有至少兩個通過修飾的或未修飾的肽鍵連接起來的氨基酸的任何肽或蛋白質(zhì)。術(shù)語 “肽”表示短鏈分子如寡肽類或寡聚體或表示長鏈分子如蛋白質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的肽可以含有修飾的氨基酸。因此，本發(fā)明的肽也可以通過天然過程修飾，如轉(zhuǎn)錄后修飾，或通過化學(xué)過程進(jìn)行修飾。這些修飾的一些例子為乙?；；珹DP核糖基化，酰胺化，與黃素共價結(jié)合，與血紅素共價結(jié)合，與核苷酸或核苷酸的衍生物共價結(jié)合，與修飾的或未修飾的碳水化合物部分共價結(jié)合，與脂質(zhì)或脂質(zhì)衍生物結(jié)合，與磷脂酰肌醇共價結(jié)合，交聯(lián)，環(huán)化，形成二硫鍵，去甲基化，形成半胱氨酸分子，形成焦谷氨酸鹽，甲?；?，Y-羧基化，羥基化，碘化，甲基化，氧化，磷酸化，外消旋化，羥基化等等。因此，任何對消除肽的免疫原性沒有作用的肽的修飾均在本發(fā)明的范圍內(nèi)。術(shù)語“序列識別”在此定義為兩種或多種氨基酸(肽或蛋白質(zhì))序列或兩種或多種核酸(多核苷酸)序列之間的關(guān)系，通過序列比對確定。通常，序列一致性和相似性的比對通過比對序列的全長進(jìn)行。本技術(shù)領(lǐng)域中，“一致性”同樣表示氨基酸或核酸序列之間的序列親緣關(guān)系的程度，根據(jù)情況確定，通過匹配這種序列的串來確定。兩種氨基酸序列之間的“相似性”通過將一種肽的氨基酸序列和它的保守的氨基酸替代物與第二種肽的序列進(jìn)行比較來確定?！耙恢滦浴焙汀跋嗨菩浴笨梢酝ㄟ^多種方法容易的測得，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。在優(yōu)選的實施方式中，如在此確定的，序列一致性通過比對序列的全長來確定。確定一致性的優(yōu)選的方法設(shè)計為在被測試序列之間給出最大的匹配。確定一致性和相似性的方法在公開可用的計算機程序中已被編撰。優(yōu)選的確定兩個序列的一致性和相似性的計算機程序方法包括例如 BestFit, BLASTP, BLASTN 和 FASTA (AltschuI，S. F.等，J. Mol.Biol.215:403-410(1990), publicly available from NCBI and other sources (BLASTManual, Altschul, S.,等，NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894)。被應(yīng)用的最優(yōu)選的計算程序為 EMBOSS(http://www. ebi. ac. uk/emboss/align)。用 EMBOSS 進(jìn)行氨基酸序列比對的優(yōu)選參數(shù)為缺口開放10. 0，缺口延伸0. 5，Blosum 62矩陣。用EMBOSS進(jìn)行氨基酸序列比對的優(yōu)選參數(shù)為缺口開放10. 0，缺口延伸0. 5，DNA全矩陣(DNA單位矩陣)。可選擇地，在確定氨基酸相似性的程度中，本領(lǐng)域技術(shù)人員也可以計算稱為“保守的”氨基酸替代，對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是清楚的。保守的氨基酸替代指的是有相似側(cè)鏈的殘基的相互替代。例如，有脂肪族側(cè)鏈的一組氨基酸為丙氨酸、纈氨酸，亮氨酸和異亮氨酸；例如，有脂肪族-羥基側(cè)鏈的一組氨基酸為絲氨酸和蘇氨酸；有含酰胺類側(cè)鏈的一組氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；有酸性側(cè)鏈的一組氨基酸是天冬氨酸和谷氨酸；有芳香族側(cè)鏈的一組氨基酸是苯丙氨酸，酪氨酸，和色氨酸；有堿性側(cè)鏈的一組氨基酸是賴氨酸，精氨酸和組氨酸；有含硫的側(cè)鏈的氨基酸為半胱氨酸和甲硫氨酸。優(yōu)選的氨基酸替代是用來自相同的保守氨基酸組中的氨基酸進(jìn)行氨基酸的替代。這些保守氨基酸組為丙氨酸-纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸-甲硫氨酸；苯丙氨酸-酪氨酸-色氨酸；賴氨酸-精氨酸-組氨酸；天冬酰胺-谷氨酰胺；天冬氨酸-谷氨酸；絲氨酸-蘇氨酸；甘氨酸-脯氨酸。在特定情況下，另一種保守氨基酸替代組為賴氨酸-甲酰賴氨酸(formyllysine)。術(shù)語受試者中的“腫瘤”或“癌癥”指的是具有例如不規(guī)則的生長或形態(tài)的特征的細(xì)胞的出現(xiàn)，包括不受控制的增殖，永生，有潛在的遷移性，迅速生長和增殖率，以及特異的形態(tài)特征。通常，癌細(xì)胞為腫瘤的形式，但是這種細(xì)胞也可以在受試者中以相互獨立的形式存在。“腫瘤”包括良性和惡性腫瘤。在本發(fā)明的語境中，“患者”或“受試者”可能是動物(包括人類)。優(yōu)選地，患者或受試者為人類。 術(shù)語“Tettox elisa”在此用于指明用于破傷風(fēng)類毒素抗體的特定的酶聯(lián)免疫法，在此做進(jìn)一步定義。本發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明人先前已經(jīng)指出形成的免疫復(fù)合物(IC)是非常有效的疫苗配方用于在小鼠中有效地引起T細(xì)胞免疫應(yīng)答(Schuurhuis等，J Immunol. 168，2240-2246，2002)。通過將蛋白質(zhì)抗原卵白蛋白(OVA)與抗OVA的抗體混合，發(fā)明人可以有效的將抗原靶向作用于樹突狀細(xì)胞(DC)，同時導(dǎo)致強的DC成熟。這些成熟的DC在體外交叉提呈OVA-衍生肽給⑶8T細(xì)胞并且在小鼠中基于免疫非常有效地引起⑶8+T細(xì)胞。重要的是，這些T細(xì)胞應(yīng)答可以在體內(nèi)控制腫瘤，當(dāng)這些IC預(yù)先載入DC時特別有效(Schuurhuis等，J Immunol176，4573-4580，2006)。用加載預(yù)先形成的IC的DC進(jìn)行免疫導(dǎo)致保護的腫瘤免疫，同時也對荷瘤小鼠有治療作用。體內(nèi)腫瘤控制取決于DC上活化的Fe受體的存在以及特異的CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞的誘導(dǎo)。這些發(fā)現(xiàn)顯示特異的抗體介導(dǎo)的抗原靶向作用于DC是誘導(dǎo)抗癌癥的T細(xì)胞免疫的高度有效的模式。本發(fā)明的發(fā)明人現(xiàn)在已經(jīng)驚奇的發(fā)現(xiàn)在小鼠中預(yù)先存在的循環(huán)抗體可以用于有效的引起特異性的T細(xì)胞增值?？拱肟乖璗NP (三硝基苯基基團結(jié)合于肽或蛋白質(zhì))的抗體通過用特異性的半抗原載體(TNP-BSA)的免疫來誘導(dǎo)。接下來用非相關(guān)的蛋白抗原與相同的半抗原(TNP-OVA)偶合攻擊被免疫的小鼠。發(fā)現(xiàn)與用沒有TNP的BSA接種的對照小鼠相比，抗非相關(guān)蛋白抗原OVA的T細(xì)胞應(yīng)答在這些小鼠中以更高的水平被誘導(dǎo)。這些發(fā)現(xiàn)提供了對原理的驗證即可以通過利用在接種時已經(jīng)存在的循環(huán)抗體來增強疫苗的免疫能力。由于小鼠和人的種間差異，必須靶向不同的循環(huán)抗體類群，并因此發(fā)明人提出了可以適用于人類的用于增強疫苗效力和免疫能力的肽。這種方法盡可能的模擬自然的免疫應(yīng)答，機體免疫系統(tǒng)使用該免疫應(yīng)答去除入侵的微生物，特別是感染和依靠機體細(xì)胞的微生物，如病毒和如結(jié)核桿菌的細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌。本發(fā)明的接種方法實際上對特異性免疫的兩個主要的裝備進(jìn)行了最好的利用，即血漿中預(yù)先存在的抗體和T細(xì)胞提供的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫。本發(fā)明利用抗體的Fe片段傳遞結(jié)合于抗體另一末端的抗原至抗原提呈細(xì)胞。之前的工作顯示這是將免疫原靶向抗原提呈細(xì)胞(APC)的最有效的方式之一，抗原提呈細(xì)胞即體內(nèi)起始免疫應(yīng)答的細(xì)胞，例如樹突狀細(xì)胞(DC)或巨噬細(xì)胞。針對本發(fā)明，DC是最重要的APC。并沒有希望與任何原理結(jié)合，似乎是由于抗原引發(fā)所需的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫是與定義的結(jié)合于血清中預(yù)先存在的抗菌的抗體的氨基酸物理相關(guān)的，抗原意外的集中對APC的前所未有的作用，例如，DC將會通過結(jié)合抗體的復(fù)合物與位于APC上的所謂的Fe受體的結(jié)合發(fā)生(見圖I)。這不僅提供非常有效的介導(dǎo)靶抗原(即病毒或腫瘤靶抗原)進(jìn)入APC，也誘導(dǎo)強烈的APC活化。這些事件對于介導(dǎo)強烈的治療性的細(xì)胞免疫應(yīng)答(T細(xì)胞應(yīng)答)是至關(guān)重要的，用于清除非正常細(xì)胞，比如腫瘤細(xì)胞或受病毒感染的細(xì)胞。實際上，在有抗體結(jié)合的復(fù)合物的小鼠的實驗中，結(jié)合于肽誘發(fā)T細(xì)胞應(yīng)答，與抵抗非結(jié)合成分的應(yīng)答相比，這種方法顯著地增強T細(xì)胞應(yīng)答。由于歷史原因，現(xiàn)代藥效學(xué)和藥物分散學(xué)很難應(yīng)用于疫苗?？紤]到傳統(tǒng)疫苗的復(fù)雜狀態(tài)，這并不意外，因為在人體內(nèi)追蹤每個主要由熱致死或減毒的有機體組成的傳統(tǒng)疫苗的分解產(chǎn)物，就成了一個幾乎不可能的任務(wù)。然而，這種論斷不適用于本發(fā)明的疫苗。第一，根據(jù)本發(fā)明的更接近藥物狀態(tài)的疫苗允許在體內(nèi)好得多的疫苗結(jié)局。第二，對新出現(xiàn)疫 苗的藥效學(xué)和藥物分散學(xué)研究對于開發(fā)其在適宜條件下的治療潛能是非常必要的。設(shè)計和測試新的疫苗的挑戰(zhàn)在于如何使其更具潛能從而將它們從純的預(yù)防疫苗當(dāng)中轉(zhuǎn)化出來，這很大程度上依靠中和抗體，轉(zhuǎn)化為具有誘導(dǎo)強烈的T細(xì)胞應(yīng)答并治療已形成的由感染(例如病毒腫瘤)引起的持續(xù)的感染和疾病的效力的，以及對如非病毒腫瘤的非感染的狀況有療效的治療性疫苗。肽根據(jù)本發(fā)明的肽，優(yōu)選為抗受試者中免疫應(yīng)答所需要的已獲得的循環(huán)抗體的分子。