以rgd為活性中心的多肽及其在制備治療缺血性腦卒中靶向藥物中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明屬生物藥物技術(shù)領(lǐng)域，涉及以RGD為活性中心的多肽其在制備治療缺血性腦卒中靶向藥物中的應(yīng)用，本發(fā)明所述的RGD肽是由精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸構(gòu)成的三肽序列(Arg-Gly-Asp)，以RGD三肽為活性中心的多肽包括五肽、七肽、環(huán)肽或擬肽化合物，經(jīng)試驗(yàn)顯示，以RGD為活性中心的線性肽及環(huán)狀肽修飾納米給藥系統(tǒng)，可顯著提高該系統(tǒng)在缺血性腦卒中缺血病灶的藥物蓄積，具有明顯的腦內(nèi)病變部位的二級(jí)靶向遞藥特征。應(yīng)用該系統(tǒng)包載抗氧化藥物，可明顯提高依達(dá)拉奉在缺血再灌注模型大鼠體內(nèi)的抗氧化效果，降低梗死體積。
【專利說(shuō)明】
以RGD為活性中心的多肽及其在制備治療缺血性腦卒中靶 向藥物中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬生物藥物技術(shù)領(lǐng)域，涉及以RGD為活性中心的多肽其在制備治療缺血性 腦卒中靶向藥物中的應(yīng)用，特別是所述的RGD為活性中心的多肽可作為靶頭構(gòu)建缺血性腦 卒中靶向遞藥系統(tǒng)。
[0002] 發(fā)明技術(shù)
[0003] 據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，我國(guó)腦卒中的死亡率和發(fā)病率分別居世界第一位 和第二位。但對(duì)于該類疾病的治療，由于血腦屏障（BBB)的存在，使幾乎所有大分子及98% 的小分子藥物無(wú)法進(jìn)入大腦及中樞神經(jīng)系統(tǒng)，臨床常用的給藥方式由于缺乏組織特異性和 病變部位的靶向性從而導(dǎo)致用藥量大，極易引起嚴(yán)重的毒副作用。近年來(lái)，腦靶向制劑研究 取得了巨大的成績(jī)，由抗體或配體修飾的免疫脂質(zhì)體制劑，不僅延長(zhǎng)了在體循環(huán)時(shí)間，同時(shí) 具有尋靶功能，增加藥物的腦內(nèi)遞送。但是目前靶向遞藥手段將藥物遞送跨越BBB后如何 實(shí)現(xiàn)腦內(nèi)病灶部位的進(jìn)一步選擇性是腦靶向給藥研究面臨的新難題?，F(xiàn)有制劑手段在幫助 藥物通過(guò)BBB后，缺乏在腦內(nèi)的二次選擇作用，因而腦內(nèi)病灶部位的藥物濃度仍然不高，且 對(duì)正常細(xì)胞同樣產(chǎn)生損害。因此如何建立不僅可跨越BBB而且可進(jìn)一步到達(dá)腦內(nèi)病變部位 的腦靶向給藥系統(tǒng)，是腦卒中治療的關(guān)鍵。
[0004] 正常腦組織內(nèi)無(wú)白細(xì)胞，但大量研究證實(shí)，在腦缺血/再灌注過(guò)程中，白細(xì)胞（主 要為中性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞）可在細(xì)胞因子調(diào)控的趨化性作用下被激活，聚集于腦微血管 并通過(guò)BBB，浸潤(rùn)缺血腦組織。被活化的白細(xì)胞同時(shí)釋放炎性介質(zhì)及有毒物質(zhì)（氧自由基 等），加重腦內(nèi)局部炎癥反應(yīng)及氧化損傷，加重缺血后神經(jīng)元損傷。因此，腦缺血/再灌注過(guò) 程中，白細(xì)胞不僅可通過(guò)BBB，而且可以到達(dá)腦內(nèi)神經(jīng)元損傷的部位。在這一病理過(guò)程中，血 循環(huán)中的白細(xì)胞是關(guān)鍵：其在細(xì)胞因子調(diào)節(jié)的趨化性作用下穿越BBB并到達(dá)缺血腦組織， 如果能利用白細(xì)胞，使其攜帶載藥系統(tǒng)跨越BBB并到達(dá)腦內(nèi)缺血組織，則可構(gòu)建一種十分 理想的具有多級(jí)腦靶向功能的傳輸系統(tǒng)。
[0005] R⑶肽（Arg-Gly-Asp)是由精氨酸一甘氨酸一天冬氨酸構(gòu)成的三肽序列，為纖維 連接蛋白與其受體的特異性結(jié)合位點(diǎn)。RGD肽與整合素受體ανβ3具有高度親和力，而 α νβ 3受體在腫瘤血管新生過(guò)程中的內(nèi)皮細(xì)胞上具有高度的表達(dá)，因此采用R⑶修飾的載 體或診斷試劑可應(yīng)用于腫瘤的治療及診斷。此外，以RGD三肽為活性中心，研究合成了一系 列五肽、七肽、環(huán)肽或擬肽化合物，結(jié)果環(huán)化肽在體內(nèi)具有更穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)和更強(qiáng)的活性。近 年來(lái)以RGD三肽為活性中心的系列多肽在腫瘤靶向制劑方面的研究極為活躍并取得效果。
[0006] 與本發(fā)明相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)有：
[0007] 1.王大為，付研.急診血栓栓塞性疾病的診斷與救治.世界急危重病醫(yī)學(xué)雜 志· 2006, 3(4) :1385-1389.
