從漆樹木粉中提取具有抑制酪氨酸酶活性的硫磺菊素和紫鉚花素的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及從漆樹木粉中提取具有抑制酪氨酸酶活性的硫磺菊素和紫鉚花素的方法，屬于天然藥物化學與化妝品的開發(fā)和應用領域。以漆樹木粉為原料、經(jīng)過提取、萃取、硅膠柱層析及中低壓色譜可以快速有效地制備高含量的硫磺菊素和紫鉚花素化合物。本發(fā)明制備的硫磺菊素和紫鉚花素單體具有低濃度抑制酷氨酸酶的活性，對人體無毒害作用，在50μg/mL的濃度時，對酪氨酸酶的抑制率>95%，該制備過程快速簡單，是開發(fā)潛在的天然酪氨酸酶抑制劑的良好來源，用于美白化妝品、預防和治療由于人體黑色素過多導致的沉著性疾病，具有很好的商業(yè)前景。
【專利說明】
從漆樹木粉中提取具有抑制酪氨酸酶活性的硫磺菊素和紫鉚 花素的方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及從漆樹木粉中提取具有抑制酪氨酸酶活性的硫磺菊素和紫鉚花素的 方法，屬于天然藥物、化妝品技術領域。
【背景技術】
[0002] 漆樹（Rhus verni c i f 1 ua stoke s )，為漆樹科（Anacardiaceae )漆樹屬 ((Toxicodendron)的一種落葉喬木。漆樹是我國重要的特用經(jīng)濟林，生漆是天然樹脂涂 料，素有"涂料之王"的美譽。它還是一種優(yōu)良的藥用木材，漆樹的葉、花、根、皮、果實、干漆 和木心都可入藥，有止咳、消癖、通經(jīng)、殺蟲、消腫等功效。漆樹木質部位的多酚化合物是繼 生漆漆酚、漆多糖后的主要活性物，大量的研究表明其具有優(yōu)良的抗氧化性、抗腫瘤、抑菌 和免疫調(diào)節(jié)等作用。研究表明，硫磺菊素(3'，4'，7-trihydroxyaurone)具有抗氧化、降低氧 化應激、抗炎、抗血小板聚集、抗突變作用及預防帕金森。紫鉚花素（7,3'，4'_ trihydroxydihydrof lavone)存在于幾種中草藥植物中，如零陵香豆、黃檀木、海紅豆、斑鳩 菊及漆樹中，具有美白、抗著床活性、抑制DNA氧化損傷及抗腫瘤和抗突變作用。
[0003] 據(jù)調(diào)研了解，我國化妝品市場以每年15%左右的速度增長，2011年已突破2000億大 關，我國目前是全球第三大化妝品市場。根據(jù)市場研究公司Euromonitor的數(shù)據(jù)顯示，在我 國的皮膚護理品市場中，美白產(chǎn)品占據(jù)了71%的份額。目前市場上銷售的許多美白、祛斑產(chǎn) 品都是以抑制酪氨酸酶達到美白作用，從而促使了與酪氨酸酶抑制劑相關研究的蓬勃發(fā) 展。由于酪氨酸酶抑制劑在化妝品中的廣泛使用，研究可以長期使用、安全、有效的藥物將 成為人們要考慮的主要問題。世界各國植物資源豐富，天然資源因其藥效溫和、不良反應小 而被廣泛認同，天然酪氨酸酶抑制劑的開發(fā)將成為化妝品領域一個備受矚目的課題。
