一種陽離子聚合物基因載體及其制備方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種陽離子聚合物基因載體，該基因載體以N?3?氨丙基甲基丙烯酰胺和N?(1，3?二羥基?2?丙基)甲基丙烯酰胺為單體，采用可逆加成斷裂鏈轉(zhuǎn)移聚合法合成了嵌段聚合物N?(1，3?二羥基?2?丙基)甲基丙烯酰胺?b?N?3?氨丙基甲基丙烯酰胺聚合物，隨后在N?3?氨丙基甲基丙烯酰胺鏈段上偶聯(lián)胍基基團(tuán)，得到N?(1，3?二羥基?2?丙基)甲基丙烯酰胺?b?N?3?胍丙基甲基丙烯酰胺聚合物聚合物。其中，胍基化的N?3?氨丙基甲基丙烯酰胺鏈段所占聚合物的比例為8.3％～57％。本發(fā)明還提出了上述基因載體的制備方法。本發(fā)明的基因載體可以攜帶基因藥物且具有良好的生物相容性，應(yīng)用前景大。
【專利說明】
一種陽離子聚合物基因載體及其制備方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種陽離子聚合物基因載體及其制備方法和應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 陽離子聚合物是一類新型非病毒基因載體，其具有病毒類基因載體所沒有的良好 的物理化學(xué)性質(zhì)、高度的分子多樣性、低免疫原性、結(jié)構(gòu)易于修飾、攜帶基因大小和類型不 受限制等優(yōu)點[1]。聚乙烯亞胺是目前應(yīng)用最為廣泛的陽離聚合物基因載體，1995年Boussif 等首次報道了 PEI可作為陽離子聚合物基因載體攜帶含有負(fù)電的DNA分子形成PEI/DNA復(fù)合 物[2]。這種PEI/DNA復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞的溶酶體后，PEI分子鏈上的氮原子被質(zhì)子化，使溶酶體 pH升高，引起C1離子內(nèi)流，從而導(dǎo)致溶酶體破裂復(fù)合物逃逸出來，DNA得到表達(dá)。而N-3-氨丙 基甲基丙烯酰胺(ΑΡΜΑ)是具有伯胺基殘基的單體，該單體合成的均聚物載體在基因遞送研 究中顯示了較高的轉(zhuǎn)染效果[3]。
[0003] N-(l，3-二羥基-2-丙基）甲基丙烯酰胺(DHPMA)是一類親水性交好的單體，其均聚 物作為聚合物載體的親水性鏈段，使DHPMA對陽離子聚合物的正電荷掩蔽作用及血液中蛋 白沉積的抑制作用更強(qiáng)，使聚合物具有低毒性等優(yōu)點[4'5]。此外，DHPMA作為人工聚合物，分 子量范圍很寬，選擇的自由度高[6]。聚合物骨架具有親水性鏈段，使其具有舒展的分子結(jié) 構(gòu)，并對其本身的正電荷進(jìn)行適當(dāng)保護(hù)，提高載體在靶細(xì)胞外的穩(wěn)定性能，減少細(xì)胞毒 性[7'8]。
[0004] 1988年，Green等證實人免疫缺損病毒HI V-1的反式激活蛋白Tat蛋白能跨膜轉(zhuǎn)移 到細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)，從而大大提高基因組的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制水平，同時發(fā)現(xiàn)果蠅觸角足轉(zhuǎn)錄 因子ANTP的同源異構(gòu)結(jié)構(gòu)域、單純皰疹病毒1型VP22轉(zhuǎn)錄因子等都具有強(qiáng)大的細(xì)胞膜穿透 能力，而且?guī)缀醪皇芗?xì)胞類型的限制+11]。人們把這類能攜帶大分子物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞，具有細(xì) 胞膜穿透能力的短肽，稱為細(xì)胞穿透肽(Cell Penetrating Peptides，CPPs)，或特洛伊木 馬肽(Trojan horse peptides)。研究結(jié)果表明，精氨酸能有效轉(zhuǎn)運(yùn)穿透細(xì)胞膜，在細(xì)胞穿 透過程中扮演非常重要的角色，研究推測精氨酸中的特征基團(tuán)(胍基基團(tuán)）是賦予此類物質(zhì) 細(xì)胞膜穿透能力的功能部分。Wender等合成了一系列聚胍基類肽衍生物，利用截斷的和丙 氨酸取代的Tat類似多肽發(fā)現(xiàn)，陽離子區(qū)對于Tat多肽的細(xì)胞攝取能力很重要，可能是因為 陽離子區(qū)有助于Tat多肽和細(xì)胞之間的相互作用從而促進(jìn)細(xì)胞攝取[12]。實驗發(fā)現(xiàn)N-烷基化 氨基乙酸多肽衍生物的細(xì)胞攝取效率甚至比Tat高20倍，這說明了胍基在細(xì)胞攝取中起到 關(guān)鍵的作用。
[0005] RNA干擾(RNAi)作為21世紀(jì)最重要發(fā)現(xiàn)之一為基因治療奠定了堅實的基礎(chǔ)，能夠 有效的觸發(fā)基因沉默是RNA干擾技術(shù)成功應(yīng)用的關(guān)鍵。RNA干擾始于Dicer酶，作為RNaselll 家族的Dicer酶剪切dsRNA生成19-21個核苷酸的小干擾RNA(siRNA)片段[13_15]。這些siRNA 通過與Argonaute 2蛋白形成RNA沉默效應(yīng)復(fù)合體進(jìn)而選擇性的沉默目的mRNA[16-18]。盡管 在體外細(xì)胞培養(yǎng)和動物體內(nèi)研究中，siRNA顯示出良好的對目標(biāo)基因的抑制效果，但在治療 人類疾病過程中，siRNA在系統(tǒng)給藥方面面臨著許多障礙，如較弱的細(xì)胞膜穿透能力，無靶 向性，且在生理環(huán)境中不穩(wěn)定。因此siRNA藥物開發(fā)的一個關(guān)鍵是傳輸體系，而如何增強(qiáng) siRNA在體內(nèi)的穩(wěn)定性和穿透細(xì)胞膜的能力，以及增強(qiáng)疾病治療中對細(xì)胞和組織靶向性等 都是急切需要解決的問題。