破傷風(fēng)毒素(TTx)，也稱為破傷風(fēng)痙攣毒素，痙攣毒素，TeTx，TeNT和TTX，是已知的最具毒性的蛋白質(zhì)中的一種。TTx是一種神經(jīng)毒素，由厭氧環(huán)境中的破傷風(fēng)梭菌(Clostridiumtetani)的無性生殖芽孢產(chǎn)生，能夠引起人類的破傷風(fēng)。它以通過半胱氨酸L428和HlO之間的二硫鍵以及非共價鍵的相互作用相連接的一條重鏈和一條輕鏈的形式存在。破傷風(fēng)類毒素(TTd)通過將TTx用福爾馬林的蛋白質(zhì)處理脫毒獲得。這種處理導(dǎo)致蛋白的多種修飾(例如，賴氨酸殘基側(cè)鏈的甲酰化作用和分子內(nèi)及分子間的交聯(lián)的形成)。盡管TTd為TTx的修飾型(且因此為一個不同的蛋白)TTd可以介導(dǎo)抗破傷風(fēng)的免疫保護，這表明由TTd接種引起的抗體可以識別TTx。本發(fā)明的發(fā)明人用來自于TTx氨基酸序列的的未修飾線性表位來尋找TTd抗體的線性表位。破傷風(fēng)毒素有1314個氨基酸(SEQ ID NO: I)并且由破傷風(fēng)以一個單獨的肽鏈合成，該肽鏈水解產(chǎn)生兩個片段，輕鏈(LC ;也被稱為α鏈)衍生自氨基末端(SEQ ID Ν0:2)，和重鏈(HC ;也被稱作β鏈)衍生于羧基末端(SEQ ID Ν0:3)。破傷風(fēng)類毒素(TTd)用于免疫，例如抵抗三種傳染病(白喉，百日咳(哮喘性咳嗽)，破傷風(fēng))的兒童DTP聯(lián)合疫苗或DTP脊髓灰質(zhì)炎疫苗。幾乎所有人在生命早期都曾免疫接種過破傷風(fēng)類毒素(TTd)，這是由于它包括于許多國家的兒童預(yù)防接種計劃的疫苗中。另夕卜，許多人在以后的生命中受到(TTd)的攻擊，這是由于抗破傷風(fēng)接種是在有疑似的潛在引起破傷風(fēng)感染的外傷后的常規(guī)程序。作為結(jié)果，抗破傷風(fēng)毒素/類毒素抗體在工業(yè)化國家特殊部分人類群體中出現(xiàn)。因此，由于原位構(gòu)建抗破傷風(fēng)毒素/類毒素抗體和含有TTx/TTd表位的偶聯(lián)物之間的免疫復(fù)合物，含有TTx/TTd表位的偶聯(lián)物(即根據(jù)本發(fā)明的肽)對APC的靶向作用可能被希望在這種疫苗中起作用。本發(fā)明的第一個方面涉及一種肽，所述肽含有(i)含有氨基酸序列GITELKKL的SEQ ID NO :3中的至少10個氨基酸殘基；或(ii)與(i)中提供的氨基酸序列有至少70、80,90或100%序列一致性的氨基酸序列，并且其中，當(dāng)將肽施用于來自于至少10位曾用破傷風(fēng)類毒素免疫接種過的人類受試者的血清樣本時，如在Tettox ELISA中確定的，肽在至少50%的血清樣本中通過來自于血清樣本的抗體結(jié)合；并且其中，肽不是破傷風(fēng)毒素β鏈。優(yōu)選地，(i)中的SEQ ID NO:3中至少10個氨基酸殘基為來自于SEQ IDN0:3的10個連續(xù)氨基酸。優(yōu)選地，與(i)中提供的氨基酸序列有至少70、80、90或100%序列一致性的氨基酸序列是10個氨基酸的至少7、8、9或10個氨基酸與含有氨基酸序列GITELKKL的SEQ IDNO:3中的10個連續(xù)氨基酸殘基有一致性的氨基酸序列。優(yōu)選地，根據(jù)上述(ii)的肽，施用于來自至少10、12、15、20、25、30、40、50、60、70、100,150,250或更多的人類受試者的血清樣本。更優(yōu)選地,血清樣本來自于具有高效價抗-TTd抗體的人類受試者，例如，由后面描述的Tettox ELISA測定的每毫升至少100國際單位(IU)。在優(yōu)選的實施方式中，人類受試者為隨機選擇的人類受試者，優(yōu)選地，隨機選擇·的人類受試者有如上所述的高效價的抗-TTd抗體。Tettox ELISA優(yōu)選以下述方式進(jìn)行包覆有抗生素的96孔板(優(yōu)選來自于Euro-Diagnostica, Arnhem,荷蘭)。包覆有抗生素的96孔板用含有5%BSA的PBS固定(200 μ I/孔，I小時，室溫)。然后，用含有O. 05%吐溫20的PBS清洗孔板3次。生物素化肽的涂布方式為，以2 μ g/mL的濃度溶解于含有1%BSA的PBS，以100 μ I/孔涂布孔板，室溫孵育I小時?？装逵煤蠴. 05%吐溫20的PBS清洗3次，接下來用已經(jīng)至少用含有1%BSA的PBS稀釋100、200、400、500或1000倍的并且優(yōu)選為不多于100000、10000、7500、5000或2500倍的100 μ I來自于如上所述的人類受試者的血清(優(yōu)選地，具有高效價的抗-TTd抗體)于室溫孵育I小時。然后用含有O. 05%吐溫20的PBS清洗孔板3次。每個孔用連接了辣根過氧化物酶的抗體(小鼠抗人IgG-HRP單克隆抗體，克隆G18-145，產(chǎn)品代碼555788，Becton Dickinson, 1000X稀釋于含有O. 05%吐溫20的PBS，100 μ I/孔)孵育I小時，然后用含有O. 05%吐溫20的PBS清洗孔板3次。利用
2,2' _連氮基_雙-(3-乙基苯并噻唑啉橫酸)(2，2' -azino-di-(3-ethylbenzthiazoline sulfonic acid) )，ABTS+H2021/1000，100 μ I/孔進(jìn)行顯影。用 BIO-RAD，680 型，全自動定量繪圖酶標(biāo)儀在415nm測量光密度。在每個板中，優(yōu)選包括有陰性對照，更優(yōu)選至少三次重復(fù)。優(yōu)選的陰性對照為來自于沒有能夠檢測的抗-TTd抗體的人類受試者的血清。另一種優(yōu)選的陰性對照為BSA溶液。如果根據(jù)上述(ii)的肽至少與受試的人類血清樣本中的40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、87、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99% 最優(yōu)選為 100% 的抗體相結(jié)合那么根據(jù)上述(ii)的肽為根據(jù)本發(fā)明的肽。如果特定血清樣本的測試光密度與陰性對照相比至少為2. 0，更優(yōu)選為2. 5,3. 0,3. 5或更多倍高于陰性對照的測試光密度，那么肽被認(rèn)為通過血清樣本中的抗體結(jié)合?？蛇x擇地，如果(ii)的肽可以被TetaQuin:忠(Sanquin, Amsterdam,荷蘭)存在的抗體結(jié)合，那么這個肽為根據(jù)本發(fā)明的肽。在如上所描述的TettoxELISA中，代替了來自于人類受試者的血清，可以用100 μ I已經(jīng)以800χ稀釋于含有1%BSA的PBS溶液中的TetaQuin,當(dāng)樣本的測試光密度與陰性對照相比至少為2. 0，更優(yōu)選的2. 5,3. 0,3. 5或更多倍高于陰性對照的測試光密度，那么肽被認(rèn)為通過TetaQmiKKi中的抗體結(jié)合。優(yōu)選地，Tettox ELISA中的所有測試均為重復(fù)進(jìn)行，更優(yōu)選為三次或更多次重復(fù)。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的肽含有FIGITELKKL (SEQ ID NO:4)、GITELKKLES(SEQID NO:5)或IGITELKKLE(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列。更優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的肽由FIGITELKKL (SEQ ID NO: 4) ,GITELKKLES (SEQ ID NO:5)或 IGITELKKLE (SEQ ID NO:6)的氨基酸序列組成。在一個實施方式中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的肽，所述肽含有(i)SEQID NO:4-24的任意一個中提供的氨基酸序列；或(ii)與SEQ ID NO:4-24中提供的氨基酸序列有至少70、80、90或100%序列一致性和/或至少70、80、90或100%序列相似性的氨基酸序列，并且其中，當(dāng)將肽施用于來自至少10名曾經(jīng)接種過破傷風(fēng)類毒素的人類受試者的血清樣本時，如上面所描述的Tettox ELISA中確定的，肽在至少50%的血清樣本中被來自于血清樣本的抗體結(jié)合。優(yōu)選地，所述肽在其N-末端不再含有其他的氨基酸殘基。更優(yōu)選地，本發(fā)明涉 及根據(jù)本發(fā)明的肽，其中，所述肽含有SEQ ID NO:24中提供的氨基酸序列。本發(fā)明的肽含有至少10個氨基酸殘基或由至少10個氨基酸殘基組成，優(yōu)選地，含有至少 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、40、45、50、55、60 或更多個氨基酸殘基或由至少 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、40、45、50、55、60 或更多個氨基酸殘基組成。然而在另外的實施方式中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的肽，其中，所述肽含有少于100個氨基酸殘基或由少于100個氨基酸殘基組成，更優(yōu)選地，含有少于90、80、70、60、50、40、30、20個氨基酸殘基或由少于90、80、70、60、50、40、30、20個氨基酸殘基組成。更優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的肽由18個氨基酸殘基組成，且最優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的肽由SEQ ID N0:24組成。在另一實施方式中，本發(fā)明的肽中的氨基酸殘基被其他的氨基酸殘基所取代，優(yōu)選的被如前面進(jìn)一步定義的保守氨基酸殘基所取代。本發(fā)明的肽中的氨基酸殘基是被取代的，優(yōu)選的在SEQ ID N0:3的381、382、386-390、392-398位點的氨基酸殘基被取代?？蛇x擇地或與至少一種前述實施方式相結(jié)合，本發(fā)明涉及一種實施方式，其中，肽在SEQ ID NO:4-24的C-末端含有另外的氨基酸殘基。在另一實施方式中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的肽，其中，另外的氨基酸殘基并非衍生于破傷風(fēng)毒素或破傷風(fēng)毒素β鏈。在另一實施方式中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的肽，其中，所述肽由權(quán)利要求1-3中任意一項所述的氨基酸序列組成。在另一實施方式中，本發(fā)明的肽為表2中所不的肽,有大于O. 2、0. 25、0. 35、0. 45、O. 6,0. 75,0. 8,0. 85,1. 0,1. 05,1. I 或 I. 15 的 OD值；表 3 中所示的肽有大于 O. 3,0. 35,0. 4、O. 75,1. 0,1. 15,1. 45,1. 5,1. 55,1. 65,1. 7,1. 85、1. 9 或 2. O 的 OD 值；表 5 中所示的肽有大于 O. 16,0. 18,0. 3,0. 38,0. 62,0. 65,0. 7,0. 71,0. 85,0. 88,0. 9,0. 91 或 I. O 的 OD 值；或表6中所示的肽有至少一個TetaQuinK或血清034960的OD值大于O. 37,0. 41,0. 7,0. 72,0. 8、