[0004] 我國是漆樹的原產(chǎn)地，主要集中在陜西、四川、重慶、湖北、貴州、甘肅和云南七個 省，在鎮(zhèn)雄、大方、畢節(jié)、赫章、北川、恩施等60多個縣建立了漆樹產(chǎn)業(yè)化種植基地，種植面 積達100萬hm2,栽種漆樹達150,000萬株。但是目前漆樹的產(chǎn)業(yè)主要集中在天然生漆涂料 的生產(chǎn)及開發(fā)，在漆籽的利用方面也比較薄弱，另外在漆樹生長、利用過程中，大量的枝椏 莖材未得到利用，為了擴大漆樹產(chǎn)業(yè)的規(guī)模化，延伸漆樹資源的產(chǎn)業(yè)鏈，因此開展漆樹多酚 具有抑制酪氨酸酶活性的化合物的提取制備研究，對于漆樹資源的開發(fā)利用具有指導意 義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為實現(xiàn)上述目的，發(fā)明了從漆樹木粉中提取具有抑制酪氨酸酶活性的硫磺菊素和 紫鉚花素的方法，其特征在于由以下步驟組成： 第一步 將漆樹木粉，干燥去渣，按質量體積比為1:10~1:30(g:mL)，加入質量分數(shù)為50~95%的 乙醇水溶液或乙酸乙酯水溶液，減壓回流提取2~3次，每次卜3h，過濾，濾液合并，于40~60°C 下減壓蒸發(fā)除去溶劑，得到含水粗提液； 第二步 粗提液按質量比1:3~1:10 (g: mL)加入蒸餾水，攪拌溶解，加入石油醚萃取1~5次，分離， 在40~60°C下減壓蒸發(fā)除去溶劑，得到石油醚萃取物；水層繼續(xù)用乙酸乙酯萃取1~5次，分 離，在40~60°C下減壓蒸發(fā)除去溶劑，干燥得到乙酸乙酯萃取物； 第三步 將乙酸乙酯萃取物與硅膠填料按質量比1:15-50吸附，柱長50-150 cm，柱直徑4-20 cm，采用不同比例石油醚與乙酸乙酯進行洗脫，收集抑制酪氨酸酶活性較高的石油醚：乙酸 乙酯體積比為6:4-5:5(V:V)的部位，真空濃縮，回收溶劑，得到富含硫磺菊素和紫鉚花素的 提取物； 第四步 將富含硫磺菊素和紫鉚花素的提取物與中低壓色譜填料按質量比1:15-50吸附，中壓 柱柱長20-80 cm，柱直徑2-8 cm，采用不同比例的洗脫劑進行洗脫，柱壓為0.5-10 MPa,檢 測波長220-360 nm，流速3-50 mL/min，分別收集硫磺菊素和紫鉚花素部位，真空濃縮，回收 溶劑，得到硫磺菊素和紫鉚花素樣品，將硫磺菊素和紫鉚花素進行HPLC分析，含量為95%以 上； 第五步 硫磺菊素和紫鉚花素進行抑制酪氨酸酶活性評價，通過紫外色譜檢測多巴色素的生成 量，確定當硫磺菊素甲醇溶液濃度范圍在1~50yg/mL，抑制率為31.5~100%，其IC50值為3.74 yg/mL;當紫鉚花素甲醇溶液濃度范圍在1~50yg/mL，抑制率為25~98.6%，其IC50值為4.32μ g/mL;通過對抑制酪氨酸酶活性的機理研究，硫磺菊素的抑制類型為競爭型，紫鉚花素的抑 制類型為非克爭型。
[0006] 中低壓色譜填料為孔徑為60 A，20-60 pm的ODS C18和C8材料中的一種，洗脫劑為 甲醇、乙醇和體積比0.5%-2%( ν: ν)的醋酸水中的一種或幾種的混合溶液。
[0007] 冊^：分析條件為:4.6\250111111，5以111的(：18 6〇1(1八0反相柱，流動相為體積比為 50:50( ν: ν)的甲醇:體積比0.5-1%( v/v)醋酸水溶液，紫外檢測器，檢測波長為280和360nm， 流速為lmL/min〇
[0008] 本方法中采用醇溶液或乙酸乙酯溶液進行提取，經(jīng)過萃取，硅膠柱層析與中低壓 柱色譜分離得到硫磺菊素和紫鉚花素，并經(jīng)過MS、IR、1H-NMR和13C-NMR進行證實，兩者的 結構為。
[0009]
本發(fā)明的有益效果： 本發(fā)明所提供的從漆樹木粉中提取具有抑制酪氨酸酶活性的硫磺菊素和紫鉚花素的 方法，還具有以下特點： (1) 本發(fā)明通過提取、萃取、硅膠柱層析及中低壓色譜可以快速有效地制備高含量的硫 磺菊素和紫鉚花素化合物； (2) 硫磺菊素和紫鉚花素單體具有低濃度抑制酷氨酸酶的活性，對人體無毒害作用； (3) 本發(fā)明工藝操作簡單，易實施，純度高，活性高； (4) 漆樹中的硫磺菊素和紫鉚花素對酪氨酸酶具有顯著的抑制作用，能夠用于美白化 妝品、預防和治療由于人體黑色素過多導致的沉著性疾病。