[0008] 2. Tosi G, Costantino L, et al. Polymeric nanoparticles for the drug delivery to the central nervous system. Expert Opin Drug Deliv. 2008Feb ； 5(2) :155-74.
[0009] 3. Suzuki Y，Matsumoto Y，et al. SM-20220, a Na (+)/H (+) exchanger inhibitor: effects on ischemic brain damage through edema and neutrophil accumulation in a rat middle cerebral artery occlusion model.Brain Res. 2002,945(2):242-248.
[0010] 4. Phillips JBjWilliams AJjet al. Proteasome inhibitor PS519reduces infarction and attenuates leukocyte infiltration in a rat model of focal cerebral ischemia. Stroke. 2000, (7):1686-1693.
[0011] 5. Auzzas Lj Zanardi Fj Battistini L，et al. Targeting alphavbeta3integrin: design and applications of mono-and multifunctional RGD-based peptides and semipeptides. Curr Med Chem. 2010, 17(13):1255-1299.
[0012] 6. Shuang Liu. Radiolabeled Cyclic RGD Peptides as Integrina νβ 3-Targeted Radiotracers : Maximizing Binding Affinity via Bivalency. Bioconjug Chem. 2009, 20(12):2199-2213.
[0013] 7. Jain SjMishra Vj et al. RGD-anchored magnetic liposomes for monocytes/ neutrophils mediated brain t argeting. Inter J Pharm. 2003, 261:43-55.
[0014] 8.Eyal Aferganj Hila Epstein, Rachel Dahanj et al. Delivery of serotonin to the brain by monocytes following phagocytosis of liposomes. J Control Release，2008，（132)84-90.。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0015] 本發(fā)明的目的在于，提供一種不同于現(xiàn)有技術(shù)的以RGD為活性中心的多肽。
[0016] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了 RGD為活性中心的多肽作為靶頭在構(gòu)建缺血性腦卒中靶向 遞藥系統(tǒng)中的應(yīng)用。
[0017] 基于現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)，事實(shí)上除α νβ 3外，R⑶肽與整合素受體家族中α νβ 1同 樣具有高度的親和力。α V β 1是在白細(xì)胞表面高度表達(dá)的整合素受體，因此RGD修飾的載 體可通過(guò)與ανβ?的高親和力與白細(xì)胞結(jié)合，然后在炎癥反應(yīng)過(guò)程中被白細(xì)胞攜帶通過(guò) BBB并到達(dá)腦內(nèi)受損部位，實(shí)現(xiàn)多級(jí)腦靶向目。