O.83,0. 88,0. 9,0. 95,0. 97,1. 01,1. 02,1. 04 或 I. I。這些 OD 值是根據(jù)本文另外一處所描述的利用TeiaQuin⑩的Tettox ELISA所測得的。本發(fā)明另外提供一種制備本發(fā)明的肽的方法，本發(fā)明的肽優(yōu)選通過化學(xué)合成和接下來的純化(例如，見實施例)所制備。本發(fā)明蛋白質(zhì)的肽的獨立殘基可以通過肽鍵或肽鍵模擬(mimetic)結(jié)合而成。本發(fā)明的肽鍵模擬包括被本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的肽骨架修飾。這種修飾包括酰胺氮、α-碳、氨酰羧基、氨酰鍵的完全取代、延長、截短或骨架交聯(lián)。通常參見，斯帕托拉，氨基酸的化學(xué)和生物化學(xué)，妝和蛋白質(zhì)，卷VIKSpatola, Chemistry and Biochemistry of AminoAcids, Peptides andProteins, Vol. VII) (Weinstein ed.，1983)。許多妝骨架修飾是已知的，包括，Ψ [CH2S]、Ψ [CH2NH]、[CSNH2]、Ψ [NHC0]、Ψ [COCH2]和 Ψ [ (E)或(Z) CH=CH]。以上所用的術(shù)語，是依照上述Spatola的建議的。在本文中，Ψ表示缺少一個酰胺鍵。取代酰胺基團的結(jié)構(gòu)在括號中詳細(xì)說明。 類氨基酸也可以在肽中結(jié)合。這里所用的“類氨基酸”是一個部分而并非自然產(chǎn)生的在構(gòu)象上和功能上替代本發(fā)明的肽的氨基酸。這種部分如果不影響肽與TTd以之前所定義的方式結(jié)合，那么其作用是作為氨基酸殘基的替代。類氨基酸可以包括非蛋白氨基酸，例如β _、Y _、δ -氨基酸，β -、Y -、δ -亞氨基酸(如哌啶-4-羧酸)還有許多L- α -氨基酸的衍生物。許多適合的類氨基酸是為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，它們包括丙氨酸環(huán)己酯，3-環(huán)己基丙酸，L-金剛烷丙氨酸，金剛烷乙酸及其類似物。另外，D-氨基酸可以認(rèn)為是模擬的。Morgan 和 Gainor 在(1989)Ann. Repts. Med. Chem. 24:243-252 中討論了適用于本發(fā)明的肽類似物。偶聯(lián)物在另一方面，本發(fā)明涉及一種偶聯(lián)物，含有前面所定義的肽和免疫原或含有免疫原的載體。優(yōu)選地，如前面所定義的肽的C-末端連接于免疫原或含有免疫原的載體。根據(jù)本發(fā)明的偶聯(lián)物可以用于改進(jìn)種類廣泛的疫苗，包括防御和/或治療傳染性疾病(例如，病毒或細(xì)菌疫苗)和(非病毒性的)癌癥(例如腫瘤疫苗)的疫苗。例如，本發(fā)明可以方便的應(yīng)用于抗如HIV，Ebola和SARS病毒的疫苗，防止如瘧疾的寄生性疾病并且抵御如多重耐藥金黃色葡萄球菌(MRSA )和多重耐藥結(jié)核菌的細(xì)菌。重要的是，利用本發(fā)明的肽引起抗破傷風(fēng)的免疫保護并非為本發(fā)明的意圖。準(zhǔn)確的說，本發(fā)明的肽以循環(huán)的抗TTd或抗TTx抗體結(jié)合，優(yōu)選強烈結(jié)合本發(fā)明的肽的的形式用于具有抗破傷風(fēng)的預(yù)先存在的免疫的受試者中。本發(fā)明的肽用于具有抗破傷風(fēng)的預(yù)先存在的免疫的受試者中用于運送免疫原和/或含有免疫原的載體到抗原提呈細(xì)胞(APC)以誘導(dǎo)和/或增強受試者抗該免疫原的能力。本發(fā)明的偶聯(lián)物中的免疫原可以是肽，蛋白質(zhì)片段，蛋白質(zhì)，糖和/或它們的結(jié)合。在本發(fā)明的一個實施方式中，所述免疫原是肽，這里是指免疫原性肽，以區(qū)別于與抗-TTd或抗-TTx抗體結(jié)合的肽(TTd抗體結(jié)合蛋白)。本發(fā)明的免疫原性肽用于介導(dǎo)和/或加強免疫應(yīng)答，優(yōu)選為T細(xì)胞應(yīng)答，由本發(fā)明的免疫原性肽中的T細(xì)胞表位所引發(fā)。由本發(fā)明的免疫原性肽介導(dǎo)和/或加強的優(yōu)選的T細(xì)胞應(yīng)答包括HLA I類限制性的細(xì)胞毒T細(xì)胞應(yīng)答和HLA II類限制性的輔助體細(xì)胞應(yīng)答中的至少一個。更優(yōu)選地，所述T細(xì)胞應(yīng)答同時由HLA I類限制性的細(xì)胞毒T細(xì)胞應(yīng)答和HLA II類限制性的輔助體細(xì)胞應(yīng)答組成，并且有利的是可以伴隨有B-細(xì)胞應(yīng)答。在一種實施方式中，本發(fā)明的免疫原性肽包括至少HLA I類表位和HLA II類表位，和/或至少HLA I類表位和HLA II類表位在至少兩個不同的免疫原性肽中一起實施。許多公開的文獻(xiàn)已經(jīng)指出，CD4+T細(xì)胞與II類表位提呈樹突狀細(xì)胞(DC)緊隨的進(jìn)行相互作用正調(diào)節(jié)⑶40配體。⑶4+Th細(xì)胞通過其⑶40配體與位于DC上的⑶40相互作用導(dǎo)致DC的活化?；罨腄C細(xì)胞顯示上調(diào)的共刺激分子和分泌CTL-促進(jìn)細(xì)胞因子，這不僅允許更多的由這種提呈MHC I類限制性表位的活化的DC引起的強的CD8+CTL應(yīng)答，也允許更多的強的 CTL 記憶應(yīng)答(Ridge 等 1998, Nature 393:474 ;Schoenberger 等 1998, Nature 393:480 ；Sun等2004，Nat. Immunol. 5:927)。為了強的抗腫瘤的CD8+CTL應(yīng)答需要CD40在DC上表達(dá)伴隨有長的(35個氨基酸)肽在Zwaveling等(2002, J. Immunol. 169 :350)中公開。目前發(fā)現(xiàn)在沒有包括有長表位的MHC II類表位誘發(fā)的CD4+Th應(yīng)答時，被弓丨發(fā)的CD8+CTL應(yīng)答的強度低，且存在時間短，完全缺乏⑶8+CTL記憶。在一種實施方式中，本發(fā)明的免疫原性肽包括多于一個HLA I類表位和/或多于一個HLA II類表位，和/或多于一個HLA I類表位和/或多于一個HLA II類表位在至少兩個不同免疫原性肽中結(jié)合應(yīng)用。在多于一個HLA I類表位和/或多于一個HLA II類表位出現(xiàn)在本發(fā)明的免疫原性肽中的情況下(或在至少兩個不同的免疫原性肽中實施)，多種不
同表位可以各自來自于一個并相同來源抗原，或者它們可以來自于多于一個的不同來源抗原。在它們來自于多于一個的不同來源抗原時，該多種抗原可以各自來自于一個和相同的病原體或相同的腫瘤/腫瘤細(xì)胞，或者他們可以來自于多于一種的不同病原體或來自于多于一種的腫瘤/腫瘤細(xì)胞。來自于傳染性因子(病原體)的抗原或腫瘤細(xì)胞可以衍生HLAI類表位和/或HLA II類表位，用于以下描述的本發(fā)明的免疫原性肽。HLA I類提呈的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)表位以及HLA II類T輔助表位是在細(xì)胞內(nèi)形成的，以已經(jīng)定義的細(xì)胞內(nèi)機制和序列的形式。首先，定義T細(xì)胞表位的主導(dǎo)事件為表位(或表位前體)通過細(xì)胞溶質(zhì)肽酶的酶解從本發(fā)明的免疫原性肽的側(cè)面蛋白區(qū)域釋放。多種肽酶，細(xì)胞溶質(zhì)和/或非細(xì)胞溶質(zhì)肽酶(如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)肽酶)可以參與免疫原性肽中表位從其側(cè)面區(qū)域的蛋白水解釋放。這種細(xì)胞溶質(zhì)肽酶包括例如多催化蛋白酶體(Rock等2004，Nat. Immunol. 5:670),其可能參與CTL表位N-末端以及C-末端的形成。在特定的情況下，蛋白酶體經(jīng)常參與CTL精確的C-末端的形成。由于許多氨基末端外肽酶(exo-peptidases)(如ERAP1，嘌呤毒素敏感性氨基肽酶，霉菌素水解酶及其它)位于細(xì)胞質(zhì)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)并且這些剪切酶(trimmingenzymes)有將N-末端延長的表位前體剪切為其精確的長度的能力，T細(xì)胞表位的氨基-末端的形成在一定程度上是可變的。其他參與加工來自于免疫原性肽的表位的肽酶包括如苯乙肼裂解酶(nardilysin)。由于胞質(zhì)甲拌磷寡肽(TOP) (EC