【附圖說明】
[0010] 圖1硫磺菊素的HPLC色譜圖； 圖2紫鉚花素的HPLC色譜圖； 圖3硫磺菊素對酪氨酸酶的抑制作用； 圖4紫鉚花素對酪氨酸酶的抑制作用； 圖5硫磺菊素對酪氨酸酶催化單酚底物的抑制作用； 圖6紫鉚花素對酪氨酸酶催化單酚底物的抑制作用； 圖7硫磺菊素對酪氨酸酶催化二酸底物抑制作用的Lineweaver-Burk曲線； 圖8紫鉚花素對酪氨酸酶催化二酸底物抑制作用的Lineweaver-Burk曲線。
【具體實施方式】
[0011]以下實施例為本發(fā)明的一些舉例，不應被看做是對本發(fā)明的限定。
[0012] 實施例1 第一步 將漆樹木粉，干燥去渣，按質量體積比為1:10~1:30(g:mL)，加入質量分數(shù)為50~95%的 乙醇水溶液，減壓回流提取2~3次，每次1~3h，過濾，濾液合并，于40~60°C下減壓蒸發(fā)除去溶 劑，得到含水粗提液； 第二步 粗提液按質量比1:3~1:10 (g: mL)加入蒸餾水，攪拌溶解，加入石油醚萃取1~5次，分離， 在40~60°C下減壓蒸發(fā)除去溶劑，得到石油醚萃取物；水層繼續(xù)用乙酸乙酯萃取1~5次，分 離，在40~60°C下減壓蒸發(fā)除去溶劑，干燥得到乙酸乙酯萃取物； 第三步 將乙酸乙酯萃取物與硅膠填料按質量比1:15-50吸附，柱長50-150 cm，柱直徑4-20 cm，采用不同比例石油醚與乙酸乙酯進行洗脫，收集抑制酪氨酸酶活性較高的石油醚：乙酸 乙酯體積比為6:4 (v:v)的部位，真空濃縮，回收溶劑，得到富含硫磺菊素的提取物； 第四步 將富含硫磺菊素的提取物與中低壓色譜填料(孔徑為60 Α，20-60 μπι的ODS C18)按質 量比1:15-50吸附，中壓柱柱長20-80 cm，柱直徑2-8 cm，采用不同比例的甲醇-0.5%的醋 酸水溶液進行洗脫，柱壓為0.5-10 MPa，檢測波長220-360 nm，流速3-50 mL/min，分別收 集硫磺菊素部位，真空濃縮，回收溶劑，得到硫磺菊素樣品，將硫磺菊素進行HPLC分析，含量 為95%以上。
[0013] 冊^：分析條件為:4.6\250111111，5以111的(：18 6〇1(1八0反相柱，流動相為體積比為 50:50( v: v)的甲醇:體積比0.5-1%( v/v)醋酸水溶液，紫外檢測器，檢測波長為280和360nm， 流速為lmL/min〇
[0014] 經(jīng)過MS、IR、1H-NMR和 13C-NMR鑒定為硫磺菊素。橙色粉末，ESI-MS (m/z):269[M- ΗΓ，C15H1Q05。鹽酸-鎂粉反應顏色無變化，三氯化鋁反應顏色由橙色變成淡黃色，說明該化 合物為橙酮。IR:3321，1597，1516，1456，1370，1287，1134cm-1，UV/VisXmax(Me0H) :206， 257,387^1,11 NMR(300MHz，DMS0-d6)jll.l(lH，s，7-OH)，9.63(lH，s，4'-OH)，9.23(lH，s， 3'-OH)，7.68(lH，d，J=8.2Hz，H-5)，7.44(lH，d，J=1.9Hz，H-5'），7.26(lH，dd，J=8.4 and 2.0 Hz，H-6'），6.88(lH，d，J=8.2Hz，H-2'），6.74(lH，d，J=1.8Hz，H-8)，6.69(lH，dd，J=8.5 and 1.7抱，!1-6)，6.63(1!1，8，!1-2)。