針對(duì)膀胱癌的dna甲基化生物標(biāo)志物的制作方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】針對(duì)膀脯癌的DNA甲基化生物標(biāo)志物
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 本申請(qǐng)要求于2013年5月10日遞交的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)第61/821,838號(hào)的優(yōu)先權(quán)，并 將其全部?jī)?nèi)容通過(guò)援引完整地并入本文中。
[0003] 關(guān)于受聯(lián)邦資助的研發(fā)的聲明
[0004] 本發(fā)明用美國(guó)國(guó)家癌癥研究所的基金R01CA083867-PAJ和R01CA123518-GL在政府 支持下做出。政府享有本發(fā)明的一定權(quán)利。
技術(shù)領(lǐng)域
[0005] 本發(fā)明設(shè)及膀脫癌(包括膀脫癌復(fù)發(fā))的非侵入性篩查和診斷領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0006] 在2011年，膀脫癌是患病率最高的十種男性惡性腫瘤之一，在死亡和新病例方面 分別排第四和第八(Siegel ,Ward等，2011)。最常見(jiàn)的膀脫癌癥狀是血尿，該疾病的常見(jiàn)風(fēng) 險(xiǎn)因素包括吸煙和致癌因子暴露(Morgan和Clark 2010)。非肌肉浸潤(rùn)性膀脫癌(醒IBC)占 所有病例的80%，并且可W進(jìn)一步分類(lèi)為乳頭狀(Ta)、扁平原位癌(Tis)和上皮下結(jié)締組織 侵襲型（Tl)損傷。其余病例作為肌肉浸潤(rùn)性膀脫癌(MIBC)而存在（Sobin，Gospodarowicz 等，2009,Babjulc,化Sterlinck等，2011)。醒IBC當(dāng)前的一線療法是膀脫腫瘤的經(jīng)尿道切除 (TURBT);但是，50%的患者在TURBT程序后會(huì)復(fù)發(fā)，最高的復(fù)發(fā)率出現(xiàn)在具有高風(fēng)險(xiǎn)疾病的 患者中（Mi 11自n-Ro化Iguez ,化自chi Ie-Toniolo等，2000;化el ley ,Mason等，2010)。結(jié)果， TURBT患者需要頻繁的監(jiān)視和終身的保持治療，運(yùn)使膀脫癌在患者管理方面成為花費(fèi)最高 的癌癥類(lèi)型之一。
[0007] 目前監(jiān)視和治療膀脫癌復(fù)發(fā)的金標(biāo)準(zhǔn)包括使用膀脫鏡檢和細(xì)胞學(xué)結(jié)合Bacile (^ilmette-Guerin(BCG)免疫療法和化學(xué)療法（Morgan 和Clark，2010; Bab化k, Oosterl inck 等，2011)。疾病監(jiān)視是具有挑戰(zhàn)性的，運(yùn)是因?yàn)榘蛎撶R檢具有侵入性特性，運(yùn)會(huì)帶來(lái)一定程 度的患病，并且還因?yàn)樵跈z測(cè)低級(jí)別腫瘤時(shí)尿細(xì)胞學(xué)所展現(xiàn)出的低靈敏度化intula和 化化kainen，2010)。近年來(lái)，已致力于發(fā)現(xiàn)在用非侵入性方法收集的樣品（例如尿沉淀物） 中的疾病診斷和預(yù)后的更好的標(biāo)志物(Sturgeon ,Duffy等，2010)。膀脫瘤細(xì)胞比正?；蛄?性的膀脫尿路上皮細(xì)胞具有更弱的細(xì)胞附著性，因此其脫落得更多且可W收集在尿液(尿 沉淀物）中。但是，由于特異性較差，目前提出的標(biāo)志物都未在常規(guī)臨床實(shí)踐中采用(Parker 和Spiess ,2011)。因此，亟需發(fā)現(xiàn)用來(lái)監(jiān)視TURBT患者復(fù)發(fā)的可靠標(biāo)志物，其進(jìn)而可有助于 便利和改進(jìn)疾病管理。