因此除了尋找和篩選高效特異性的siRNA藥物分子之外，靶向特 定組織或靶細(xì)胞的傳輸體系，就成為發(fā)展和實施RNA干擾療法的另一個關(guān)鍵所在。而理想的 基因遞送載體要能使治療基因在靶細(xì)胞中獲得安全、高效、可控且穩(wěn)定的表達(dá)。通常，依據(jù) 載體的性質(zhì)可以將基因載體分為兩類，病毒型基因載體(viral vector)和非病毒型基因載 體(non-viral vector)。然而，自從人們認(rèn)識到病毒可以入侵宿主細(xì)胞并將自身核酸整合 到宿主核酸中，病毒類載體就作為一種有效的核酸載體用于臨床實驗。常用的病毒載體，包 括腺病毒(adenovirus，AV)和逆轉(zhuǎn)錄病毒(retrovirus，RV)。但是，高昂的生產(chǎn)成本、進(jìn)入體 內(nèi)后的諸多缺點（如無靶向性、產(chǎn)生免疫原性等）限制了其實際使用[19]。另外，1999年美國 出現(xiàn)首例因使用腺病毒載體而導(dǎo)致病人死亡的事件同樣加快了對于非病毒型基因載體的 開發(fā)[2()]。所以，尋找新型的載體來克服病毒載體的缺點并發(fā)揮核酸藥物的優(yōu)勢就變得非常 重要了。
[0006] 基于高分子材料的基因載體已經(jīng)廣泛用于對siRNA分子的傳遞，其中很多成果進(jìn) 入臨床試驗。高分子基因載體具有較好的生物相容性和靶向傳遞的潛力，能有效提高生物 活性分子在生理環(huán)境中的穩(wěn)定性。高分子基因載體在系統(tǒng)給藥后會產(chǎn)生EPR效應(yīng)(Enhanced permeability and retention)，進(jìn)而促進(jìn)其在腫瘤組織的富集，因此高分子載體是極具潛 能的基因藥物傳遞體[21]。而本發(fā)明提供的具有高效轉(zhuǎn)染能力的高分子載體，能有效負(fù)載疏 水藥物并保護(hù)siRNA分子，實現(xiàn)靶向治療的同時干擾目的基因表達(dá)，達(dá)到協(xié)同治療效果。因 此，本發(fā)明提供的高分子載體在協(xié)同給藥系統(tǒng)中具有更好的優(yōu)勢和應(yīng)用前景。
[0007] 參考文獻(xiàn)
[0008] [l]Lares MR,Rossi JJ,0uellet DL. RNAi and small interfering RNAs in human disease therapeutic applications.Trends in biotechnology.2010；28：570-9.
[0009] [2]Boussif 0，Lezoualc'hF，Zanta MA，Mergny MD，Scherman D，Demeneix B，et al.A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo：polyethylenimine.Proceedings of the National Academy of Sciences.1995;92:7297-301·
[0010] [3]York Aff,Zhang Y,Holley AC,Guo Y,Huang F, McCormick CL.Facile Synthesis of Multivalent Folate-Block Copolymer Conjugates via Aqueous RAFT Polymerization ： Targeted Delivery of siRNA and Subsequent GeneS^ppressionl:. Biomacromolecules.2009；10：936-43.
[0011] [4]Luo D,Haverstick K,Belcheva N,Han E,Saltzman WM.Poly(ethylene glycol)-conjugated PAMAM dendrimer for biocompatible , high-efficiency DNA delivery.Macromolecules.2002；35：3456-62.
[0012] [5]Kichler A，Chillon M，Leborgne C，Danos 0,Frisch B. Intranasal gene delivery with a polyethylenimine-PEG conjugate.J Control Release.2002；81：379- 88.
[0013] [6]I taka K,Yamauchi K,Harada A, Nakamura K, Kawaguchi H,Kataoka K.Polyion complex micelles from plasmid DNA and poly(ethylene glycol)-poly(- lysine)block copolymer as serum-tolerable polyplex system：physicochemical properties of micelles relevant to gene transfection efficiency.Biomaterials.2003；24:4495-506.
[0014] [7]Li SD，Huang L.Targeted delivery of antisense oligodeoxynucleotide and small interference RNA into lung cancer cells.Mol Pharmaceut.2006；3：579- 88.
[0015] [8]de Wolf HK，Snel CJ，Verbaan FJ，Schiffelers RM，Hennink WE，Storm G.Effect of cationic carriers on the pharmacokinetics and tumor localization of nucleic acids after intravenous administration. International Journal of Pharmaceutics.2007;331:167-75.