13(： MMR(300MHz，DMS0-d6)Jl81.1 (C-4)，167.3(C- 9)，166·0(C-7)，148·0(C-4'），145·6(C-3)，145·5(C-3'），125.7(C-6'），124.5(05)，123.3 (C-l'），117.9(C-5'），116.0(C-2'），113.2(C-10)，112.8(C-6)，111.9(C-2)，98.3(C-8)。
[0015] 實施例2 第一步 將漆樹木粉，干燥去渣，按質量體積比為1:10~1:30(g:mL)，加入質量分數(shù)為50~95%的 乙酸乙酯水溶液，減壓回流提取2~3次，每次1~3h，過濾，濾液合并，于40~60°C下減壓蒸發(fā)除 去溶劑，得到含水粗提液； 第二步 粗提液按質量比1:3~1:10 (g: mL)加入蒸餾水，攪拌溶解，加入石油醚萃取1~5次，分離， 在40~60°C下減壓蒸發(fā)除去溶劑，得到石油醚萃取物；水層繼續(xù)用乙酸乙酯萃取1~5次，分 離，在40~60°C下減壓蒸發(fā)除去溶劑，干燥得到乙酸乙酯萃取物； 第三步 將乙酸乙酯萃取物與硅膠填料按質量比1:15-50吸附，柱長50-150 cm，柱直徑4-20 cm，采用不同比例石油醚與乙酸乙酯進行洗脫，收集抑制酪氨酸酶活性較高的石油醚：乙酸 乙酯體積比為5:5(V:V)的部位，真空濃縮，回收溶劑，得到富含紫鉚花素的提取物； 第四步 將富含紫鉚花素的提取物與中低壓色譜填料(孔徑為60 Α，20-60 μπι的ODS C8)按質量 比1:15-50吸附，中壓柱柱長20-80 cm，柱直徑2-8 cm，采用不同比例的甲醇-2%的醋酸水溶 液進行洗脫，柱壓為0.5-10 MPa,檢測波長220-360 nm，流速3-50 mL/min，分別收集紫鉚 花素部位，真空濃縮，回收溶劑，得到紫鉚花素樣品，將紫鉚花素進行HPLC分析，含量為95% 以上。
[0016] 冊^：分析條件為:4.6\25〇111111，5以111的(：18 6〇1(1八〇反相柱，流動相為體積比為 50:50( v: v)的甲醇:體積比0.5-1%( v/v)醋酸水溶液，紫外檢測器，檢測波長為280和360nm， 流速為lmL/min〇
[0017] 經(jīng)過MS、IR、1H-NMR和13C-NMR鑒定為紫鉚花素。淡黃色粉末，ESI-MS (m/z): 271 [Μ-ΗΓ，&5Η1205。鹽酸-鎂粉反應呈紫紅色，硼氫化鈉反應由藍變成紫紅，說明該化合物為二 氫黃酮。IR:3300,2966,1638,1594,1557,1514,1444,1354,1235,1315,1148 cm-Suv/Vis λ max (Me0H):221，261，371nm。咕 NMR(300MHz，Me0H-d4)J7.95(lH，d，J=8.7Hz，H-5)，7.75 (lH，d，J=1.7Hz，H-2'），7.56(lH，d，J=8.2Hz，H-5'），7.12(lH，dd，J=8.2 and 1·8Ηζ，Η-6'）， 6.80(lH,ddJ=8.7 and 2.2 Hz ,H-6) ,6.43( lH,dJ=2.1Hz ,H-8) 013C NMR(300MHz,Me0H- d4):Sl94.0(C-4)，168.0(07)，166.8(C-9)，147.3(C-3'），146.6(C-4'），133.8(C-1'）， 129.0(C-5)，124.1(C-6，），118.8(05,），116.3C-10)，113.2(02,），109.6(06)，104.3 (C-8)0