[0018] 本發(fā)明中，以R⑶三肽為活性中心的多肽包括五肽、七肽、環(huán)肽或擬肽化合物，所 述的R⑶肽是由精氨酸一甘氨酸一天冬氨酸構(gòu)成的三肽序列（Arg-Gly-Asp);本發(fā)明的實(shí) 施例中優(yōu)選環(huán)狀RGD多肽；
[0019] 在本發(fā)明中，進(jìn)行了以RGD為活性中心的多肽作為靶頭在構(gòu)建缺血性腦卒中靶向 遞藥系統(tǒng)試驗(yàn)，結(jié)果表明，本發(fā)明以RGD為活性中心的多肽作為靶頭，應(yīng)用于不同給藥系統(tǒng) 后，可獲得明顯的腦靶向遞藥的效果，并顯著提高了模型藥的療效。
[0020] 本發(fā)明中，所述的遞藥系統(tǒng)包括但不限于：脂質(zhì)體、納米粒、磷脂復(fù)合物、微球、聚 合物、納米球、納米乳、自微乳、包合物等任何一種常見(jiàn)于臨床的劑型；
[0021] 本發(fā)明中，所述的RGD肽應(yīng)用于遞藥系統(tǒng)的方式包括但不限為：與遞藥系統(tǒng)中的 任何一種常見(jiàn)的功能性材料偶聯(lián)，所述的功能性材料為：一端含NHS活潑酯，一端含疏基等 任何一種常見(jiàn)的可與多肽發(fā)生反應(yīng)的基團(tuán)，本發(fā)明的實(shí)施例中，優(yōu)選的功能性材料包括但 不限定為：功能性磷脂、功能性膽固醇、功能性PEG、功能性聚合物、功能性膽固醇等
[0022] 本發(fā)明中，以RGD為活性中心的線性肽及環(huán)狀肽修飾納米給藥系統(tǒng)，可顯著提高 該系統(tǒng)在缺血性腦卒中缺血病灶的藥物蓄積，具有明顯的腦內(nèi)病變部位的二級(jí)靶向遞藥特 征。應(yīng)用該系統(tǒng)包載抗氧化藥物，可明顯提高依達(dá)拉奉在缺血再灌注模型大鼠體內(nèi)的抗氧 化效果，降低梗死體積。其機(jī)制主要涉及到缺血性腦卒中發(fā)病過(guò)程中的炎癥反應(yīng)。
[0023] 下面結(jié)合附圖和具體的實(shí)施方案僅作為本發(fā)明的解釋，但絕不是對(duì)本發(fā)明的限 制。
【附圖說(shuō)明】
[0024] 圖I，RGD及反應(yīng)液TLC檢識(shí)圖。
[0025] 圖2, RGDL粒徑分布㈧及透射電鏡照片（B)。
[0026] 圖3I/R裸鼠給予RGDL-Dir后腦部熒光照片，其中，
[0027] A: RGDL-Dir ;B: PL-Dir〇
[0028] 圖 4, DSPE-PEG-NHS (A)和 DSPE-PEG-cRGD (B)modi-toff 圖譜。
[0029] 圖5，cRGDL及PL粒徑分布。
[0030] 圖6，cRGDL及PL透射電鏡照片。
[0031] 圖7,激光共聚焦顯微鏡照片，其中
[0032] A綠色：CFSE染色的THP-I細(xì)胞；B紅色：Cy5標(biāo)記的脂質(zhì)體；C :AB疊加照片。
[0033] 圖8, cRGDL-Dir及PL-Dir給予I/R裸鼠后活體熒光照片，其中
[0034] A: cRGDL-Dir ;B: PL-Dir。
[0035] 圖9, I/R裸鼠給予PL-Dir或cRGDL-Dir后腦組織切片TTC染色（A)及熒光照片 ⑶。
[0036] 圖10,炎癥小鼠給予PG溶液組，普通納米粒組PG，cRGD-NP及cRGD-NP后組織分 布結(jié)果。
[0037] 圖11，I/R大鼠分別于在再灌后不同時(shí)間給予不同處方后腦梗死體積結(jié)果。
[0038] 圖 12, I/R 裸鼠給予 PL-Dir，RGDL-Dir 及 cRGDL-Dir 后活體熒光。
【具體實(shí)施方式】
[0039] 實(shí)施例1
[0040] RGD與憐脂的偶聯(lián)：