[0016] [9]Green M?Loewenstein PM.Autonomous functional domains of chemically synthesized human immunodeficiency virus tat trans-activator protein.Cell.1988；55：1179-88.
[0017] [10]Derossi D，Joliot AH，Chassaing G，Prochiantz A.The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes.J Biol Chem.1994;269:10444-50.
[0018] [ll]Elliott G，07Hare P.Intereellular trafficking and protein delivery by a herpesvirus structural protein.Cell.1997；88:223-33.
[0019] [12]Wender PA，Mitchell DJ，Pattabiraman K，Pelkey ET，Steinman L， Rothbard JB.The design?synthesis?and evaluation of molecules that enable or enhance eellular uptake：peptoid molecular transporters . Proceedings ofthe National Academy of Sciences.2000；97：13003-8.
[0020] [13]Bernstein E，Caudy AA，Hammond SM，Hannon GJ.Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step ofRNA interference.Nature.2001；409：363-6.
[0021] [14]Elbashir SM，Harborth J，Lendeckel W，Yalcin A，Weber K，Tuschl T. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian celIs.Nature.2001；411:494-8.
[0022] [15]Hammond SM，Bernstein E，Beach D，Hannon GJ.An RNA-directed nuclease mediates post-transcriptional gene silencing in Drosophila cells.Nature.2000； 404:293-6.
[0023] [16]Hammond SM，Boettcher S，Caudy AA，Kobayashi R，Hannon GJ.Argonaute2， a link between genetic and biochemical analyses of RNAi. Science Signaling.2001；293：1146.
[0024] [17]Song JJ?Smith SK?Hannon GJ?Joshua-Tor L.Crystal structure of Argonaute and its implications for RISC slicer activity . Science .2004；305 ： 1434-7.
[0025] [18]Liu J，Carmell MA，Rivas FV，Marsden CG，Thomson JM，Song J-J，et al.Argonaute2is the catalytic engine of mammalian RNAi. Science Signaling.2004；305：1437.
[0026] [19]Collins SA，Guinn B_a，Harrison PT，Scallan MF，0Sullivan GC，Tangney M.Viral vectors in cancer immunotherapy：which vector for which strategy? Current gene therapy.2008;8:66-78.
[0027] [20]Glover DJ，Lipps HJ，Jans DA.Towards safe，non_viral therapeutic gene expression inh umans.Nature reviews Genetics.2005;6:299-310.
[0028] [21]Hussain AF，Kriiger HR，Kampmeier F，Weissbach T，Licha K，Kratz F，et al. Targeted Delivery of Dendritic Polyglycerol-Doxorubicin Conjugates by scFv-SNAP Fusion Protein Suppresses EGFR+Cancer Cell Growth. Biomacromolecules.2013；14：2510-20.

【發(fā)明內(nèi)容】

[0029] 發(fā)明目的：為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供一種陽離子聚合物基因載 體。