3.4. 24. 15)有通過釋放3-5個氨基酸將C-末端延長的表位前體剪切為其精確長度的能力，T細(xì)胞表位的C-末端的產(chǎn)生可以在一定程度上改變。在一種實施方式中，本發(fā)明的免疫原性肽包括以串珠的形式排列的兩個或更多個以上所描述的表位，借此表位(珠子)直接地連接在一起和/或通過連接序列連接。側(cè)面相接或連接肽/表位的氨基酸序列優(yōu)選包括本文所描述的嘌呤毒素可剪切位點。當(dāng)嘌呤毒素可剪切位點為表位的一部分時，在本發(fā)明的免疫原性肽中與表位側(cè)面相接或連接的中間隔氨基酸序列不需要出現(xiàn)。然而，在其他情況，不包括一個或更多個嘌呤毒素可剪切位點的間隔氨基酸序列，可以是長度為2、3、4、5、6、8、10、12、15或更多的氨基酸。間隔區(qū)氨基酸序列可以與或不與自然地側(cè)面相連于其來源抗原的表位的氨基端序列相連。在本發(fā)明的免疫原性肽的進(jìn)一步實施方式中，所述免疫原性肽含有不是自然產(chǎn)生的氨基酸序列，即在自然界中不存在但卻是人類調(diào)節(jié)和/或設(shè)計的產(chǎn)物。在該實施方式中，免疫原性肽將含有一個或更多個如上面所定義的HLA I類表位和/或HLA II類表位，為此這種表位優(yōu)選含有來自于傳染性因子和/或腫瘤的自然氨基酸序列。然而，側(cè)面相連和/或連接至少一個免疫原性肽中的表位和/或連接兩個免疫原性肽中的表位的免疫原性肽中的至少一個氨基酸序列并非來自于(自然產(chǎn)生的或野生型)衍生該表位的抗原和/或連接/側(cè)面相連氨基酸序列來自于與和其側(cè)面相連的表位并不結(jié)合的抗原內(nèi)的其他位點。在一個優(yōu)選方式中，該本發(fā)明的免疫原性肽連接/側(cè)面相連氨基酸序列含有如上所述的一個或多個蛋白酶切割基序。因此在根據(jù)發(fā)明的(疫苗)用于誘導(dǎo)T細(xì)胞應(yīng)答的免疫原性肽可以由包括一個或多個HLA I類表位和/或HLA II類表位組成,這些表位可以與包括上面所述的蛋白酶剪切基序的氨基酸序列側(cè)面相接或連接，蛋白酶剪切基序?qū)⒅笇?dǎo)表位從免疫原性肽的嘌呤毒素釋放，在合適的I或II類MHC分子中用于將表位提呈于細(xì)胞表面。在進(jìn)一步的實施方式中，本發(fā)明的免疫原性肽是合成肽。不可用的或浪費的多于100個氨基酸的自然蛋白質(zhì)的可以在體外有效合成的相關(guān)短肽的應(yīng)用對于醫(yī)療目的來說是高度優(yōu)選的。對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，肽的化學(xué)合成是常規(guī)操作并且已知多種合適的方法。 本發(fā)明的一個方面因此也涉及通過化學(xué)合成或在重組宿主細(xì)胞中制造本發(fā)明的免疫原性肽的方法。肽的化學(xué)合成也克服了完整蛋白制造所伴隨的問題，即難于標(biāo)準(zhǔn)化且需要廣泛的提純和質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。長度超過HLA I類和/或II類表位(如有以下所指出的長度)的免疫原性肽特別適用于作為疫苗復(fù)合物使用，這是由于它們有足夠的長度去被專門的抗原提呈細(xì)胞所攝取，特別是DC，如W002/070006中所解釋的，并且在含有HLA I和II類表位的細(xì)胞表面提呈發(fā)生前在DC細(xì)胞中被加工。所以，不利的通過在非抗原提呈細(xì)胞系統(tǒng)提呈極小的HLA I類表位的T細(xì)胞耐受的介導(dǎo)(如展示于Toes等，1996, Proc. Natl. Acad. Sci.美國93:7855和Toes等，1996，J. Immunol. 156:3911)，被通過采用本發(fā)明的有在此指出的長度的免疫原性肽避免(如Zwaveling等，2002，J. Immunol. 169:350所示)。為了清楚的目的，本發(fā)明的免疫原性肽優(yōu)選包括HLA I類提呈的表位和HLA II類提呈的表位中的至少一個。這些表位中的每一個都是可提成的并且在經(jīng)過本文所述的加工后將結(jié)合于出現(xiàn)于細(xì)胞表面的相應(yīng)特異HLA分子。每個HLA表位可以因此被命名為HLA結(jié)合和/或可提成表位。本發(fā)明的免疫原性肽和/或合成免疫原性肽的長度優(yōu)選為至少19、20、21、22、25、27、30、33、35、40或45個氨基酸并且優(yōu)選為不多于100、80、60、50個氨基酸。本發(fā)明的偶聯(lián)物中的本發(fā)明的TTd-抗體結(jié)合肽可以直接與免疫原偶聯(lián)，或可選擇地，該TTd-抗體結(jié)合肽可以與含有免疫原的藥劑可接受的微載體(nanocontainers)(載體)偶聯(lián)。在這種結(jié)合中，如該免疫原可以包裹于微載體中，例如納米粒，病毒體，脂質(zhì)體或納米水凝膠，由此TTd-抗體結(jié)合肽優(yōu)選與這種微載體共同偶聯(lián)。這種與微載體的偶聯(lián)可以直接的或通過任何已知的如鞘磷脂，聚乙二醇(PEG)或其他的多聚體的多聚體的偶聯(lián)試齊U。美國專利No. 6，372，250描述了制備這種含有定向的(PEG)脂質(zhì)體的制藥組合物的細(xì)節(jié)。因此，在優(yōu)選的實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的偶聯(lián)物是結(jié)合了制藥可接受的載體或至少含有載體蛋白，微載體，脂質(zhì)體，復(fù)合物系統(tǒng)，脂復(fù)合物系統(tǒng)，和聚乙二醇中的一種的偶聯(lián)物。將本發(fā)明中的TTd-抗體結(jié)合肽與免疫原或含有免疫原的載體相結(jié)合的大量方法為本領(lǐng)域所公知。這種方法例如 Hermanson (1996, BioconjugateTechniques, AcademicPress)在U. S. 6，180, 084和U. S. 6，264,914中描述的，并且包括如廣泛應(yīng)用于應(yīng)用免疫學(xué)中的將半抗原與載體蛋白連接的方法(見Harlow和Lane, 1988，" Antibodies:Alaboratory manual" ,Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)。被認(rèn)可的是，在一些情況下，TTd-抗體結(jié)合肽或免疫原可以失效或在依靠偶聯(lián)的情況下發(fā)揮作用，如，在偶聯(lián)過程或這里應(yīng)用的化學(xué)基團。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員獲得多種偶聯(lián)的方法后可以找到一種不影響或最少影響本體的功效或功能的偶聯(lián)方法。合適的將肽與免疫原或載體偶聯(lián)的方法包括例如碳二亞胺偶聯(lián)(Bauminger和Wilchek, 1980, Meth.Enzymol. 70:151-159)。可選擇地，免疫原或載體可以以Nagy等Proc. Natl. Acad. Sci.美國 93:7269-7273(1996);和 Nagy 等·，Proc. Natl. Acad. Sci.美國 95:1794-1799(1998)所描述的與TTd-抗體結(jié)合肽偶聯(lián)，其中的每一個通過引用的方式結(jié)合于本申請中。其他的可能合適的用于偶聯(lián)的方法為例如高碘酸鈉氧化接著合適反應(yīng)物的烷基化還原以及戊二醛交聯(lián)。其他用于交聯(lián)的便捷的方法為通過施陶丁格連接(Staudinger ligation),通過施陶丁格-貝爾托齊連接(Staudinger-Bertozzi ligation),通過利用硫代酸酯的化學(xué)偶聯(lián)，通過[2+3]-偶極環(huán)加成反應(yīng)(點擊化學(xué))，通過二硫化物橋連，以及此類的方法。特別有益的偶聯(lián)的方式可以在不僅TTd-抗體結(jié)合肽而且免疫原或載體也是(多)肽的情況下應(yīng)用。在這些情況下兩個個體可以以同時含有TTd-抗體結(jié)合肽和免疫原肽或載體的單個(多)肽鏈 的形式合成。除共價鍵外，根據(jù)本發(fā)明的偶聯(lián)物中免疫原或載體也可以通過非特異性的或特異性的蛋白-蛋白相互作用，非共價鍵結(jié)合和/或配位化學(xué)鍵直接偶聯(lián)于TTd-抗體結(jié)合肽分子，這種偶聯(lián)可以通過連接于免疫原或載體以及TTd-抗體結(jié)合蛋白的間隔或連接體被隨意的影響。在優(yōu)選的實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的偶聯(lián)物含有1-20，更優(yōu)選含有至少2、3、4、5、
6、7、8、9、10并且少于20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10個結(jié)合于抗原、免疫原或含有抗原或免疫原的載體的肽。更優(yōu)選地，所述偶聯(lián)物含有2-20，更優(yōu)選含有2-15、2-10、2-5，最優(yōu)選含有3或4個結(jié)合于抗原、免疫原或含有抗原或免疫原的載體的肽。在所述偶聯(lián)物含有含有抗原或免疫原的載體以及肽時，肽的數(shù)目可以比20高很多，例如多于100、200、300、400、500，優(yōu)選少于 800、700、600。主要含有肽的本發(fā)明的偶聯(lián)物優(yōu)選是可以溶解于生理可接受的水溶液中(如PBS)包括不多于60、50、40、35、20、10、5或0%DMS0。在這種溶液中，優(yōu)選的偶聯(lián)物在濃度至少為每毫升O. 5、I、2、4或8mg偶聯(lián)物時是可溶的?？蛇x地，本發(fā)明的多于一種的不同偶聯(lián)物的混合物在濃度至少為每毫升O. 5、1、2、4或8mg肽的此種溶液中是可溶的。預(yù)防和治療用途在另一方面，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的作為藥劑的偶聯(lián)物。更為優(yōu)選地，本發(fā)明涉及以上所定義的用于在有破傷風(fēng)毒素或破傷風(fēng)類毒素抗體受試者中作為藥劑使用的偶聯(lián)物。在優(yōu)選的實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的藥劑是預(yù)防或治療疫苗，更為優(yōu)選的是抗傳染性疾病或癌癥的藥劑或治療疫苗。在更優(yōu)選的實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的藥劑用于之前已進(jìn)一步定義的抗體介導(dǎo)的抗原祀向作用。而在另一方面，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的偶聯(lián)物，用于防御或治療受試者的癌癥或傳染性疾病。根據(jù)這個方面，本發(fā)明同樣也涉及利用根據(jù)本發(fā)明的偶聯(lián)物制造防御或治療受試者的癌癥或傳染性疾病的藥劑。因此本發(fā)明的偶聯(lián)物中的免疫原可以含有廣泛的來自于腫瘤和病原體(傳染性因子)的 HLA I 類和 / 或 II類表位。如腫瘤抗原如 MAGE、BAGE，、RAGE、GAGE、SSX_2、NY-ESO-1、CT-抗原、CEA、PSA、p53、XAGE和PRAME但同時有病毒介導(dǎo)的腫瘤抗原，包括人類乳頭狀瘤病毒(HPV)、卡波西氏肉瘤皰疹病毒(KSHV)、愛潑斯坦巴爾病毒誘導(dǎo)的淋巴瘤(EBV)。其他可以衍生本發(fā)明中應(yīng)用的表位的腫瘤病原體的例子是已知的伴隨癌癥的多個廣泛表達(dá)的自身抗原，包括如p53、MDM-2、HDM2和其他在p53通路中發(fā)揮作用的蛋白，如生存素、端粒末端轉(zhuǎn)移酶、細(xì)胞色素P450亞型IBl、Her-2/neu和⑶19以及所有稱為持家蛋白的分子?？梢杂帽景l(fā)明給予治療的癌癥選自于下面所列出的肺、結(jié)腸、食道、卵巢、胰腺、皮膚、胃、腦和頸、膀胱、肉瘤、前列腺、肝細(xì)胞、腦、腎上腺、乳腺、子宮內(nèi)膜、間皮瘤、腎、甲狀腺、血液、良性腫瘤、黑色素瘤、副甲狀腺、子宮頸、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、維爾姆斯瘤、睪丸、腦垂體和嗜鉻細(xì)胞瘤癌癥。