[0018] 實施例3 第一步 將漆樹木粉，干燥去渣，按質量體積比為1:10~1:30(g:mL)，加入質量分數(shù)為50~95%的 乙酸乙酯水溶液，減壓回流提取2~3次，每次1~3h，過濾，濾液合并，于40~60°C下減壓蒸發(fā)除 去溶劑，得到含水粗提液； 第二步 粗提液按質量比1:3~1:10 (g: mL)加入蒸餾水，攪拌溶解，加入石油醚萃取1~5次，分離， 在40~60°C下減壓蒸發(fā)除去溶劑，得到石油醚萃取物；水層繼續(xù)用乙酸乙酯萃取1~5次，分 離，在40~60°C下減壓蒸發(fā)除去溶劑，干燥得到乙酸乙酯萃取物； 第三步 將乙酸乙酯萃取物與硅膠填料按質量比1:15-50吸附，柱長50-150 cm，柱直徑4-20 cm，采用不同比例石油醚與乙酸乙酯進行洗脫，收集抑制酪氨酸酶活性較高的石油醚：乙酸 乙酯體積比為6:4 (v:v)的部位，真空濃縮，回收溶劑，得到富含硫磺菊素的提取物； 第四步 將富含硫磺菊素的提取物與中低壓色譜填料(孔徑為60 Α，20-60 μπι的ODS C8)按質量 比1:15-50吸附，中壓柱柱長20-80 cm，柱直徑2-8 cm，采用不同比例的乙醇-2%的醋酸水溶 液進行洗脫，柱壓為0.5-10 MPa,檢測波長220-360 nm，流速3-50 mL/min，分別收集硫磺 菊素部位，真空濃縮，回收溶劑，得到硫磺菊素樣品，將硫磺菊素進行HPLC分析，含量為95% 以上。
[0019] 實施例4 第一步 將漆樹木粉，干燥去渣，按質量體積比為1:10~1:30(g:mL)，加入質量分數(shù)為50~95%的 乙醇水溶液，減壓回流提取2~3次，每次1~3h，過濾，濾液合并，于40~60°C下減壓蒸發(fā)除去溶 劑，得到含水粗提液； 第二步 粗提液按質量比1:3~1:10 (g: mL)加入蒸餾水，攪拌溶解，加入石油醚萃取1~5次，分離， 在40~60°C下減壓蒸發(fā)除去溶劑，得到石油醚萃取物；水層繼續(xù)用乙酸乙酯萃取1~5次，分 離，在40~60°C下減壓蒸發(fā)除去溶劑，干燥得到乙酸乙酯萃取物； 第三步 將乙酸乙酯萃取物與硅膠填料按質量比1:15-50吸附，柱長50-150 cm，柱直徑4-20 cm，采用不同比例石油醚與乙酸乙酯進行洗脫，收集抑制酪氨酸酶活性較高的石油醚：乙酸 乙酯體積比為5:5(V:V)的部位，真空濃縮，回收溶劑，得到富含紫鉚花素的提取物； 第四步 將富含紫鉚花素的提取物與中低壓色譜填料(孔徑為60 Α，20-60 μπι的ODS C18)按質 量比1:15-50吸附，中壓柱柱長20-80 cm，柱直徑2-8 cm，采用不同比例的乙醇-1%的醋酸水 溶液進行洗脫，柱壓為0.5-10 MPa，檢測波長220-360 nm，流速3-50 mL/min，分別收集紫 鉚花素部位，真空濃縮，回收溶劑，得到紫鉚花素樣品，將紫鉚花素進行HPLC分析，含量為 95%以上。
[0020] 實施例5 將不同濃度硫磺菊素和紫鉚花素對酪氨酸酶活性的抑制作用如圖3和圖4所示。硫磺菊 素和紫鉚花素對酪氨酸酶活性的抑制作用對濃度呈現(xiàn)依賴性，隨著濃度的增大，其抑制率 增加，對不同濃度的硫磺菊素與酪氨酸酶抑制率的變化規(guī)律進行線性擬合，可以得到擬合 方程為： y = 6.506x + 25.65 (1) 式中：y=硫磺菊素對酪氨酸酶活性的抑制率，％; χ=硫磺菊素的質量濃度，yg/mL。