[0030] 本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題在于提供上述陽離子聚合物基因載體的制備方法和 應(yīng)用。
[0031 ]技術(shù)方案:為實現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明提出了 一種陽離子聚合物基因載體，該基 因載體以N-3-氨丙基甲基丙烯酰胺和N-(l，3-二羥基-2-丙基）甲基丙烯酰胺為單體，采用 可逆加成斷裂鏈轉(zhuǎn)移聚合法合成了嵌段聚合物N-(1，3-二羥基-2-丙基）甲基丙烯酰胺-b- N-3-氨丙基甲基丙烯酰胺聚合物，隨后在N-3-氨丙基甲基丙烯酰胺鏈段上偶聯(lián)胍基基團(tuán)， 得到N-(l，3-二羥基-2-丙基）甲基丙烯酰胺-b-N-3-胍丙基甲基丙烯酰胺聚合物，其中，胍 基化的N-3-氨丙基甲基丙烯酰胺鏈段占聚合物的比例為8.3%~57%。
[0032] 優(yōu)選地，所述的陽離子聚合物基因載體的數(shù)均分子量為23700~45700g/mol。
[0033] 所述的陽離子聚合物基因載體的主鏈中聚N-3-氨丙基甲基丙烯酰胺的聚合度為 10_90，Ν_(1，3_二羥基_2_丙基）甲基丙稀醜胺聚合度為10_90。
[0034] 本發(fā)明進(jìn)一步提出了上述陽離子聚合物基因載體的制備方法，包括如下步驟：
[0035] (1)聚DHPMA聚合物的制備：
[0036] 取二硫代苯甲酸(4-氰基戊酸)酯和ACVA溶于1，4_二氧六環(huán)中，得到溶液Α，然后將 溶液Α和DHPMA的水溶液加入到聚合瓶中，通氮氣1~2h，蠟封聚合瓶，然后將聚合瓶放入預(yù) 熱至70~80°C的油浴中反應(yīng)12~24h，將聚合瓶取出，冷卻，終止聚合反應(yīng)，將得到的產(chǎn)物加 入到冰丙酮中沉淀，離心，反復(fù)溶解、沉淀若干次，最后將產(chǎn)物置于真空干燥箱50~60°C干 燥得產(chǎn)物聚DHPMA聚合物，記為TOHPMA;
[0037] (2)聚DHPMA-b-APMA 聚合物的制備：
[0038] 將PDHPMA和ΑΡΜΑ單體溶于蒸餾水中，得到溶液B，將溶液B和ACVA的二氧六環(huán)溶液 混合均勻后轉(zhuǎn)移至聚合瓶中，體系用干燥氮氣通氣1~2h，蠟封聚合瓶，將聚合瓶放入預(yù)熱 至70°C~80°C油浴中反應(yīng)12~24h，反應(yīng)結(jié)束后將聚合瓶取出，冷卻，終止聚合反應(yīng)，產(chǎn)物加 入到預(yù)冷的丙酮中沉淀，離心，反復(fù)溶解、沉淀若干次，然后將得到的產(chǎn)物置于真空干燥箱 50~60 °C干燥得到聚DHPMA-b-APMA聚合物，記為DA聚合物；
[0039] (3)N-3_胍丙基甲基丙烯酰胺-b-N_(l，3-二羥基-2-丙基）甲基丙烯酰胺聚合物的 合成：
[0040]將DA聚合物溶于水中，隨后加入胍基化試劑，優(yōu)選地用飽和碳酸鈉調(diào)節(jié)反應(yīng)溶液 pH至8~10,室溫下反應(yīng)12~24h，將產(chǎn)物置于去離子水中透析，優(yōu)選地透析24h，采用MW⑶ 8000,每2~4h換水，冷凍干燥得到產(chǎn)物N-3-胍丙基甲基丙烯酰胺-b-N-(l，3-二羥基-2-丙 基）甲基丙烯酰胺聚合物，記為DHPMA-b-GPMA。
[0041 ] 優(yōu)選地，步驟（1)中，二硫代苯甲酸(4-氰基戊酸)酯與DHPMA的摩爾比為1:10~90， 二硫代苯甲酸(4-氰基戊酸)酯與ACVA的摩爾比為1:1~4，DHPMA的水溶液中的水的質(zhì)量為 DHPMA質(zhì)量的1~5倍。
[0042] 步驟(2)中，PDHPMA聚合物與ΑΡΜΑ單體的摩爾用量比為1:10~90，PDHPMA與ACVA的 摩爾用量比為1:1~4。
[0043] 步驟(3)中，所述的胍基化試劑為1-H-吡唑-1-甲脒鹽酸鹽，DA聚合物中ΑΡΜΑ鏈段 與卜化吡唑-1-甲脒鹽酸鹽的摩爾比為1:1~10,即胍基化試劑的用量為DA聚合物鏈段中伯 氨基摩爾量2~10倍。
[0044] 本發(fā)明還提出了上述陽離子聚合物基因載體作為生物載體材料在藥物輸送中的 應(yīng)用。
[0045] 另一方面，本發(fā)明提出了一種負(fù)載基因藥物的陽離子聚合物載體，其是通過靜電 吸引將基因藥物負(fù)載在上述陽離子聚合物基因載體上得到，其中，所述的基因藥物為 s iRNA、shRNA、質(zhì)粒DNA 等。
[0046] 上述負(fù)載基因藥物，尤其是疏水藥物的陽離子聚合物載體在制備抗腫瘤藥物中的 應(yīng)用同樣在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0047] 有益效果:與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點：
[0048] (1)本發(fā)明制備的聚合物載體可大量負(fù)載基因藥物，具有較好的疏水藥物攜帶和 基因藥物結(jié)合能力；
[0049] (2)本發(fā)明制備的聚合物載體具有較好的穿透細(xì)胞膜能力；
[0050] (3)本發(fā)明制備的聚合物具有較小分子量分布且反應(yīng)可控；
[0051] (4)本發(fā)明制備的聚合物攜帶siRNA后比"金標(biāo)準(zhǔn)" PEI有更高的轉(zhuǎn)染效率。