此外，本發(fā)明的偶聯(lián)物中的免疫原可以含有來自于源自如病毒、細(xì)菌、真菌和原 生動物的傳染性因子的病原體的HLA I類和/或II類表位。引起感染或腫瘤的可以衍生來自于抗原的表位的致病病毒的例子包括肝炎(A、B或C)、肝炎病毒(如VZV、HSV- I、HAV-6、HSV- II和CMV、愛潑斯坦巴爾病毒)、腺病毒、SV40病毒(引起間皮瘤)、流感病毒、蟲媒病毒、?？刹《?、鼻病毒、柯薩奇病毒、冠狀病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、腮腺炎病毒、輪狀病毒、麻疫病毒、風(fēng)疫病毒、細(xì)小病毒屬、牛痘病毒、人T淋巴細(xì)胞白血病(HTLV)病毒、登革熱病毒、軟疣病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、狂犬病毒、JC病毒、蟲媒腦炎病毒(arboviralencephalitis virus)和人類免疫缺陷病毒(HIV病毒，如I和II型)，人乳頭狀瘤病毒(HPV)感染，更為詳細(xì)的HPV高腫瘤風(fēng)險型，包括HPV-16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58,59和68型。可以衍生來自于病原體的表位的引起感染的病原微生物包括李斯特菌屬(Listeria),埃希氏菌屬(Escherichia),衣原體屬(Chlamydia),立克次氏體細(xì)菌(Rickettsial bacteria),分歧桿菌(Mycobacteria),葡萄球菌(Staphylococci),鏈球菌(Streptocci)，肺炎(雙)球菌(Pneumonococci)，腦膜炎球菌(Meningococci)，淋球菌(Gonococci),克雷伯菌屬(Klebsiella),變形桿菌屬(Proteus),沙雷氏菌屬(Serratia),假單胞菌書(Pseudomonas),軍團兵桿菌屬(Legionella),白喉(Diphtheria),沙門氏菌屬(Salmonella)，桿菌(Bacilli)，引起霍亂、破傷風(fēng)、食物中毒、炭疽、鼠疫、鉤端螺旋體病和淋巴疾病的細(xì)菌?？梢匝苌鷣碜杂诓≡w的表位的引起感染的病原真菌包括念珠菌屬(Candida)(如白色念珠菌(albicans)、克柔念珠菌(krusei)、光滑念珠菌(glabrata)、熱帶念珠菌(tropicalis)),新型隱球菌(Cryptococcus neoformans),曲霉(Aspergillus)(如煙曲霉(fumigatus)、黑曲霉(niger)),毛霉菌目(Mucorales)真菌(毛霉屬(Mucor)、犁頭霉屬(Absidia)、根霉菌屬(Rhizopus)),申克氏孢子絲菌(Sporothrixschenkii),皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis),巴西芽生菌(Paracoccidioidesbrasiliensis),粗球抱子菌(Coccidioides immitis)和莢膜組織胞衆(zhòng)菌(Histoplasmacapsulatum)ο可以衍生來自于病原體的表位的引起感染的病原寄生蟲包括痢疾阿米巴(Entamoeba histolytica),結(jié)腸小袋纖毛蟲(Balantidium coli),福氏耐格里阿米巴(Naegleria, Fowleri ),棘阿米巴蜀(Acanthamoeba sp.),賈第蟲屬(Giardia Iambia),隱孢子蟲屬(Cryptosporidium sp.),卡氏肺孢子蟲(Pneumocystis carinii), _原蟲屬(Plasmodium vivax),巴貝蟲屬(Babesia microti),布氏維蟲(Trypanosomabrucei),克氏錐蟲(Trypanosoma cruzi ),利什曼原蟲屬(Leishmaniadonovani ),丐形蟲屬(Toxoplasmagondii)和痕原蟲(Plasmodium falciparis)。在優(yōu)選的實施方式中，受試者有抗破傷風(fēng)毒素或破傷風(fēng)類毒素的抗體?？蛇x擇地或與另一實施方式結(jié)合，在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，所述藥劑為用于預(yù)防或治療的疫苗?？蛇x擇地或與其他實施方式結(jié)合，在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，所述方法進(jìn)一步包括提供抗體來誘導(dǎo)針對破傷風(fēng)毒素的免疫應(yīng)答。優(yōu)選地，用于誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的疫苗的施用至少在施用偶聯(lián)物的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30或更多周前。優(yōu)選地，所述疫苗為TTcL
在另一實施方式中，所述偶聯(lián)物與Tetaquin預(yù)混合以構(gòu)建免疫復(fù)合物并隨后施用。在接種試驗中，對受試者進(jìn)行TTd免疫的預(yù)處理很有可能增加抗TTx的抗體水平。在優(yōu)選的實施方式中，所述藥劑用于如上定義的抗體介導(dǎo)的抗原靶向作用。在另一方面，本發(fā)明也涉及治療或預(yù)防癌癥或傳染性疾病的方法，該方法包括給受試者使用根據(jù)本發(fā)明的受試者所需的有效量的偶聯(lián)物。在優(yōu)選實施方式中，接受治療的受試者有抗破傷風(fēng)毒素或破傷風(fēng)類毒素的抗體。在更優(yōu)選的實施方式中，所述偶聯(lián)物是與藥劑可接受的載體共同施用的。藥物可接受的穩(wěn)定劑、滲透劑、緩沖劑、分散劑和類似的物質(zhì)也可以混合進(jìn)含有本發(fā)明的偶聯(lián)物的藥劑組合物中。優(yōu)選的形式取決于施用和治療應(yīng)用的預(yù)期模式。藥物載體可以是適于將偶聯(lián)物傳送給受試者的任意相容的、非毒性的物質(zhì)。用于腸胃外給藥的藥物可接受的載體的例子是利用O. 9%的無菌NaCl溶液或5%葡萄糖任意添加20%白蛋白。腸胃外給藥必須是無菌的。施用偶聯(lián)物的腸胃外路徑為根據(jù)已知的方法，如注射或通過靜脈注射，腹膜內(nèi)注射，肌肉注射，動脈注射或內(nèi)部損傷的方式注入。根據(jù)本發(fā)明的偶聯(lián)物優(yōu)選通過推注的注射方式給藥。典型的內(nèi)部損傷注射組合物可以制造成含有，例如，I-IOml磷酸鹽緩沖液和I至100 μ g，優(yōu)選10至300 μ g (抗原蛋白的)本發(fā)明偶聯(lián)物。制備腸胃外的藥物組合物的方法在本領(lǐng)域是公知的并且在多種來源中有更為詳細(xì)的描述，包括，例如，Remington’ sPharmaceuticalScience (15th ed. , Mack Publishing, Easton, PA, 1980)(通過全文參考的方式結(jié)合于本文)。在進(jìn)一步的實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物進(jìn)一步含有至少一種免疫應(yīng)答引發(fā)化合物或佐劑。有益地，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物可以另外含有一種或更多種合成佐齊U。這些佐劑可以與本發(fā)明的藥物組合物混合或單獨的施用于被治療的動物或人類。特別優(yōu)選地，已知這些佐劑通過Toll樣受體發(fā)揮作用。能夠活化內(nèi)部免疫系統(tǒng)的免疫修飾復(fù)合物，可以經(jīng)Toll樣受體(TLR’ S)特別好地激活，包括TLR’ sl-10和/或通過RIG-I (可受維甲酸誘導(dǎo)的基因-I)蛋白和/或通過內(nèi)皮素受體。能夠活化TLR受體和修飾和誘導(dǎo)的化合物在本領(lǐng)域是有很好的記載的。TLRl可以被細(xì)菌脂蛋白和其乙酰化物所活化。TLR2可以另外被革蘭氏陽性菌糖脂、LPS、LPA、LTA、菌毛、外膜蛋白、來自于細(xì)菌或宿主的熱休克蛋白以及分支桿菌的脂阿拉伯甘露聚糖所激活。TLR3可以被dsRNA所激活，特別是病毒來源的，或化學(xué)化合物聚合物(I:C)。TLR4可以被革蘭氏陰性菌LPS、LTA、來自于宿主或細(xì)菌的熱休克蛋白、病毒衣殼或包膜蛋白、紫杉醇或其衍生物，含有透明質(zhì)酸的寡糖類和纖連蛋白所激活。TLR5可以被細(xì)菌鞭毛或鞭毛蛋白所激活。TLR6可以被分支桿菌脂蛋白和B族鏈球菌熱不穩(wěn)定因子(GBS-F)或葡萄球菌調(diào)控蛋白所激活。TLR7可以被咪唑并喹啉激活。TLR9可以被非甲基化的CpG DNA或染色質(zhì)-IgG復(fù)合物所激活。特別地，TLR3，TLR7和TLR9在介導(dǎo)抗病毒感染的內(nèi)部免疫應(yīng)答中起重要作用，能夠活化這些受體的化合物特別優(yōu)選應(yīng)用于治療的方法和根據(jù)本發(fā)明的組合物或藥劑。特別優(yōu)選的佐劑包括但不限于，合成制造的化合物，包括dsRNA、聚(I:C)、能夠誘導(dǎo)TLR3和TLR9受體的未甲基化的CpG DNA、IC31、IMSAVAC,Montanide ISA-51 (Seppic 7生產(chǎn)的佐劑，法國)。其他優(yōu)選的免疫修飾化合物是T細(xì)胞附著抑制劑，更優(yōu)選地，內(nèi)皮縮血管肽受體抑制劑如BQ-788 (Buckanovich RJ等，Ishikawa K,PNAS (1994) 91 :4892)。BQ-788是N-順式-2，6-二甲基-哌啶子基羰基-L-Y -甲基亮氨酸-D-1-甲氧基擬基色氨酸-D-正亮氨酸(N-cis-2, 6-dimethyl-piperidinocarbonyl-L-gamma-methy I leucy l-D-l-methoxycarbony ltryptophany 1-D-nor leucine) ο 然而任何 BQ-788的衍生物或修飾的BQ-788化合物也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在另一優(yōu)選實施方式中，合成佐劑化合物物理連接于本發(fā)明的肽或免疫原性肽。物理連接于包括肽的HLA I類和HLA II類表位的佐劑和共刺激化合物或功能基團通過對抗原提呈細(xì)胞(尤其是樹突狀細(xì)胞)進(jìn)行 共刺激提供增強的免疫應(yīng)答，所述抗原提呈細(xì)胞內(nèi)化，代謝和展示抗原。優(yōu)選地，所述偶聯(lián)物是預(yù)防或治療性的疫苗。可選擇地，或與一種或其他實施方式結(jié)合，在本發(fā)明的一種實施方式中，治療的方法進(jìn)一步包括在使用偶聯(lián)物之前至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30或更多周前使用疫苗誘導(dǎo)抗破傷風(fēng)類毒素的免疫應(yīng)答。優(yōu)選地，該疫苗為TTd。優(yōu)選地，具有抗破傷風(fēng)毒素或破傷風(fēng)類毒素的抗體的受試者已用破傷風(fēng)類毒素免疫過，已經(jīng)具有用于破傷風(fēng)的暴露后的預(yù)防和/或已患有破傷風(fēng)?？蛇x地或與本發(fā)明的其他實施方式結(jié)合，根據(jù)本發(fā)明的治療癌癥的方法可以進(jìn)一步包括其他治療方法，其他治療方法的例子可以與根據(jù)本發(fā)明的治療方法結(jié)合來增強化學(xué)療法、放射療法(也稱放療、X-射線治療、輻照治療)和/或外科手術(shù)。本領(lǐng)域技術(shù)人員，通常是醫(yī)學(xué)醫(yī)生，將了解對某一特殊情況何種治療方法是合適的。在本文和本權(quán)利要求中，動詞“含有”(to comprise)及其結(jié)合用于非限制性的意義用于表示該詞語之后的事項均被含有，但也并不排除沒有特意提到的事項。另外，涉及一個元素時，不定冠詞“一個”或“一種”并不排除存在多于一個的元素的可能，除非語境中明確要求有一個或僅一個元素。因此不定冠詞“一個”或“一種”通常表示“至少一個”。本說明書中參考引用的所有專利和文獻(xiàn)特此通過全文參考結(jié)合于本文。以下提供的實施例僅用于說明的目的，并不用于以任何方式限制本發(fā)明范圍。