[000引最近已提出，尿沉淀物的縱向收集和測(cè)試可幫助評(píng)估標(biāo)志物的預(yù)后、監(jiān)視和復(fù)發(fā) 預(yù)測(cè)值化0que，Begum等，2006)。通過(guò)使用DNA甲基化分析、微衛(wèi)星標(biāo)志物和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng) 因子受體3 (FGFR3)突變測(cè)定，若干項(xiàng)研究實(shí)施了上述方法（氏抑巧始t，化pertan等，2008 ; Zuiverloon,van der Aa等，2010)。雖然運(yùn)些標(biāo)志物的靈敏度很高，但它們卻顯示出低特異 性，某些情況下與細(xì)胞學(xué)的特異性相當(dāng)（Brems-EskiIdsen,Zieger等，2010)。一種四DNA甲 基化標(biāo)志物組提供了更好的特異性；但是，其還顯示出較高比例的假陽(yáng)性結(jié)果（33%) (Zuiverloon ,Beukers等，2012)。因此，仍然需要針對(duì)膀脫癌和膀脫癌復(fù)發(fā)的更好、特異性 更高且更準(zhǔn)確的測(cè)試方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供可用于鑒定膀脫癌已復(fù)發(fā)的患者的方法、系統(tǒng)和試劑 盒。
[0010] 本發(fā)明的另一目的是提供可W用于鑒定有高風(fēng)險(xiǎn)復(fù)發(fā)膀脫癌的患者的方法、系統(tǒng) 和試劑盒。
[0011] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供可用于診斷膀脫癌的方法、系統(tǒng)和試劑盒。
[0012] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供可用于使常用于膀脫癌復(fù)發(fā)管理中的侵入性昂貴程 序的頻率最小化的方法、系統(tǒng)和試劑盒。
[0013] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種工具，所述工具可用于決定對(duì)不具有膀脫癌臨床 證據(jù)但仍保留有異常DNA甲基化的患者進(jìn)行嚴(yán)密監(jiān)視，或用于決定為運(yùn)些患者提供個(gè)體化 治療，因?yàn)檫\(yùn)些患者可能有高風(fēng)險(xiǎn)復(fù)發(fā)膀脫癌。
[0014] 本發(fā)明的一方面是一種準(zhǔn)確度和特異性高的多DNA甲基化生物標(biāo)志物方法，其用 于膀脫癌和膀脫癌復(fù)發(fā)的預(yù)后、預(yù)后及診斷。例如，本發(fā)明的一個(gè)發(fā)現(xiàn)在于，H0XA9、S0X1、 NPY、IRAK3、Z02和Ll-MET的DNA甲基化狀態(tài)與復(fù)發(fā)顯著相關(guān)且靈敏度和特異性高（全部^ 0.0 OOl )，包含SOXl、IRAK3和Ll-MET的S標(biāo)志物特征的復(fù)發(fā)預(yù)測(cè)能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于細(xì)胞學(xué)(準(zhǔn)確 度90%相比7%)。
[0015]本發(fā)明的另一方面是用于篩查患者測(cè)試樣品的高甲基化化ypermethy Iated)的 DNA甲基化生物標(biāo)志物和低甲基化化ypomethy Iated)的DNA甲基化生物標(biāo)志物的組合。
[0016] 本發(fā)明的另一方面是如下發(fā)現(xiàn):來(lái)自TURBT患者的尿沉淀物中的DNA甲基化變化能 夠用于檢測(cè)早期膀脫癌復(fù)發(fā)。具體而言，H0XA9、SOXl、NPY、IRAK3、Z02的甲基化(高甲基化標(biāo) 志物)和Ll-MET的去甲基化(低甲基化標(biāo)志物)表現(xiàn)出與腫瘤復(fù)發(fā)的正相關(guān)性，且靈敏度和 特異性高(P<〇. OOOl)。在檢測(cè)早期復(fù)發(fā)變化方面，SOXl、IRAK3和Ll-MET標(biāo)志物的組合提供 了比細(xì)胞學(xué)和膀脫鏡檢更好的分辨力。本發(fā)明的方法、試劑盒和系統(tǒng)提供了用于評(píng)估TURBT 患者的具有成本效益的非侵入性方法，如果將該方法應(yīng)用于臨床環(huán)境，其可W有助于延遲 或減少腫瘤復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)并限制諸如膀脫鏡檢等侵入性程序的使用。