【附圖說明】
[0052] 圖1為DA聚合物的合成路線；
[0053] 圖2為DG聚合物的1H NMR圖譜；
[0054] 圖3為DG/siRNA復(fù)合物在Ν/Ρ為1~32時的電泳阻滯圖；Α圖為DGl/siRNA-NC復(fù)合 物，B圖為DG2/s iRNA-NC復(fù)合物，C圖為DG3/s iRNA-NC復(fù)合物；
[0055] 圖4中，A為DA3/siRNA-NC復(fù)合物與系列DG/siRNA-NC復(fù)合物的粒徑圖；B為DA3/ s i RNA-NC復(fù)合物與系列DG/s iRNA-NC復(fù)合物的表面電位圖;C為DA3/s i RNA-NC復(fù)合物(上)和 DG3/s iRNA-NC復(fù)合物(下）的掃描電鏡圖；
[0056] 圖 5中，A為P-gp mRNA表達(dá)量示意圖；B為DG3/siRNA-NC組（1)、PEI/siRNA-2組(2)、 DA3/siRNA-2復(fù)合物組(3)、和DG3/siRNA-2組(4)的P-gp蛋白表達(dá)量，*表明各組與空白組有 顯著性差異(P<〇.〇5，n = 3);DG聚合物與siRNA的復(fù)合比為12;
[0057] 圖6中，A為MTT法檢測共孵育了D0X、DG/siRNA-3復(fù)合物和DG/siRNA-3復(fù)合物與D0X 混合物對MCF-7/ADR細(xì)胞的IC5Q值(n = 3);B為流式細(xì)胞術(shù)檢測共孵育了 D0X、DG/siRNA-3復(fù) 合物和DG/siRNA-3復(fù)合物與DOX混合物(上:DOX組；中：DG/siRNA-3復(fù)合物組;下:DG/siRNA- 3復(fù)合物與DOX混合物組;DG聚合物與siRNA的復(fù)合比為12);
[0058] 說明書中出現(xiàn)的縮略語含義如下表1所示：
[0059] 表 1
[0060]

【具體實施方式】
[0061 ] 本發(fā)明以N-3-氨丙基甲基丙烯酰胺和N_( 1，3-二羥基-2-丙基）甲基丙烯酰胺為單 體，采用可逆加成斷裂鏈轉(zhuǎn)移聚合法合成了嵌段聚合物N-3-氨丙基甲基丙烯酰胺-b-N-( 1， 3-二羥基-2-丙基）甲基丙烯酰胺聚合物，隨后在N-3-氨丙基甲基丙烯酰胺鏈段上偶聯(lián)胍基 基團(tuán)，得到N-3-胍丙基甲基丙烯酰胺-b-N-(l，3-二羥基-2-丙基）甲基丙烯酰胺聚合物聚合 物，得到了具有較高轉(zhuǎn)染效率的聚合物載體。隨后通過凝膠排阻色譜確定了聚合物的分子 量，下面通過具體的實施例詳細(xì)說明本發(fā)明。
[0062] 實施例1基因藥物的聚合物載體的制備方法。
[0063] (1)聚DHPMA聚合物的制備：
[0064] DHPMA(1.0430g，7.0mmol)溶于1.0ml蒸餾水中，后加入至Ij5ml聚合小瓶中，二硫代 苯甲酸（4-氰基戊酸）酯（0.03368,0.12111111〇1)，40^(0.01678,0.06臟〇1)溶于0.511^1，4-二 氧六環(huán)中，將其加入到聚合小瓶中。體系用干燥氮氣通氣lh，蠟封聚合小瓶。將聚合瓶放入 預(yù)熱至70°C油浴中反應(yīng)24h。將聚合管取出，置于0°C冷栗中冷卻，終止聚合反應(yīng)，得產(chǎn)物。將 產(chǎn)物加入到冰丙酮中沉淀，離心，反復(fù)溶解/沉淀三次，產(chǎn)物置于真空干燥箱50°C干燥得產(chǎn) 物聚 DHPMA 聚合物(PDHPMA)0.0362g(產(chǎn)率 72%)。
[0065] (2)聚DA聚合物的制備：
[0066]將 ΑΡΜΑ (0 · 2143g，1 · 2mmo 1)、PDHPMA (0.1812g，0.0 2mmo 1)溶于蒸餾水中，ACVA (0.0028g，0.01 mmol)溶于0.5mL 1，4-二氧六環(huán)中，將二者混合均勾后轉(zhuǎn)移至5mL聚合小瓶 中。體系用干燥氮氣通氣lh，錯封聚合小瓶。將聚合瓶放入預(yù)熱至70 °C油浴中反應(yīng)24h。反應(yīng) 結(jié)束后將聚合管取出，置于〇°C冷栗中冷卻，終止聚合反應(yīng)。產(chǎn)物加入到預(yù)冷的丙酮中沉淀， 離心，反復(fù)溶解/沉淀三次。產(chǎn)物置于真空干燥箱50°C干燥得產(chǎn)物聚DA聚合物0.149g(產(chǎn)率 64% )〇
[0067] (3)N-3-胍丙基甲基丙烯酰胺-b-N-(l，3-二羥基-2-丙基）甲基丙烯酰胺(DG)聚合 物的合成：
[0068]將DA聚合物溶于水中，使伯胺基濃度為12mM，加入過量胍基化試劑1-H-吡唑-1-甲 脒鹽酸鹽，使其濃度為65mM，飽和碳酸鈉溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)溶液pH至9.0，室溫下反應(yīng)24h。將產(chǎn) 物置于去離子水中透析24h(MW⑶8000，每2~4h換次水），冷凍干燥產(chǎn)物DG聚合物0.087g (產(chǎn)率83%)。
[0069] 表2為制備的不同鏈段比例的聚合物DA1、DA2、DA3的聚合物組成及平均分子量。在 全文中，DA1、DA2、DA3有相同的含義。
[0070] 表2三種聚合物組成及分子量
[0071]
[0072] 實施例2 DHPMA-b-GPMA/siRNA復(fù)合物的制備與表征。
[0073] (1 )DHPMA-b-GPMA/siRNA 復(fù)合物的制備：