[0021] 該擬合方程（1)的相關系數(shù)R為0.993，說明，這組數(shù)據(jù)的線性擬合是有效的。根 據(jù)方程可以計算硫磺菊素的IC50為3.74yg/mL。
[0022] 對不同濃度的紫鉚花素與酪氨酸酶抑制率的變化規(guī)律進行線性擬合，可以得到擬 合方程為： y = 6.436x + 22.18 (2) 式中：y=紫鉚花素對酪氨酸酶活性的抑制率，％; x=紫鉚花素的質量濃度，yg/mL。
[0023] 該擬合方程（1)的相關系數(shù)R為0.984,說明，這組數(shù)據(jù)的線性擬合是有效的。根據(jù) 方程可以計算硫磺菊素的IC50為4.32yg/mL。
[0024] 實施例6 以L-酪氨酸的濃度為lmmol/L，測定不同濃度的硫磺菊素和紫鉚花素對酪氨酸酶單酚 酶抑制作用的變化曲線，如圖5和6所示。當紫鉚花素和硫磺菊素的濃度為0.185 mmol/L和 O.lllmmol/L時，在30min內(nèi)，多巴色素幾乎沒有明顯增加，表明，酪氨酸酶的活性幾乎被紫 鉚花素和硫磺菊素完全抑制。
[0025]酪氨酸酶催化L-酪氨酸具有遲滯效應，主要是酪氨酸酶對L-酪氨酸進行羥基化 時，由于酪氨酸酶的自身結構特點使該反應過程受到較大的空間位阻，這個是酪氨酸酶的 單酚酶的特點。因此對不同濃度化合物存在下的酪氨酸酶反應動力學曲線的反應初始階段 做切線，切線與X軸的截距為遲滯時間。從表1可以看出隨著漆黃素、紫鉚花素和硫磺菊素濃 度的增大，酶催化反應的遲滯時間延長;沒有化合物存在下遲滯時間為lmin，當漆黃素濃度 為0 · 524 mmol/L時，遲滯時間延長至11 · 2min;當紫鉚花素的濃度為0 · 185 mmol/L時，遲滯 時間延長至26min;當硫磺菊素的濃度為0.1 ll mmol/L時，遲滯時間延長至6min。在催化反 應過程中，酪氨酸酶以還原型、氧化型和脫氧型3種形式存在。在單酚活性催化反應過程中， 還原型與氧化型的酪氨酸酶即可以與二酚底物結合，也可以與單酚底物結合，進入正常的 催化循環(huán)反應，而還原型的酪氨酸酶與單酚底物結合后，不能正常進入催化循環(huán)反應，從而 導致了催化反應進入穩(wěn)態(tài)所需時間的延長。而高濃度的漆黃素、紫鉚花素和硫磺菊素存在 時，因其化學結構中含鄰苯二酚結構，與二酚底物相近，可以競爭性地與酪氨酸酶結合。因 此，遲滯時間的延長表明高濃度化合物的存在使L-酪氨酸更難與酪氨酸酶活性位點結合。
[0026]表1化合物濃度對酪氨酸酶遲滯時間的影響
實施例7 在測定體系中，酪氨酸酶的濃度和用量固定，通過改變底物L-多巴的濃度，測定不同濃 度化合物對酪氨酸酶活力的影響。采用Lineweaver-Burk即雙倒數(shù)作圖法，以L-多巴濃度的 倒數(shù)1/[S]為X軸，反應速度的倒數(shù)1/V為y軸作圖，KjPVm可以從曲線的斜率和截距獲得[25]。 紫鉚花素的濃度為7.4、18.5、185以111111〇1/1，硫磺菊素的濃度為1.85、14.8、111.1以臟〇1/1， 雙倒數(shù)曲線如圖7和圖8所示。隨著紫鉚花素濃度的增大，直接橫軸截距基本不變，即Km不隨 著濃度發(fā)生變化，V?值變小，符合非競爭性抑制的特征。隨著硫磺菊素(c)濃度增大，直線 縱軸截距基本不變，即Vm不隨著濃度發(fā)生變化，而Km值增大，符合競爭性可逆抑制類型的特 征。前期研究發(fā)現(xiàn)漆樹乙酸乙酯部位具有一定的抑制酪氨酸酶活性，其抑制類型為混合型。 漆黃素、紫鉚花素和硫磺菊素為漆樹乙酸酯部位中的主要黃酮類化合物，大量的研究表明 黃酮類化合物具有優(yōu)良的抑制酪氨酸酶的作用[23,26]，其抑制類型主要為競爭型和非競爭 型。硫磺菊素對酪氨酸酶二酚催化活性顯示為競爭型，表明其能夠競爭性地與酪氨酸酶結 合，從而消弱L-多巴的催化氧化反應。而紫鉚花素對酪氨酸酶二酚催化活性顯示為非競爭 型，說明紫鉚花素即可與酪氨酸酶結合，也可以與底物進行結合，兩者的解離常數(shù)相等。