[0041] 精密稱取適量線性 RGD 三肽和 DSPE-PEG-NHS(肽：DSPE-PEG-NHS = 1:2, molar ratio)，分別溶解于少量無(wú)水無(wú)氨DMF中，攪拌至全部溶解。將肽溶液緩慢滴加至快速攪拌 下的DSPE-PEG-NHS溶液中，加入少量三乙胺調(diào)節(jié)pH至堿性，通氮?dú)獗Ｗo(hù)，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)24 小時(shí)。反PL應(yīng)過(guò)程中用TLC法茚三酮顯色反應(yīng)跟蹤檢測(cè)，直至肽的斑點(diǎn)消失，終止反應(yīng)。 TLC展開(kāi)劑為正丁醇：冰醋酸：水=3:1:2。反應(yīng)終點(diǎn)TLC照片見(jiàn)圖1。結(jié)果薄層板左側(cè) R⑶斑點(diǎn)清晰可見(jiàn)，說(shuō)明該反應(yīng)可靈敏檢出R⑶肽，右側(cè)反應(yīng)終點(diǎn)時(shí)已不能檢出RGD，說(shuō)明已 反應(yīng)完全。葡聚糖凝膠柱G-50分離純化得到DSPE-PEG-R⑶凍干備用；
[0042] RGD修飾的脂質(zhì)體（RGDL)的制備：
[0043] 稱取大豆磷脂100mg，A膽固醇20mg，DSPE-PEG-RGD 4mg置于250mL茄形瓶中，加 入IOmL氯仿溶解，室溫旋蒸成膜。加入3mL無(wú)水乙醚，將磷脂膜復(fù)溶，再加入ImL蒸餾水， 水浴超聲5min形成白色的w/o乳劑。40°C旋蒸，抽去乙醚，形成粘稠透明凝膠后，補(bǔ)加9mL 水，繼續(xù)旋轉(zhuǎn)洗膜，磁力攪拌lh，探頭超聲，得RGDL ;
[0044] 處方中不加入DSPE-PEG-RGD，按上述方法制備得到普通脂質(zhì)體（plain liposome， PL);焚光標(biāo)記脂質(zhì)體的制備：
[0045] 將Dir加入脂質(zhì)體處方（Dir:磷脂1:100mol/mol)，然后同上稱取大豆磷脂 l〇〇mg，膽固醇20mg，DSPE-PEG-RGD 4mg置于250mL茄形瓶中，加入IOmL氯仿溶解，室溫旋 蒸成膜。加入3mL無(wú)水乙醚，將磷脂膜復(fù)溶，再加入ImL蒸餾水，水浴超聲5min形成白色的 w/o乳劑。40°C旋蒸，抽去乙醚，形成粘稠透明凝膠后，補(bǔ)加9mL 7K，繼續(xù)旋轉(zhuǎn)洗膜，磁力攪拌 lh，探頭超聲，得Dir標(biāo)記的RGDL-Dir ;
[0046] 處方中不加入DSPE-PEG-RGD，按上述方法制備得到熒光標(biāo)記的普通脂質(zhì)體 PL-Dir ；
[0047] RGDL的評(píng)價(jià)：將制備的RGDL適當(dāng)稀釋，以粒徑儀測(cè)其粒度分布及Zeta電位，結(jié)果 如圖2A-B所示，RGDL粒徑約為115nm，形態(tài)為類圓形；
[0048] 采用大腦中動(dòng)脈閉塞術(shù)制備裸鼠缺血再灌注（I/R，Ischemic/Reperfusion)模 型。將RGDL-Dir給予I/R模型裸鼠，給藥后采0. 511、111、311、611、9、1211用小動(dòng)物活體成像儀 觀察裸鼠腦部熒光強(qiáng)度，結(jié)果見(jiàn)圖3 (紅色方框內(nèi)為腦部），結(jié)果可見(jiàn)，RGDL-Dir組裸鼠腦部 給藥后Ih即出現(xiàn)明顯的熒光，3-9小時(shí)內(nèi)均持續(xù)檢測(cè)到較強(qiáng)的熒光。PL-Dir組Ih有微弱 熒光，其他時(shí)間內(nèi)與RGDL-Dir相比均未檢測(cè)到熒光，說(shuō)明RGDL-Dir可明顯的聚集于腦內(nèi)， 具有較強(qiáng)的腦靶向作用。
[0049] 實(shí)施例2
[0050] RGD環(huán)肽與磷脂的偶聯(lián)：