[0074] 取定量siRNA儲備液溶于無酶水中，按DG聚合物中氨基氮的摩爾量與siRNA(siRNA l、siRNA 2、siRNA 3和siRNA-NC)中磷酸根的摩爾量比制備DHPMA-b-GPMA/siRNA復(fù)合物，即 取 DG1、DG2和DG3 聚合物按 N/P為l:l，l:4，l:8等比例加入siRNA(siRNA-l、siRNA-2、siRNA- 3、siRNA-NC中的任意一種)儲備液混合室溫孵育30min，制得系列DHPMA-b-GPM/siRNA復(fù)合 物（即DG1、DG2、DG3和8丨1?嫩-1、8丨1?嫩-2、8丨1?嫩-3、8丨1?嫩，(：任意兩者的復(fù)合物），隨后將復(fù) 合物溶液超聲并過〇. 22μπι濾膜存于4°C備用。
[0075] (2) DHPMA-b-GPMA/s iRNA復(fù)合物的瓊脂糖凝膠電泳
[0076] 按電荷比1:1、1: 4、1: 8、1:16和1:32混合DG聚合物和siRNA，室溫孵育30min得DG1/ siRNA-NC、DG2/siRNA-NC和DG3/siRNA-NC復(fù)合物。取luL上樣緩沖液(EDTA 30mM，甘油36%， 二甲苯藍(lán)0.035%，溴酚藍(lán)0.05%，了&1(&1^)與上述不同~/?的復(fù)合物混勻后加入1%瓊脂糖 凝膠中，以100V電壓，在TBE緩沖溶液中電泳15min。隨后在303nm的紫外光下觀察DNA電泳情 況并拍照。結(jié)果如圖3所示，在電荷比為8時DG3聚合物可將siRNA-NC包覆，同時DG1和DG2在 N/P為32和16時可將siRNA-NC包覆。結(jié)果表明，隨著DG聚合物中胍基化的ΑΡΜΑ鏈段所占摩爾 比例的增加，DG聚合物對siRNA的吸附能力逐漸增強(qiáng)。當(dāng)Ν/Ρ為8時DG3聚合物能完全阻滯 s iRNA向正極移動，表明本發(fā)明的DG3聚合物載體具有較高的基因攜帶能力。
[0077] (3)DHPMA-b-APMA/siRNA 和 DHPMA-b-GPMA/siRNA 復(fù)合物的粒徑、Zeta 電位和掃描 電鏡分析。
[0078] 將制備的 DA3/siRNA-NC 和三種 DG/siRNA-NC 復(fù)合物（DGl/siRNA-NC、DG2/siRNA-NC 和063/8丨1?祖-1^復(fù)合物）的在?133(口!17.2)溶液，置于]\^1￥61'1126七&8丨261'仙11〇23激光粒 度儀中，在室溫下檢測四種復(fù)合物的粒徑和Zeta電位，結(jié)果如表3和附圖4所示。
[0079] 表 3
[0080]
[0081] 比較不同GPMA鏈段比例的DG/siRNA復(fù)合物粒徑可知，在相同N/P下，隨著GPMA鏈段 在聚合物中的比例增高，DG/siRNA復(fù)合物的平均粒徑越低，siRNA在不同N/P下，經(jīng)胍基化后 的DG3/siRNA復(fù)合物的平均粒徑低于未胍基化的DA3/siRNA復(fù)合物，表明聚合物中GPMA鏈段 所占比例對負(fù)載和壓縮siRNA有決定性作用，而經(jīng)胍基化后的聚合物進(jìn)一步提高了對siRNA 的壓縮能力。文獻(xiàn)表明，粒徑小于300nm的粒子均可以跨膜進(jìn)入細(xì)胞，而制備的DG2、DG3聚合 物與s iRNA以電荷比為8時復(fù)合物的粒徑小于300nm(如附圖3)，隨著N/P增加，聚合物對 siRNA的壓縮更為充分，當(dāng)N/P為32時，所有GD/siRNA復(fù)合物的平均粒徑均下降至300nm以 下，DG2、DG3聚合物與siRNA復(fù)合物粒徑更進(jìn)一步降低至150nm左右。
[0082] 不同電荷比下DA3/siRNA與系列DG/siRNA復(fù)合物的表面zeta電位值如附圖4所示。 結(jié)果表明，不同GPMA鏈段的GD/siRNA復(fù)合物在N/P大于1時zeta電位都顯正值，表明帶負(fù)電 的siRNA分子在此電荷范圍下可被包裹在復(fù)合物中。隨著N/P增加，即聚合物的量增加，復(fù)合 物的正電荷密度逐漸增加，使得zeta電位逐漸升高。其中，胍基后的DG3/siRNA復(fù)合物比未 胍基化的復(fù)合物表現(xiàn)出強(qiáng)烈的正電性。
[0083] 取DA3/siRNA和DG3/siRNA復(fù)合物溶液各10yL滴加在干燥的硅片上，用濾紙吸去多 余液體并在室溫下自然晾干。然后在掃描電鏡(ZEISS Ultra plus)下觀察兩種復(fù)合物的形 貌及粒徑分布。結(jié)果表明，兩種復(fù)合物形態(tài)成近球型，粒徑分布比較規(guī)則，直徑在150~ 200nm之間。
[0084]實施例3體外轉(zhuǎn)染實驗。
[0085] 取實施例1制備的DA3和DG3與三種P-gp siRNA按N/P為16混合并孵育備用，在6孔 板中接種（1 X 1〇6個/孔)處于對數(shù)生長期的MCF-7/ADR細(xì)胞，待細(xì)胞融合率在60~70 %后更 換無血清無抗生素或有血清無抗生素的培養(yǎng)基。隨后將上述DA3/siRNA和DG3/siRNA復(fù)合物 分別加入不同孔中（n = 3)，共培養(yǎng)4h后更換新鮮的有血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)至48h后通過實 時定量PCR和Western blot檢測P-gp表達(dá)情況。如附圖5所示，實驗表明，DA3/siRNA-2、DG3/ siRNA-2和DA3/siRNA-3、DG3/siRNA-3復(fù)合物均能顯著沉默P-gp mRNA表達(dá)(p<0.05)，其中 DG3/siRNA-2和DG3/siRNA-3組對P-gp mRNA沉默率較高，高于相同情況下的PEI組。Western blot實驗結(jié)果表明DG3/siRNA-2和DG3/siRNA-3復(fù)合物能有效抑制P-gp蛋白的表達(dá)。