圖I抗體介導(dǎo)的抗原祀向作用圖解。應(yīng)當(dāng)注意的是多聚化(三折疊(tree-fold))的水平僅是一個說明。圖2小鼠的脾和淋巴結(jié)中被標(biāo)記的T細(xì)胞的OVA特異性增殖。符號代示單個小鼠。統(tǒng)計分析顯示抗TNP抗體介導(dǎo)的OVA特異性T細(xì)胞增殖顯著區(qū)別于其他組P〈0. 001。圖3來自于TTx α -鏈的22-mer肽在Tettox ELISA中的測試結(jié)果。
圖4來自于TTx β -鏈的22-mer肽在Tettox ELISA中的測試結(jié)果。圖5 單個血清 α31、β 18、β 32、β41, β 48，β 54，β 55 使用 Tettox ELISA 的測試結(jié)果。圖6合成核心復(fù)合物26的合成圖解。圖7合成構(gòu)建體(construct) 33的合成圖解。圖8 構(gòu)建體 33 的去卷積(deconvoluted)質(zhì)譜譜圖，MWcalc=13, 153. I,MWobs=13, 154. O。圖9用于SIINFEKL特異性⑶8+T細(xì)胞的流術(shù)引流淋巴結(jié)，利用SINKEKL-四聚體(左側(cè)板)和SINFEKL特異性細(xì)胞因子分泌試驗(右側(cè)板)。淋巴結(jié)來自于用有(+AB)或沒有 (-AB)的構(gòu)建體33接種的并用TTE特異性抗體靜脈注射的小鼠或來自于未經(jīng)處理的小鼠(陰性的)。實施例I、材料和方法I. I、一般程序肽合成肽的合成在復(fù)合合成器上進(jìn)行(Syro II，MultiSyntech)。帶有適當(dāng)?shù)腇moc保護的氨基酸(10 μ mol)的預(yù)裝載的Tentagel S Ac樹脂(RappPolymere)用NMP(3x0. 8ml)清洗并且用有20%哌啶的NMP (3x3min,0. 8ml)處理。樹脂用NMP (6x0. 8ml)洗滌。樹脂中加入Fmoc-氨基酸(6當(dāng)量，O. 6M于NMP中)，PyBOP (6當(dāng)量，0.67M于NMP中)和NMM (12當(dāng)量，33%溶解于NMP中)。偶聯(lián)反應(yīng)進(jìn)行90分鐘并不時震蕩且在偶聯(lián)結(jié)束時用NMP (6x0. 8ml)清洗樹脂。用Iml含有5%水的TFA處理樹脂2. 5小時。當(dāng)W出現(xiàn)于肽中時，5%巰基乙磺酸也被加入到切割混合物中。在C出現(xiàn)于肽中時，切割混合物在沉淀之前用兩滴三乙基硅烷處理。肽用9ml乙醚/戊烷1/1 (v/v)沉淀并且離心分離。沉淀物被分離，在水或水/乙酸中溶解并凍結(jié)獲得白色固體。肽的純度用LC-MS(Acquity,Waters)檢查且分子質(zhì)量在Voyager DE-Pro (Perseptive Biosystems)上石角定。I. 2、Tettox ELISA 實驗方案抗生蛋白鏈菌素包覆的96孔板(Euro-Diagnostica)用含有5%BSA (200 μ I/孔，Ih,室溫)的PBS封閉?？装逵煤蠴. 05%吐溫20的PBS洗3次。生物素化肽的包覆用100 μ I/孔的溶解有2 μ g/ml的生物素化肽的含有1%BSA的PBS在室溫孵育lh?？装逵煤蠴. 05%吐溫20的PBS清洗3次?？子?00 μ I已經(jīng)以800χ稀釋于含有1%BSA的PBS溶液中的TetaQuin或已經(jīng)以IOOx稀釋于含有1%BSA的PBS溶液中的TetaQuin，在室溫下孵育Ih。孔板用含有O. 05%吐溫20的PBS洗3次。每個孔在室溫用辣根過氧化物酶結(jié)合的IgG抗體(鼠抗人 IgG-HRP 單克隆，克隆 G18-145，cat no 555788, Becton Dickinson, 100 μ I/孔的IOOOx溶解于含有O. 05%吐溫20的PBS)孵育lh?？装逵煤蠴. 05%吐溫20的PBS洗3次。用2，2'-連氮基-雙- (3-乙基苯并噻唑啉磺酸)進(jìn)行洗滌，ABTS+H2021/1000，100 μ I/孔。光密度在415nm用BI0-RAD，model680，全自動定量繪圖酶標(biāo)儀檢測。I. 3、典型的偶聯(lián)物的合成在本例中描述了含有3個TT-表位和一個卵清蛋白表位的偶聯(lián)物的合成。系統(tǒng)在這樣的方式中發(fā)展TT-和OVA-表位的偶聯(lián)可以在沒有銅離子的情況下在室溫進(jìn)行。首先，TT-表位的三拷貝已經(jīng)用間隔區(qū)延長并且半胱氨酸殘基與核心復(fù)合物26偶聯(lián)。在第二步中OVA-表位已用間隔區(qū)延長并且偶聯(lián)于疊氮化物基團獲得構(gòu)建體33。對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說這只是合成根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)建體的一個例子，且本例并不用于限制本發(fā)明。I. 3. I復(fù)合物26的合成參見合成核心復(fù)合物26的合成圖解62，2_ 雙-溴化甲燒 _3_(三苯甲基氧)丙燒-I-醇(2，2-bis-bromomethane-3-(trityloxy)propan-l-ol) (16):商業(yè)上可用的二溴化物 15 (131g, 500mmol)溶解于批啶(IOOOml)并加入三苯甲基氯(69. 7，250mmol),混合物攪拌過夜，在真空離心后殘基在EtOAc中提取并且用H2O洗滌，有機物涂層在真空中MgSO4上干燥。題述復(fù)合物的柱色譜法(PE-Tol-EA 50-50 — 0-99-1)中為淡黃色油(116g，93%)。(Rf:PE-EA 70-30=0. 78)2，2_雙-溴化甲烷-I-苯二甲酰亞氨基-3-(三苯甲基氧)丙烷(2，2-bis- bromomethane-1-phthaIimido-3- (trityloxy)propane ) (17):16(116g,232mmol)在THF (1160ml)中共蒸發(fā)溶解并且在氬氣中30min去除。PPh3 (76g，290mmol)和酞酰亞胺(42.6g，290mmol)在氬氣氣氛下加入。當(dāng)所有固體溶解后逐滴加入DEAD (133ml，290mmol)。過夜攪拌混合物并在真空濃縮。剩余殘基在甲苯中提取并且副產(chǎn)品在_20°C下過夜重結(jié)晶。結(jié)晶余液在真空中濃縮并在Et2O中濃縮并且副產(chǎn)品在_20°C下過夜重結(jié)晶。結(jié)晶余液在真空中濃縮。柱色譜法(Tol-EA 100-0 — 98-2)中為淡黃色油(76. 6g，52% 和 80g 的非純品)。(RF: PE-EA 80-20=0. 53)，1H NMR (400MHz, CDCl3) : δ =3. 35 (s, 2H，CH2CH2OTr)，3. 57 (d, 2H, J=10. 8Hz, CH2CH2Br)，3. 66 (d, 2H, J=10. 8Hz, CH2CH2Br)，3. 95 (s, 2
H,CH2CH2NPhth)，7. 22-7. 31 (m, 9H, Harom)，7. 24-7. 44 (m, 6H, H arom)，7. 71-7. 73 (m, 2H, Harom)，7. 83-7. 86 (m, 2H, H arom) · 13C 匪R (100MHz, CDCl3) : δ =37. 2 (CH2CH2Br), 41. 3 (CH2CH2NPhth)，43. 8 (Cq CC4H8)，64. 9 (CH2CH2OTr)，87. 3 (Cq OTr), 123. 4 (CHarom), 127. 2 (CHarom), 127. 9(CH arom), 128. 2(CH arom), 128. 8(CH arom), 131. 9 (Cq arom), 134. I(CHarom), 143. 2(Cq arom), 168. 7(C=0 Phth).2，2-雙-疊氮甲烷-I-苯二甲酰亞氨基-3_(三苯甲基氧)丙烷(2，2-bis-azidomethane-l-phthalimido-3-(trityloxy)-propane) (18) 17(76. 6g, 121mmol)溶角軍于DMF(IOOOml)。在此溶液中加入NaN3 (39g，600mmol)和LiCl (cat)。該混合物回流6小時并在真空中濃縮。殘基在EtOAc中提取并且用H2O洗滌、有機物涂層在真空(66. Ig,98%)中 MgSO4 上干燥。(RF:PE-EA 80-20=0. 57)，1H NMR(400MHz, CDCl3) : δ =3. 13 (s, 2H, CH2CH20Tr)，3. 46 (d, 2H, J=12. 4Hz, CH2CH2N3), 3. 51 (d, 2H, J=12. 4Hz, CH2CH2N3)，3. 76 (s, 2H, CH2CH2NPhth)，7. 22-7. 79 (m, 19H, H arom). 13C NMR(100MHz, CDCl3) : δ =40. 2 (CH2CH2NPhth)，44.4 (Cq CC4H8)，52. 9 (CH2CH2N3)，63. 4 (CH2CH2OTr)，86. 9 (Cq OTr)，123. 2 (CH arom)，127. 2 (CHarom), 127. 9(CH arom), 128. 2(CH arom), 128. 8(CH arom), 131. 9(Cq arom), 134. I(CHarom), 143. 3(Cq arom), 168. 