[0051] 精密稱取適量 RGD 五環(huán)肽（cRGD，Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys)和 DSPE-PEG-NHS (肽：DSPE-PEG-NHS = 2:1，molar ratio)，分別溶解于少量無(wú)水無(wú)氨 DMF 中， 攪拌至全部溶解。將肽溶液緩慢滴加至快速攪拌下的DSPE-PEG-NHS溶液中，加入少量三乙 胺調(diào)節(jié)pH至堿性，通氮?dú)獗Ｗo(hù)，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)24小時(shí)。葡聚糖凝膠將DSPE-PEG-cRGD與未 反應(yīng)的小肽分離。然后將DSPE-PEG-cR⑶和DSPE-PEG-NHS進(jìn)行modi-toff檢測(cè)，結(jié)果如圖 4所示，從圖中可以看出，DSPE-PEG-NHS的平均分子量為4273, DSPE-PEG-cR⑶的平均分子 量為4633, DSPE-PEG-cR⑶的質(zhì)子峰向右迀移，說(shuō)明cR⑶肽已成功和DSPE-PEG-NHS偶聯(lián)；
[0052] cRGD修飾的脂質(zhì)體（cRGDL)的制備：
[0053] 稱取大豆磷脂100mg，A膽固醇20mg，DSPE-PEG-cRGD 6mg置于250mL茄形瓶中，加 入IOmL氯仿溶解，室溫旋蒸成膜。加入3mL無(wú)水乙醚，將磷脂膜復(fù)溶，再加入ImL蒸餾水， 水浴超聲5min形成白色的w/o乳劑。40°C旋蒸，抽去乙醚，形成粘稠透明凝膠后，補(bǔ)加9mL 水，繼續(xù)旋轉(zhuǎn)洗膜，磁力攪拌lh，探頭超聲，得cRGDL ;
[0054] 處方中不加入DSPE-PEG-cRGD，按上述方法制備得到普通脂質(zhì)體（plain liposome，PL);焚光標(biāo)記脂質(zhì)體的制備：
[0055] 將碘化1，Γ -雙十八烷基3, 3, 3'，3' -四甲基吲三羰花青（Dir)或3H-吲哚菁 類染料（Cy5)加入脂質(zhì)體處方（Dir/Cy5:磷脂l:100mol/mol)，然后同上稱取大豆磷脂 l〇〇mg，膽固醇20mg，DSPE-PEG-cRGD 6mg置于250mL茄形瓶中，加入IOmL氯仿溶解，室溫旋 蒸成膜。加入3mL無(wú)水乙醚，將磷脂膜復(fù)溶，再加入ImL蒸餾水，水浴超聲5min形成白色的 w/o乳劑。40°C旋蒸，抽去乙醚，形成粘稠透明凝膠后，補(bǔ)加9mL 7K，繼續(xù)旋轉(zhuǎn)洗膜，磁力攪拌 lh，探頭超聲，得Dir標(biāo)記的cRGDL-Dir ;Cy5標(biāo)記的cRGDL-Cy5 ;
[0056] 處方中不加入DSPE-PEG-cRGD，按上述方法制備得到熒光標(biāo)記的普通脂質(zhì)體 PL-Dir 或 PL-Cy5 ;
[0057] cRGDL的評(píng)價(jià)：將制備的cRGDL及PL適當(dāng)稀釋，以粒徑儀測(cè)其粒度分布，透射電鏡 觀察其形態(tài)，結(jié)果見(jiàn)圖5-6。cRGDL粒徑約為114nm，PL粒徑約為llOnm，二者平均粒徑及粒 徑分布無(wú)顯著差異，cRGDL及PL透射電鏡觀察均為類圓形；
[0058] 將人單核細(xì)胞株THP-I細(xì)胞株用含10% FBS、5 % NEAA、5 % PS的1640細(xì)胞培養(yǎng) 基培養(yǎng)在37°C，5% CO2的培養(yǎng)箱中，隔天換液，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到IX 10 5個(gè)/cm 2時(shí)加入羧基 熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯（CFSE)細(xì)胞質(zhì)染料孵育。然后cRGDL-Cy5脂質(zhì)體共同孵育 30min，激光共聚焦顯微鏡觀察脂質(zhì)體被THP-I細(xì)胞攝取的情況，結(jié)果如圖7所示，cRGDL可 被THP-I大量攝取進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，THP-I為人源白細(xì)胞株，說(shuō)明cRGDL可以與白細(xì)胞結(jié)合；