[0086] 實施例4 PECL3和B-PECL3/siRNA復(fù)合物的逆轉(zhuǎn)MCF-7/ADR耐藥性。
[0087] 取對數(shù)生長期的人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7/ADR)，以1 X 104個/孔加入96孔板中，每孔 加入150yL培養(yǎng)基，在37 °C、5 % C02下培養(yǎng)至細(xì)胞融合率70~80 %后更換新鮮培養(yǎng)基，每孔 按比例分別加入D0X(0.001yM~lmM)、DG3/siRNA-3復(fù)合物（lOOnM siRNA-3)和DG3/siRNA-3 復(fù)合物與D0X的混合溶液(含Ο.ΟΟΙμΜ~ImM D0X，100nM siRNA-3)繼續(xù)培養(yǎng)72h。隨后每孔加 入20yL(5mg/mL)的MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4h，小心倒去所有培養(yǎng)基并加入150yL二甲亞砜(DMS0) 后置振蕩儀上振蕩l〇min使藍(lán)色甲瓚充分溶解，在酶標(biāo)儀上檢測每孔在490nm波長處的吸光 度。另取對數(shù)生長期的人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7/ADR)，以1 X 106個/孔加入6孔板中，每孔加入 2mL培養(yǎng)基，在37 °C、5 % C02下培養(yǎng)至細(xì)胞融合率70~80 %后更換新鮮培養(yǎng)基，每孔加入D0X (Ο.ΟΟΙμΜ~ImM)、DG3/siRNA-3復(fù)合物（100nM siRNA-3)和DG3/siRNA-3復(fù)合物與D0X的混合 溶液(含〇 . 〇〇 ΙμΜ~ImM D0X，100nM s iRNA-3)繼續(xù)培養(yǎng)48h。隨后，胰酶消化收集細(xì)胞并用 7AAD/APC凋亡試劑染色后上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。結(jié)果如圖6所示，DG3/siRNA-3復(fù) 合物沒有影響P-gp siRNA逆轉(zhuǎn)MCF-7/ADR細(xì)胞的耐藥性，其中D0X組MCF-7/ADR細(xì)胞的耐藥 性為32.58μΜ而DG3/siRNA-3與D0X混合溶液組MCF-7/ADR細(xì)胞的耐藥性顯著降低至4.43μΜ， 表明DG3聚合物能夠攜帶siRNA至腫瘤細(xì)胞并發(fā)揮協(xié)同作用。
[0088]綜上所述，本發(fā)明提出了一種新型腫瘤靶向的基因藥物載體N-(l，3-二羥基-2-丙 基）甲基丙烯酰胺-b-N-3-胍丙基甲基丙烯酰胺聚合物，其在極性溶劑中可通過靜電引力負(fù) 載基因藥物。這種載體的表面為N-(l，3-二羥基-2-丙基）甲基丙烯酰胺親水性層，內(nèi)部是含 有正電的N-3-胍丙基甲基丙烯酰胺結(jié)構(gòu)。這種基因藥物載體可增加治療基因長循環(huán)時間、 保護(hù)治療基因不被體內(nèi)酶降解、及靶向腫瘤組織。本發(fā)明提供的生物相容性好的聚合物，可 在水溶液中可與基因藥物自組裝形成納米顆粒，具有良好的穩(wěn)定性，且制備方法簡單，可重 復(fù)性高。聚合物反應(yīng)條件較為溫和，單體材料廉價易得，合成及后處理方法簡單產(chǎn)率較高， 其與基因藥物形成的復(fù)合物制備方法簡單，可大量負(fù)載基因藥物，接枝的胍基基團(tuán)可高效 攜帶基因藥物且轉(zhuǎn)染率高，并具有良好的生物相容性，同時具有很好的穩(wěn)定性等特點。這類 可攜帶基因藥物且具有良好生物相容性的基因載體在疾病治療中具有良好的應(yīng)用前景。 [0089] 通過N-3-氨丙基甲基丙烯酰胺來結(jié)合基因藥物，N-(l，3-二羥基-2-丙基）甲基丙 烯酰胺鏈段形成親水層。實驗發(fā)現(xiàn)N-(l，3-二羥基-2-丙基）甲基丙烯酰胺鏈段具有最好的 親水性，N-3-氨丙基甲基丙烯酰胺鏈段具有較好的基因藥物負(fù)載能力，其原因是鏈段上具 有較多的伯氨基，提高了其結(jié)合基因藥物的能力，但是N-3-氨丙基甲基丙烯酰胺鏈段上伯 氨基越高其毒性就越大，而N-(l，3-二羥基-2-丙基）甲基丙烯酰胺鏈段形成的外層可以減 少內(nèi)部伯氨基帶來的細(xì)胞毒性。
[0090] 本發(fā)明制備的三種聚合物(DG1、DG2和DG3)與siRNA形成的復(fù)合物的粒徑及形態(tài)結(jié) 果表明，三種復(fù)合物粒徑大小均能滿足被細(xì)胞吞噬的要求。
[0091] 本發(fā)明制備的DG3/siRNA復(fù)合物體外轉(zhuǎn)染實驗通過轉(zhuǎn)染P糖蛋白（P-gp)siRNA驗證 載體轉(zhuǎn)染效率。通過與"金標(biāo)準(zhǔn)" PEI相比，說明了DG3/siRNA具有較高的轉(zhuǎn)染效率。