5(C=0 Phth).1_氣基_2，2-雙-置氣甲燒-3- (二苯甲基氧)丙燒(I-amino-2, 2-bis-azidomethane-3- (trityloxy) -propane) (19) : 18 (50. lg, 90mmol)在氬1氣氣氛中從干燥EtOH(450ml)和聯(lián)氨(6. 55ml，135mmol)中提取，反應(yīng)震蕩3天(在此過程中形成固體)直至TLC分析顯示起始材料完全轉(zhuǎn)變?yōu)榈瓦\轉(zhuǎn)點(running spot)。固體用冷的EtOH過濾和洗滌。重組有機層在真空中提取。柱色譜法(PE-EA 75-25 — 25-75)中淡黃色油(24. 8g, 64%)。(RF: DCM-MeOH 95-5=0. 44)，1H NMR (400MHz, CDCl3) : δ =2. 62 (s, 2H, CH2CH2NH2)，2. 99 (s, 2H, CH2CH2OTr)，3. 38 (s, 4H, CH2CH2N3)，7. 13-7. 43 (m, 15H, H arom) · 13C NMR (IOOMHz, CDCl3) : δ =42. I (CH2CH2NH2)，44. 6 (Cq CC4H8)，52. I (CH2CH2N3), 61. 4 (CH2CH2OTr)，86. 5 (CqOTr)，126. 9(CHarom)，127. 2(CH arom)，128. 2(CH arom)，143. 4 (Cq arom).I-(叔丁氧擬基氨基)-2，2-雙-(叔丁氧擬基氨基)甲基-丙基-3-醇(l_(tert-butoxycarbonylamino)-2, 2_di-(tert-butoxycarbonylamino)methyl-propan-3-ol)
(20):19(24. 8, 58mmol)溶解于 THF(580ml),而后加入 H2O(29ml)和 PPh3 (33. 3g,127. 6mmol)。該混合物物在室溫下震蕩過夜并加熱至50 V再次震蕩6小時(Rf : EtOH t-Bu0HH2O AcOH: 4-2-2-1=0. 42)。該反應(yīng)在真空濃縮并在H20提取(580ml)并且過濾。在該水溶液中加入 37%HCL (29ml，348mmol)并震蕩 3 天(RF:Et0H t-BuOH H2O AcOH:4-2-2-1=0. 05)。該反應(yīng)在真空濃縮并與H2O共蒸發(fā)3次以去除大部分的HCL。該殘基在H2O中提取并用DCM洗滌。水層在真空中濃縮。該殘基在H2O (220ml)和ACN (220ml)中提取在溶液中加入 NaOH(3溶積克分子溶液于H2O中)直至pH為7。而后將NaOH(60ml，176mmol，3溶積克分子溶液于H2O中)以及Boc2O (38. 4g，176mmol)加入該混合物震蕩過夜。分離該層并且水層用EtOAc洗2遍。有機層在MgSO4上結(jié)合干燥并且在真空濃縮。由PE/EtOAc結(jié)晶題述的復(fù)合物為白色固體(12. 9g，51%)。(RF:PE-EA 80-20=0. 53)，1H NMR(400MHz, CDCl3) : δ =1 45 (s, 27Η, CH3Boc)，2. 82 (d, 6H, J=6. 8Hz, CH2CH2NH)，3. 13 (d, 2H, J=4. 4Hz, CH2CH2OH), 4. 32 (t, 1H, J=4. 4Hz, OH)，5. 78 (t, 3H, J=6. 4Hz, NH) · 13C NMR (100MHz, CDCl3) : δ =28. 3 (CH3Boc)，39.0 (CH2CH2NH)，46. I (Cq CC4H8)，60. 3 (CH2CH2OH)，79. 7 (Cq Boc)，157. 8 (C=0 Boc).I-(叔丁氧擬基氨基)-2，2_雙-(叔丁氧擬基氨基)甲基_3_丙酸(I-(tert-butoxycarbonylamino)_2，2-di-(tert-butoxycarbonylamino)methyl-3-propanoic acid)
(21):20(12. 2g, 28mmol)在 EtOAc (280ml)、MeCN(280ml) ^PH20(280ml)中懸浮。在該懸液中加入NaIO4 (24. lg, 113mmol)和催化劑量的RuCl3從黑色變?yōu)殚冱S色。當(dāng)該懸液變清澈TLC分析顯示完全轉(zhuǎn)變?yōu)榈偷倪\轉(zhuǎn)點時分離該有機層并用EtOAc洗水層。在結(jié)合的有機層中加入EDTA(104g，280mmOl)并震蕩過夜。分離該層并用Na2S2O3洗有機層。有機層在MgSO4上干燥并且在濃縮過程中題述復(fù)合物結(jié)晶為白色固體(8. 77g，70%)。(RF:PE-EA-AcOH50-50-3drops=0. 77)，1H NMR (400MHz, CDCl3) : δ =1. 43 (s, 27Η, CH3Boc)，3. 25 (d, 6Η, J=6. OHζ, CH2CH2NH)，5. 78 (bs, 3Η, NH)，9. 59 (vbs, 1Η, C00H) · 13C NMR (100MHz, CDCl3) : δ =28. 3 (CH3Boc), 40. 31 (CH2CH2NH)，53. O (Cq CC4H8)，79. 8 (Cq Boc)，157. O (C=0 Boc)，176. 5 (C=0 C00H).帶有氨基PEG-間隔區(qū)的Boc保護的二-氨基-2，2_ 二甲基丙酸(22):在気氣氣氛下于 DCM(20ml)和 Et3N(0. 21ml, I. 5mmol)中的溶液 21 (0. 447g, I. Ommol)力口入HATU(0. 380g, I. 5mmol),反應(yīng)震蕩15min并加入2-[2_(2_氨基乙氧基)乙氧基]乙基-I-胺(2_ [2_ (2-aminoethoxy) ethoxy] ethan-l-amine) (I. 46ml, 10mmol)。在震蕩過夜后用H2O洗滌混合物并且該有機層在MgSO4上干燥并且在真空中濃縮。柱色譜法(DCM/MeOH100-0 — 90-10)中題述的復(fù)合物為無色油狀(0. 293g, 51%)。(RF:DCM-MeOH 90-10=0. 15)，1HNMR (400MHz, CDCl3) : δ =1. 44 (s, 27H, CH3Boc), 2. 91 (t, 2H, J=4. 8Hz, CH2peg)，3. 23 (d, 6H, J=6. 4Hz, CH2Scaffold)，3. 40 (m, 2H, CH2peg)，3. 46 (bs, 2H, NH2)，3. 56 (t, 4H, J=5. 2Hz, peg)，3.63 (bs, 4H, peg)，5. 88 (bs, 3H, NH Boc)，7. 33 (bs, 1H, NH peg amide) ; 13C NMR (100MHz, CDCl3)
:δ =28. 2 (CH3Boc)，39. I (CH2peg)，41. I (CH2Scaffold)，52. 2 (Cq CC4H8)，69. 3 (2x CH2peg)，7O. O (CH2Peg)，70. I (CH2peg)，72. I (CH2peg)，79. 6 (Cq Boc)，157. 0 (C=O Boc)，172. 6 (C=O pegamide).帶有二苯基環(huán)辛炔(diphenylcyclooctyn) PEG間隔區(qū)的Boc保護的三-氨基-2，2- 二甲基丙酸(24):在氬氣氣氛下 DMF(13ml)和 Et3N(O. 27ml, I. 98mmol)中的 22溶液中(0.383g，0.662mmol)加入23 (O. 267g, O. 695mmol)。在對混合液震蕩過夜后在真空下濃縮。尺寸排阻色譜法(Size exclusionchromatography) (LH20Me0H/-DCM 1-1)和隨后的柱色譜法(DCM/MeOHlOO-O — 99-1)的題述復(fù)合物是無色的油(O. 125g，33%)。(Rf: DCM-MeOH 90-10=0.9); NMR (400MHz, CDCl3) : δ =1. 44 (s, 27H, CH3Boc), 2. 89 (m, 1Η,CH2Octyn), 3. 17 (d, 1Η, J=13. 6Hz, CH2Octyn)，3. 23-3. 25 (d, 6Η, J=6. 8Hz, CH2Scaffold)，3.40-3. 45 (m, 4Η, CH2peg)，3. 58-3. 60 (m, 4Η, CH2peg)，3. 65 (bs, 4Η, CH2peg)，5. 50 (bs, 1H, CHoctyn), 5. 50 (bs, 3H, NH Boc), 5. 81 (bs, I H, NHcarbamate), 7. 27-7. 37 (m, 8Η, Harom), 7. 52 (d, 1Η, J=7. 6Hz, NH peg amide) ; 13C NMR (IOOMHz, CDCl3) : δ =28. 3 (CH3Boc)，39. I (CH2peg)，40 9 (CH2peg), 41. I (CH2CC4H8)，46. O (CH2Octyn)，52. 2 (Cq CC4H8), 69. 21 (CH2peg)，69. 9 (2χ CH2Peg)，70. O (CH2peg)，70. 3 (CH2peg)，76. 6 (CH octyn)，79. 8 (CqBoc)，109. 9 (Cq Arom), 112. 8 (CqArom), 121. 2 (Cq Arom)，123. 7-129. 8 (CHarom), 151. I, 152. 2, 155. 5, 157. O (C=O Boc), 172. 6(C=0 peg amide).帶有二苯基環(huán)辛炔PEG間隔區(qū)的馬來酰亞胺丙酰功能化的三-氨基_2，2- 二甲基丙酸連接體(26):復(fù)合物24 (38mg，0. 047mmol)在氬氣氣氛(TC溶解于HCL濃度為4M的二惡烷(O. 47ml, I. 88mmol)中。該混合物允許冷卻至室溫。在LCMS分析(LCMS: 1090:13. 5min,RF6. 52min)表現(xiàn)出完全轉(zhuǎn)化為三胺(6h)時該混合物在0°C完全灌注于Et2O中并接下來自旋。Et2O被緩慢排除殘基在DCM (O. 1M)提取。在此懸浮物中加入馬來酰亞胺丙酸OSu酯25 (O. 05g,0. 188mmol)和 Et3N(19y 1,0. 188mmol)。在 LCMS 分析后(LCMS: 1090:13. 5min，Rf: 7. 56min)顯示出完成反應(yīng)混合物直接利用柱色譜純化(DCM/MeOH 100-0 — 96-3)提供黃色油狀的題述復(fù)合物(O. 0124g，27%)。(RF:DCM-Me0H 90-10=0. 4) : NMR(400MHz, CDCl3):δ =1. 26 (bs, 6H)，2. 54 (bs, 6H)，3. 19-3. 45 (m, 6H)，3. 58-3. 82 (m, 14H)，5. 47 (s, I H), 6. 71(s, 6Η)，7. 29 (s, 8Η) ; 13C NMR (IOOMHz, CDCl3) : δ =29. 6，34. 2，34. 8，39. 2，39. 7，40. 9，46. I,50. 9，53. 4，69. O, 69. 9，70. 17，76. 6，109. 8，112. 8，121. 2，123. 7，125. 8，126. I, 126. 9，127.6，127. 8，128. O, 129. 9，134. 2，150. 9，155. 5，170. 4，171. 7，172. 2.I. 3. 2構(gòu)建體33的合成見圖7合成構(gòu)建體33的合成圖。F-I-G-I-T-E-L-K-K-L-E-S-K-I-N-K-V-F-A-A-K-Y-A-R-V-R-A-K-C(TTE-SH)(30)(SEQ ID NO:217)肽30在Tentagel S Ac樹脂(Rapp, Tubingen)上利用固相肽合成。利用攜帶有酸不穩(wěn)定側(cè)鏈保護(所需的)的Fmoc氨基酸常規(guī)的偶聯(lián)(I. 5h)。用PyBop和NMM進(jìn)行活化。Fmoc脫保護用20體積％哌啶在NMP中進(jìn)行。用NMP洗滌。從樹脂上切除并且側(cè)鏈脫保護用含有5%水和2%三乙基硅烷的TFA中進(jìn)行。用rpHPLC進(jìn)行純化。用UPLC_MS(Acquity，Waters)對純化的肽進(jìn)行分析。疊氮己酰(Azidohexanoyl)-L-E-Q-L-E-S-I-I-N-F-E-K-L-A-A-A-A-A-K(OVAE)(31)(SEQ ID NO:217)