[0017] 本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式是對(duì)受試對(duì)象的膀脫癌或膀脫癌復(fù)發(fā)進(jìn)行預(yù)測(cè)、預(yù)后和/ 或診斷的方法，所述方法包括：
[0018] 提供來(lái)自所述受試對(duì)象的測(cè)試樣品；
[0019] 測(cè)量所述測(cè)試樣品中的一種或多種多核巧酸的至少一部分的DNA甲基化水平，所 述一種或多種多核巧酸選自由冊(cè)乂49、5(^1、^￥、11?41(3、1^-]\^1'和202組成的組；
[0020] 將所述測(cè)試樣品中的所述一種或多種多核巧酸的DNA甲基化水平與基于對(duì)照組中 的所述一種或多種多核巧酸的DNA甲基化水平的參比DNA甲基化譜進(jìn)行比較，所述對(duì)照組的 成員具有膀脫癌;和
[0021] 基于所述比較，確定W下（1)、（2)和(3)中的至少一項(xiàng)：（1)膀脫癌是否已復(fù)發(fā)；（2) 是否存在膀脫癌復(fù)發(fā)的可能性;和(3)患者是否具有膀脫癌。
[0022] 本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式是對(duì)受試對(duì)象的膀脫癌或膀脫癌復(fù)發(fā)進(jìn)行預(yù)測(cè)、預(yù)后 和/或診斷的方法，所述方法包括：
[0023] 提供來(lái)自所述受試對(duì)象的測(cè)試樣品；
[0024] 測(cè)量所述測(cè)試樣品中的兩種或多于兩種多核巧酸的至少一部分的DNA甲基化水 平，所述兩種或多于兩種多核巧酸選自由冊(cè)乂49、50乂1、^￥、1341(3、1^-161'和202組成的組；
[0025] 基于所測(cè)量的DNA甲基化水平計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，
[00%] 將所計(jì)算的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與闊值(CUt-Off value)進(jìn)行比較，所述闊值源自基于從對(duì) 照組獲得的一種或多種生物標(biāo)志物的DNA甲基化水平的參比DNA甲基化譜，所述對(duì)照組的成 員具有膀脫癌;和
[0027] 基于所計(jì)算的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與所述闊值的比較，確定W下（1)、（2)和（3)中的至少一 項(xiàng)：（1)膀脫癌是否已復(fù)發(fā)；（2)是否存在膀脫癌復(fù)發(fā)的可能性;和(3)患者是否具有膀脫癌。
[0028] 本發(fā)明的另一實(shí)施方式是一種系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括:非暫時(shí)性計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，所 述介質(zhì)包含儲(chǔ)存在其中的計(jì)算機(jī)可讀程序代碼，所述程序代碼用于使處理器獲得測(cè)試樣品 中的H0XA9、SOX1、NPY、IRAK3、L1 -MET和Z02中的一種或多種的測(cè)得的DNA甲基化水平;將所 述測(cè)試樣品中的所述一種或多種生物標(biāo)志物的DNA甲基化水平與源自對(duì)照組的所述一種或 多種生物標(biāo)志物的參比DNA甲基化譜進(jìn)行比較，所述對(duì)照組的成員具有膀脫癌。優(yōu)選的是， 所述系統(tǒng)包括基于所述比較而產(chǎn)生的報(bào)告，所述報(bào)告提供關(guān)于W下（1)、（2)和(3)之一的指 導(dǎo)：（1)膀脫癌是否已復(fù)發(fā)；（2)是否存在膀脫癌復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn);和(3)患者是否具有膀脫癌。