[0092]本發(fā)明制備的DG3/siRNA-3復(fù)合物體外逆轉(zhuǎn)乳腺癌(MCF-7/ADR)耐藥性通過細(xì)胞 毒性實驗表明，通過與D0X相比，DG3/siRNA-3與D0X共孵育組顯著的（p<0.05)逆轉(zhuǎn)了MCF- 7/ADR細(xì)胞的耐藥性。
【主權(quán)項】
1. 一種陽離子聚合物基因載體，其特征在于，該基因載體以N-3-氨丙基甲基丙烯酰胺 和N-(1，3-二羥基-2-丙基）甲基丙烯酰胺為單體，采用可逆加成斷裂鏈轉(zhuǎn)移聚合法合成了 嵌段聚合物N-(l，3-二羥基-2-丙基）甲基丙烯酰胺-b-N-3-氨丙基甲基丙烯酰胺聚合物，隨 后在N-3-氨丙基甲基丙烯酰胺鏈段上偶聯(lián)胍基基團(tuán)，得到N-(l，3-二羥基-2-丙基）甲基丙 烯酰胺-b-N-3-胍丙基甲基丙烯酰胺聚合物聚合物，其中，胍基化的Ν-3-氨丙基甲基丙烯酰 胺鏈段占聚合物的比例為8.3%~57%。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的陽離子聚合物基因載體，其特征在于，所述的陽離子聚合物基 因載體的數(shù)均分子量為23700~45700g/mol。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的陽離子聚合物基因載體，其特征在于，所述的陽離子聚合物基 因載體的主鏈中聚N-3-氨丙基甲基丙烯酰胺的聚合度為10-90，N-(1，3-二羥基-2-丙基）甲 基丙烯酰胺聚合度為10-90。4. 權(quán)利要求1所述的陽離子聚合物基因載體的制備方法，其特征在于，包括如下步驟： (1) DHPMA聚合物的制備： 取二硫代苯甲酸(4-氰基戊酸)酯和ACVA溶于1，4_二氧六環(huán)中，得到溶液A，然后將溶液 A和DHPMA的水溶液加入到聚合瓶中，通氮氣1~2h，蠟封聚合瓶，然后將聚合瓶放入預(yù)熱至 70~80 °C的油浴中反應(yīng)12~24h，將聚合瓶取出，冷卻，終止聚合反應(yīng)，將得到的產(chǎn)物加入到 冰丙酮中沉淀，離心，反復(fù)溶解、沉淀若干次，最后將產(chǎn)物置于真空干燥箱50~60°C干燥得 產(chǎn)物DHPMA聚合物，記為TOHPMA; (2) DHPMA-b-APMA聚合物的制備： 將PDHPMA和ΑΡΜΑ單體溶于蒸餾水中，得到溶液B，將溶液B和ACVA的二氧六環(huán)溶液混合 均勻后轉(zhuǎn)移至聚合瓶中，體系用干燥氮氣通氣1~2h，蠟封聚合瓶，將聚合瓶放入預(yù)熱至70 °C~80°C油浴中反應(yīng)12~24h，反應(yīng)結(jié)束后將聚合瓶取出，冷卻，終止聚合反應(yīng)，產(chǎn)物加入到 預(yù)冷的丙酮中沉淀，離心，反復(fù)溶解、沉淀若干次，然后將得到的產(chǎn)物置于真空干燥箱50~ 60 °C干燥得到DHPMA-b-APMA聚合物，記為DA聚合物； (3) 胍基化DHPMA-b-APMA聚合物的合成： 將DA聚合物溶于水中，隨后加入胍基化試劑，調(diào)節(jié)反應(yīng)溶液pH至8~10,室溫下反應(yīng)12 ~24h，將產(chǎn)物置于去離子水中透析，冷凍干燥得到產(chǎn)物N-3-胍丙基甲基丙烯酰胺-b-N-(l， 3-二羥基-2-丙基）甲基丙烯酰胺聚合物，記為DHPMA-b-GPMA或DG。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，步驟（1)中，二硫代苯甲酸(4-氰基戊 酸)酯與DHPMA的摩爾比為1:10~90,二硫代苯甲酸(4-氰基戊酸)酯與ACVA的摩爾比為1:1 ~4，DHPMA的水溶液中的水的質(zhì)量為DHPMA質(zhì)量的1~5倍。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，TOHPMA聚合物與ΑΡΜΑ單體 的摩爾用量比為1:10~90，？0即麻與4〇^的摩爾用量比為1:1~4。7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，步驟(3)中，所述的胍基化試劑為1-Η-吡唑-1 -甲脒鹽酸鹽，DA聚合物中ΑΡΜΑ鏈段與1-Η-吡唑-1 -甲脒鹽酸鹽的摩爾比為1:1~10。8. 權(quán)利要求1所述的陽離子聚合物基因載體作為生物載體材料在藥物輸送中的應(yīng)用。9. 一種負(fù)載基因藥物的陽離子聚合物載體，其特征在于，通過將基因藥物通過靜電引 力負(fù)載在權(quán)利要求1所述的陽離子聚合物基因載體上得到，其中，所述的基因藥物為siRNA、 shRNA、質(zhì)粒DNA 等。10.權(quán)利要求9所述的負(fù)載基因藥物的陽離子聚合物載體在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61K47/32GK105837767SQ201610188666
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年3月29日
【發(fā)明人】吳旸, 唐金海, 吳建中, 馬蓉, 張薇, 孫春龍
【申請人】江蘇省腫瘤醫(yī)院