肽31的合成與肽30相似。用偶聯(lián)疊氮己酸(azidohexanoic acid) /PyBop/NMM來引入疊氮己?；鶊F。從樹脂的切除和側(cè)鏈脫保護用含有5%水的TFA進(jìn)行。構(gòu)建體33TTE肽30 (4. 8mg, I. 44 μ mol)在氬氣氣氛下在除氣的水(800 μ I，微孔)中溶解，通過加入NaHC03(0. 5Μ，20μ 1，除氣)將pH設(shè)定至6。在該溶液26(0. 234mg，0. 24μπιο1)中加入MeCN(23 μ I)。該混合物在質(zhì)量光譜測定法(QTof)顯示完成26到32的轉(zhuǎn)化后震蕩3h。另外，由于曾用了過量TTE-SH，TTE-SH和相關(guān)二硫化物TTE-S-S-ETT可以檢測得到。在此混合物中加入了 DMSO (400 μ 1，微孔)中的肽OVAE (31，O. 63mg，O. 289 μ mol)。根據(jù)質(zhì)量光譜測定法(Qtof) —小時內(nèi)32轉(zhuǎn)變?yōu)?3?；旌衔镉肏PLC純化獲得2. 7mg，0. 20 μ mol，83%。用質(zhì)量光譜測定法分析產(chǎn)物并出現(xiàn)了預(yù)期質(zhì)量(見圖8去卷積質(zhì)譜譜圖，MWcalc=13, 153. 1，MWobs=13, 154. 0)。2、結(jié)果 2. I、小鼠中系統(tǒng)性抗原特異性T細(xì)胞啟動效應(yīng)用TNP-BSA重復(fù)免疫小鼠導(dǎo)致高滴度的抗半抗原TNP (TNP免疫的)的循環(huán)抗體或遺留未被免疫的小鼠(陰性的)。在1-2個月后所有小鼠注射首次用于實驗用熒光染料CFSE標(biāo)記的OVA-特異性CD8T細(xì)胞。在24小時后為小鼠注射單劑量的TNP-0VA。3天后處死小鼠且標(biāo)記的T細(xì)胞的OVA-特異性增殖在脾臟和淋巴結(jié)中用流式細(xì)胞儀(圖2)分析。符號代表單個小鼠。統(tǒng)計學(xué)分析顯示抗-TNP抗體介導(dǎo)的OVA-特異性T-細(xì)胞增殖不同于其他組P < 0.001。因此，系統(tǒng)性抗體特異性T細(xì)胞引發(fā)效應(yīng)可以被先前出現(xiàn)的抗半抗原-表位的循環(huán)抗體所促進(jìn)。2.2、合成的TTx重疊肽由于人類沒有抗TNP的循環(huán)抗體并且由于并不希望免疫人類來獲得抗-TNP的循環(huán)抗體，本發(fā)明選擇了一個通路，大多數(shù)人有抗該通路的循環(huán)抗體。發(fā)明人在重疊肽(長度為22個氨基酸殘基，10個氨基酸重疊)中合成了 TTx的α和β鏈。在本研究中利用故鄉(xiāng)合成法制造了 109個肽。所述肽合成有C-末端賴氨酸(生物素)由Ahx間隔區(qū)(氨基己酸)連接于肽。這些生物素肽可以連接于抗生蛋白鏈菌素ELISA板用于分析。肽在ELISA中顯示用于結(jié)合Tetaquin中的抗體。Tetaquin是有大面板的全部有高的抗TTd抗體滴度的抗體的組合。TetaQuin在90%的人類IgG中存在(100-180mg/ml)并且可用的來自于Sanquin(Amsterdam，荷蘭)。進(jìn)行Elisa’ s，其中生物素肽獨立的附加于抗生素蛋白鏈菌素包被的Elisa板上。對每個肽測試集中連續(xù)的TetaQuin以用于結(jié)合。在此方式，確定最佳結(jié)合肽。結(jié)果以ELISA的OD值來表示。這并不是絕對數(shù)值，只用于辨別一個測試中的不同肽。技術(shù)人員知曉O(shè)D值在多種測試中是變化的。表I :重疊肽TTx α和TTx β鏈
權(quán)利要求
1.一種偶聯(lián)物，該偶聯(lián)物含有與抗原、免疫原或者含有抗原或免疫原的載體偶聯(lián)的肽，其中，所述肽含有 (i)具有氨基酸序列GITELKKL的SEQ ID NO :3中的至少10個氨基酸殘基；或 (ii )與(i )中提供的氨基酸序列有至少80%序列一致性的氨基酸序列，并且其中，當(dāng)將所述肽施用于來自至少10名已用破傷風(fēng)類毒素接種的人類受試者的血清樣本時，如在破傷風(fēng)毒素或類毒素酶聯(lián)免疫法中確定的，所述肽在至少50%的血清樣本中通過來自于血清樣本的抗體結(jié)合； 其中，所述肽不是破傷風(fēng)毒素β鏈。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的偶聯(lián)物，其中，所述肽含有少于100個的氨基酸殘基。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的偶聯(lián)物，其中，所述抗原、免疫原或者含有所述抗原或免疫原的載體偶聯(lián)于所述肽的C-末端。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任意一項所述的偶聯(lián)物，其中，2至20個肽結(jié)合于所述抗原、免疫原或者含有所述抗原或免疫原的載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任意一項所述的偶聯(lián)物，所述偶聯(lián)物作為藥劑使用。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任意一項所述的偶聯(lián)物，所述偶聯(lián)物用于在受試者中預(yù)防或治療癌癥或傳染性疾病。
7.權(quán)利要求1-4中任意一項所述的偶聯(lián)物在制造用于在受試者中預(yù)防或治療癌癥或傳染性疾病的藥劑中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的偶聯(lián)物或根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其中，所述受試者具有抗破傷風(fēng)毒素或破傷風(fēng)類毒素的抗體。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的偶聯(lián)物或根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其中，所述受試者為在施用所述偶聯(lián)物至少兩周前已經(jīng)被施用用于產(chǎn)生抗破傷風(fēng)毒素的循環(huán)抗體的疫苗的受試者。
10.一種肽,所述肽含有 (i)具有氨基酸序列GITELKKLES的SEQID NO 3中的至少12個氨基酸殘基；或 (ii)與(i)中提供的氨基酸序列有至少80%序列一致性的至少12個氨基酸殘基的氨基酸序列，并且其中，當(dāng)將所述肽施用于來自至少10名已用破傷風(fēng)類毒素接種的人類受試者的血清樣本時，如在破傷風(fēng)毒素或類毒素酶聯(lián)免疫法中確定的，所述肽在至少50%的血清樣本中通過來自于血清樣本的抗體結(jié)合； 其中，所述肽含有少于100個的氨基酸。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的肽，所述肽具有 (i)如SEQID NO 4-24的任意一個中提供的氨基酸序列；或 (ii)與SEQID NO :4-24中提供的氨基酸序列有至少80%序列一致性的氨基酸序列，并且其中，當(dāng)將所述肽施用于來自至少10名已用破傷風(fēng)類毒素接種的人類受試者的血清樣本時，如在破傷風(fēng)毒素或類毒素酶聯(lián)免疫法中確定的，所述肽在至少50%的血清樣本中通過來自于血清樣本的抗體結(jié)合。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的肽，其中，所述肽具有SEQID NO :24中所提供的氨基酸序列或由SEQ ID NO 24中所提供的氨基酸序列組成。
13.根據(jù)權(quán)利要求10-12中任意一項所述的肽，其中，所述肽含有少于50個的氨基酸殘基。
14.根據(jù)權(quán)利要求10-13中任意一項所述的肽，其中，所述肽在SEQIDNO :4或SEQ IDNO 24的C-末端含有另外的氣基酸殘基。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的肽，其中，所述另外的氨基酸殘基不是衍生自破傷風(fēng)毒素β鏈。
全文摘要
本發(fā)明涉及偶聯(lián)物，所述偶聯(lián)物含有具有氨基酸序列GITELKKL的至少10個氨基酸殘基的肽，當(dāng)所述肽施用于具有抗破傷風(fēng)類毒素的抗體的受試者時，所述肽用于誘導(dǎo)有效的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。在一種實施方式中，本發(fā)明涉及預(yù)防性的或治療性的疫苗，在另一種實施方式中，本發(fā)明涉及癌癥或傳染性疾病的治療或預(yù)防。
文檔編號C07K14/33GK102892431SQ201180024092
公開日2013年1月23日 申請日期2011年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月15日
發(fā)明者F·A·奧森多普, C·J·M·梅立夫, J·W·德瑞杰夫浩特 申請人:萊頓大學(xué)醫(yī)學(xué)中心附屬萊頓教學(xué)醫(yī)院, 德國科技術(shù)基金會