[0059] 采用大腦中動(dòng)脈閉塞術(shù)制備裸鼠缺血再灌注（I/R，Ischemic/Reperfusion)模 型。將cRGDL-Dir給予I/R模型裸鼠，給藥后采0. 5h、lh、2h、4h、6、8h用小動(dòng)物活體成像 儀觀察裸鼠腦部熒光強(qiáng)度，結(jié)果見(jiàn)圖8。結(jié)果可見(jiàn)，cRGDL-Dir組裸鼠腦部給藥后30min后 即出現(xiàn)明顯的熒光，8小時(shí)內(nèi)均持續(xù)檢測(cè)到較強(qiáng)的熒光，PL-Dir組均未檢測(cè)到熒光，說(shuō)明 cRGDL-Dir可明顯的聚集于腦內(nèi)，具有較強(qiáng)的腦靶向作用；
[0060] 12h后將動(dòng)物處死，取腦組織腦冷凍切片TTC染色后發(fā)于小動(dòng)物活體成像儀檢測(cè)， 結(jié)果見(jiàn)圖10。TTC切片染色中可見(jiàn)白色部分為缺血區(qū)域（如圖9A所示），活體成像照片中 左側(cè)對(duì)應(yīng)區(qū)域可見(jiàn)明顯熒光聚集（如圖9B所示），與TTC染色缺血區(qū)域重合，說(shuō)明cR⑶修 飾的脂質(zhì)體與普通脂質(zhì)體相比具有明顯的二級(jí)腦靶向作用，可聚集于腦內(nèi)缺血部位。
[0061] 實(shí)施例3
[0062] 載掊丙酯（PG)納米粒的制備及靶向性評(píng)價(jià)
[0063] 將掊丙酯 100mg、單甘酯 600mg，2mol % 的 DSPE-PEG-RGD 或 DSPE-PEG-cRGD，溶于 15ml乙醇中，超聲溶解，再加入磷脂100mg，微熱形成有機(jī)相。另取泊洛沙姆溶于水中，構(gòu)成 泊洛沙姆濃度為〇. 5 %的水相，在攪拌下將有機(jī)相用針頭注入30ml水相中，整個(gè)過(guò)程保持 溫度在75°C左右，繼續(xù)攪拌，濃縮體積至原來(lái)的1/3,將所得的半透明體系快速混于0-2°C 的20ml水相中，繼續(xù)攪拌90min，即得載藥RGD-NP，cRGD-NP ;
[0064] 按上述方法不加入DSPE-PEG-RGD或DSPE-PEG-cR⑶即可得載藥普通納米粒NP ;
[0065] 將上述三種納米粒及PG藥物溶液組尾靜脈給予IL-I β致炎癥模型小鼠，每組12 只，劑量分別以PG計(jì)算為12mg/kg ;給藥后10,15min立即處死，解剖取心、肝、脾、肺、腎、 腦組織；組織樣品用生理鹽水沖洗表面血液和內(nèi)容物后，濾紙吸干后稱重，裝入自封袋中， 于-20°C冰箱凍存待測(cè)，取各組織樣品取0.1 g(不夠0.1 g的全取），加入lmL30%甲醇溶 液進(jìn)行組織勻漿，測(cè)定給藥后各組織藥物含量，結(jié)果如圖10所示，與溶液組PG相比，NP， RGD-NP，cRGD-NP均可顯著提高藥物腦內(nèi)濃度，且RGD-NP及cRGD-NP效果優(yōu)于NP ;cRGD-NP 與RGD-NP相比，腦內(nèi)藥物濃度顯著提高，說(shuō)明cRGD-NP腦靶向作用強(qiáng)于RGD-NP。
[0066] 實(shí)施例4
[0067] 載依達(dá)拉奉脂質(zhì)體的制備
[0068] 精密稱取大豆磷脂100mg，膽固醇20mg，依達(dá)拉奉10mg，2mol %的DSPE-PEG-RGD或 DSPE-PEG-cRGD置于250ml茄形瓶中，加入IOml無(wú)水乙醇，水域超聲完全溶解，25°C減壓旋 轉(zhuǎn)蒸干成膜，加入蒸餾水溶液l〇ml，25°C旋轉(zhuǎn)使膜溶解，探頭超聲。即可得到載有依達(dá)拉奉 的ER-RGD-L，ER-cRGD-L。如果不加入DSPE-PEG-RGD或DSPE-PEG-cR⑶即得到普通脂質(zhì)體 ERL，分別測(cè)定三種脂質(zhì)體的包封率，載藥量，平均粒徑及Zeta電位，結(jié)果如表1所示，三種 脂質(zhì)體包封率約為75%，載藥量約為5%，平均粒徑IlOnm左右，Zeta電位-20mV左右，由 此可見(jiàn)載入藥物或RGD/cRGD靶頭修飾不影響脂質(zhì)體理化性質(zhì)；
[0069] 表1三種脂質(zhì)體理化性質(zhì)表征