【主權項】
1. 從漆樹木粉中提取具有抑制酪氨酸酶活性的硫磺菊素和紫鉚花素的方法，其特征在 于由以下步驟組成： 第一步 將漆樹木粉，干燥去渣，按質量體積比為1:10~1:30(g:mL)，加入質量分數(shù)為50~95%的 乙醇水溶液或乙酸乙酯水溶液，減壓回流提取2~3次，每次1~3h，過濾，濾液合并，于40~60 °C 下減壓蒸發(fā)除去溶劑，得到含水粗提液； 第二步 粗提液按質量比1:3~1:10 (g: mL)加入蒸餾水，攪拌溶解，加入石油醚萃取1~5次，分離， 在40~60°C下減壓蒸發(fā)除去溶劑，得到石油醚萃取物；水層繼續(xù)用乙酸乙酯萃取1~5次，分 離，在40~60°C下減壓蒸發(fā)除去溶劑，干燥得到乙酸乙酯萃取物； 第三步 將乙酸乙酯萃取物與硅膠填料按質量比1:15-50吸附，柱長50-150 cm，柱直徑4-20 cm，采用不同比例石油醚與乙酸乙酯進行洗脫，收集抑制酪氨酸酶活性較高的石油醚：乙酸 乙酯體積比為6:4-5:5(V:V)的部位，真空濃縮，回收溶劑，得到富含硫磺菊素和紫鉚花素的 提取物； 第四步 將富含硫磺菊素和紫鉚花素的提取物與中低壓色譜填料按質量比1:15-50吸附，中壓 柱柱長20-80 cm，柱直徑2-8 cm，采用不同比例的洗脫劑進行洗脫，柱壓為0.5-10 MPa,檢 測波長220-360 nm，流速3-50 mL/min，分別收集硫磺菊素和紫鉚花素部位，真空濃縮，回收 溶劑，得到硫磺菊素和紫鉚花素樣品，將硫磺菊素和紫鉚花素進行HPLC分析，含量為95%以 上； 第五步 硫磺菊素和紫鉚花素進行抑制酪氨酸酶活性評價，通過紫外色譜檢測多巴色素的生成 量，確定當硫磺菊素甲醇溶液濃度范圍在1~50yg/mL，抑制率為31.5~100%，其IC50值為3.74 yg/mL;當紫鉚花素甲醇溶液濃度范圍在1~50yg/mL，抑制率為25~98.6%，其IC50值為4.32μ g/mL;通過對抑制酪氨酸酶活性的機理研究，硫磺菊素的抑制類型為競爭型，紫鉚花素的抑 制類型為非克爭型。2. 根據(jù)權利要求所述從漆樹木粉中提取具有抑制酪氨酸酶活性的硫磺菊素和紫鉚花 素的方法，其特征在于第四步中低壓色譜填料為孔徑為60 Α，20-60 μπι的ODS C18和C8材料 中的一種，洗脫劑為甲醇、乙醇和體積比〇.5%-2%(V:V)的醋酸水中的一種或幾種的混合溶 液。3. 根據(jù)權利要求1所述的從漆樹木粉中提取具有抑制酪氨酸酶活性的硫磺菊素和紫鉚 花素的方法，其特征在于冊^：分析條件為:4.6\250臟，5以111的(：18 6〇1(1八0反相柱，流動 相為體積比為50:50(V:V)的甲醇:體積比0.5-1%(v/v)醋酸水溶液，紫外檢測器，檢測波長 為280和360nm,流速為lmL/min。
【文檔編號】C07D311/40GK105837540SQ201610154869
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年3月18日
【發(fā)明人】王成章, 陳虹霞
【申請人】中國林業(yè)科學研究院林產(chǎn)化學工業(yè)研究所