[0071] 載依達(dá)拉奉脂質(zhì)體藥效學(xué)評(píng)價(jià)
[0072] SD大鼠90只，隨機(jī)分為6組，分別為：假手術(shù)組、依達(dá)拉奉溶液組（ERS組）、ERL 組、ER-RGD-L組、ER-cRGD-L組，模型組（Model組）。實(shí)驗(yàn)前12h禁食，自由飲水，大腦中動(dòng) 脈閉塞術(shù)建立大鼠 I/R模型，于再灌他、311、611、1211、2411尾靜脈分別注射上述4種不同的制 劑，假手術(shù)組及模型組給予PBS水溶液。48h后進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，結(jié)果如表2所示，然后用 0. 9% NaCl溶液將大鼠心臟灌流，取出腦組織，在-20°C條件下速凍20min后切片，2% TTC 染色后計(jì)算腦梗死面積％，結(jié)果如圖12所示，
[0073] 腦梗死面積％ =(手術(shù)側(cè)半球的面積一手術(shù)側(cè)未梗死部的面積）/手術(shù)側(cè)半球的 面積X 100%
[0074] 神經(jīng)功能評(píng)分結(jié)果
[0075] 各組大鼠給藥48h后對(duì)其進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，從表2中看出，再灌各個(gè)時(shí)間點(diǎn)給藥 后，模型組大鼠均無(wú)法行走，神經(jīng)功能得分最高（平均4分），表明造模成功。ERS組除Oh 及24h給藥外，神經(jīng)功能評(píng)分與模型組有顯著性差異，下降幅度不大（平均3. 4分）動(dòng)物表 現(xiàn)為可以行走，但出現(xiàn)向一側(cè)傾倒的現(xiàn)象，說(shuō)明再灌后3-12h給予依達(dá)拉奉可促進(jìn)I/R動(dòng)物 神經(jīng)功能恢復(fù)，但程度較小，
[0076] ERL組0_24h給藥神經(jīng)功能評(píng)分與模型組均有顯著性差異說(shuō)明ERL對(duì)I/R大鼠的 神經(jīng)功能恢復(fù)具有明顯的促進(jìn)作用（平均3分）；與ERS組相比，Oh及24h給藥與ERS組有 顯著性差異，3-12h給藥評(píng)分與ERS組無(wú)顯著性差異，說(shuō)明3-12h給藥ERL與ERS促進(jìn)神經(jīng) 功能恢復(fù)的程度無(wú)差異，但ERL可明顯加寬ER的治療窗，將給藥時(shí)間延長(zhǎng)至24h，
[0077] ER-RGD-L組0_24h給藥后多數(shù)動(dòng)物只表現(xiàn)出行走時(shí)順時(shí)針旋轉(zhuǎn)，神經(jīng)功能評(píng)分與 模型組、ERS組及ERL組相比均有顯著性差異，說(shuō)明ER-RGD-L具有明顯的促進(jìn)神經(jīng)功能恢 復(fù)作用，且恢復(fù)程度顯著高于ERS及ERL，
[0078] ER-cRGD-L組0_24h給藥后動(dòng)物僅僅出現(xiàn)右前肢無(wú)法伸直，無(wú)不能行走、行走傾 倒或順時(shí)針轉(zhuǎn)圈的現(xiàn)象出現(xiàn)，神經(jīng)功能評(píng)分最低且下降幅度最大，與模型組、ERS、ERL及 ER-RGD-L相比均具有顯著性差異，說(shuō)明ER-cRGD-L各時(shí)間點(diǎn)給藥均具有明顯的治療效果， 且效果顯著優(yōu)于ER-RGD-L、ERL、ERS及模型組，動(dòng)物神經(jīng)功能恢復(fù)水平在各組中處于最優(yōu) 水平；
[0079] 表.2神經(jīng)功能評(píng)分結(jié)果（η = 3)
[0081] 腦梗死面積評(píng)價(jià)結(jié)果
[0082] 圖11腦梗死面積計(jì)算結(jié)果表明，模型組大鼠梗死體積達(dá)到30%以上，說(shuō)明造模成 功，假手術(shù)組未出現(xiàn)梗死，說(shuō)明并沒(méi)有假陽(yáng)性結(jié)果的干擾；ERS組與模型組比較，0_24h給藥 后梗死面積均有顯著性差異，ER可減小梗死面積，但0-24h不同時(shí)間給藥效果無(wú)差異；
[0083] ERL組0_24h給藥，腦梗死面積與模型組比較均具有顯著性差異，說(shuō)明ERL可顯著 減小IS造成的腦梗死面積；與ERS組比較，0-6h給藥梗死面積無(wú)顯著性差異，12h及24h給 藥梗死面積顯著小于ERS組，說(shuō)明ERL0-6h內(nèi)給藥對(duì)ER治療效果無(wú)增強(qiáng)作用，但12h及24h 給藥可顯著提高ER治療效果且拓寬了 ERS的治療窗；
[0084] ER-RGD-L組及ER-cRGD-L組0-24h給藥與模型組、ERS組及ERL組比較，腦梗死面 積均有顯著下降，且ER-cRGD-L組下降得更多，說(shuō)明ER-RGD-L及ER-cRGD-L均可增強(qiáng)ER治 療作用，效果優(yōu)于ERL，且ER-cRGD-L作用效果最優(yōu)；
[0085] 熒光標(biāo)記的PL，RGDL及cRGDL的制備及靶向性評(píng)價(jià)
[0086] 稱取大豆磷脂 300mg，膽固醇 60mg，DSPE-PEG-RGD 或 DSPE-PEG-cRGD 2mol %置于 250mL茄形瓶中，加入IOmL氯仿溶解，室溫旋蒸成膜。加入3mL無(wú)水乙醚，將磷脂膜復(fù)溶， 再加入ImL蒸餾水，水浴超聲5min形成白色的w/o乳劑。40°C旋蒸，抽去乙醚，形成粘稠透 明凝膠后，補(bǔ)加9mL水，繼續(xù)旋轉(zhuǎn)洗膜，磁力攪拌lh，探頭超聲，得RGDL-Dir和cRGDL-Dir。 如果不加入DSPE-PEG-RGD或DSPE-PEG-cRGD，即得到PL-Dir。將三種脂質(zhì)體分別給予 I/R模型裸鼠，并與給藥后24h于小動(dòng)物活體熒光儀檢測(cè)熒光，結(jié)果如圖12所示，結(jié)果與 PL-Dir相比，RGDL-Dir和cRGDL-Dir具有明顯的腦靶向作用，且cRGDL-Dir作用明顯強(qiáng)于 R ⑶ L-Dir〇
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種以RGD為活性中心的多肽，其特征在于，所述多肽包括五肽、七肽、環(huán)肽或擬肽 化合物，所述的R⑶肽是由精氨酸一甘氨酸一天冬氨酸構(gòu)成的三肽序列（Arg-Gly-Asp)。2. 權(quán)利要求1所述的RGD為活性中心的多肽在制備缺血性腦卒中靶向遞藥系統(tǒng)中的用 途，其中所述的多肽作為靶頭。3. 按權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于，所述的遞藥系統(tǒng)選自脂質(zhì)體、納米粒、磷脂 復(fù)合物、微球、聚合物、納米球、納米乳、自微乳或包合物中任何一種劑型。4. 按權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于，所述的RGD肽用于遞藥系統(tǒng)的方式為：與遞 藥系統(tǒng)中的任何一種常見(jiàn)的功能性材料偶聯(lián)。5. 按權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于，所述的功能性材料為：一端含NHS活潑酯， 一端含巰基的可與多肽發(fā)生反應(yīng)的基團(tuán)。6. 按權(quán)利要求4或5所述的用途，其特征在于，所述的功能性材料為：功能性磷脂、功 能性膽固醇、功能性PEG、功能性聚合物或功能性膽固醇等。
【文檔編號(hào)】C07K7/06GK105859832SQ201510024557
【公開(kāi)日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2015年1月19日
【發(fā)明人】秦晶, 王建新, 侯佳, 楊旭, 謝運(yùn)飛
【申請(qǐng)人】復(fù)旦大學(xué)