[0029] 本發(fā)明的另一實(shí)施方式是一種系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括:非暫時(shí)性計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，所 述介質(zhì)包含儲(chǔ)存在其中的計(jì)算機(jī)可讀程序代碼，所述程序代碼用于使處理器獲得測(cè)試樣品 中的H0XA9、SOX1、NPY、IRAK3、L1 -MET和Z02中的兩種或多于兩種的測(cè)得的DNA甲基化水平； 計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分;將所述風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與闊值進(jìn)行比較，所述闊值源自基于從對(duì)照組獲得的一種 或多種生物標(biāo)志物的DNA甲基化水平的參比DNA甲基化譜，所述對(duì)照組的成員具有膀脫癌。
[0030] 在另一方面，本發(fā)明設(shè)及一種用于評(píng)估膀脫癌復(fù)發(fā)可能性的診斷性測(cè)試。本發(fā)明 該方面的診斷性測(cè)試通常包括：用于從尿液中提取DNA的尿液處理試劑盒，和特定用于檢測(cè) 基本由SOXl、IRAK3和Ll-MET組成的S種生物標(biāo)志物的組的DNA檢測(cè)單元。如下文的說(shuō)明性 實(shí)例所示，可W用本領(lǐng)域已知的任何方法、設(shè)備或商購(gòu)試劑盒來(lái)從尿液中提取DNA。所述S 種生物標(biāo)志的檢測(cè)可W用本領(lǐng)域已知的任何DNA甲基化檢測(cè)測(cè)定、試劑盒、設(shè)備來(lái)完成，例 如PCR、焦憐酸測(cè)序，但不限于此。
[0031] 在另一方面，本發(fā)明設(shè)及一種監(jiān)視膀脫癌復(fù)發(fā)的方法。本發(fā)明該方面的方法通常 包括W下步驟:從受試對(duì)象獲得尿樣;從所述尿樣中分離出DNA;和分析所述DNA中是否存在 甲基化的基本由SOXl、IRAK3和Ll-MET組成的生物標(biāo)志物。
[0032] 本發(fā)明的其他方面和優(yōu)點(diǎn)將從W下說(shuō)明和附圖中變得明顯。
【附圖說(shuō)明】
[0033] 圖1顯示出，在TURBT患者的尿沉淀物中測(cè)試的六種DNA甲基化標(biāo)志物的組與膀脫 腫瘤的復(fù)發(fā)正相關(guān)，并且具有高靈敏度和特異性。(A)來(lái)自腫瘤切除后的膀脫癌患者的縱向 收集的尿沉淀物樣品的時(shí)間線。每個(gè)患者的起始點(diǎn)由時(shí)刻0表示，是指研究中的第一次收集 尿樣的隨訪。用紅色標(biāo)出的隨訪表示復(fù)發(fā)時(shí)刻。(B)H0XA9、S0X1、NPY、IRAK3、Z02和L1-MET的 接受者操作特性(ROC)曲線是使用第一次復(fù)發(fā)時(shí)的TURBT患者的31個(gè)尿沉淀物和來(lái)自無(wú)復(fù) 發(fā)患者的最后一次隨訪的56個(gè)尿沉淀物制作的。AUC:曲線下面積。（C，D)對(duì)TURBT患者的長(zhǎng) 期DNA甲基化分析W及其與無(wú)復(fù)發(fā)患者(C)和已復(fù)發(fā)患者化）的臨床狀態(tài)的關(guān)系。（-):陰性； (*):疑似；（ + ):陽(yáng)性(活檢或組織學(xué)證實(shí)的膀脫腫瘤，在細(xì)胞學(xué)或膀脫鏡檢中有嚴(yán)重的異型 或乳頭狀損傷）；R:復(fù)發(fā)；BCG:Bacille (Wilmette Guerin。
[0034] 圖2顯示了 =標(biāo)志物特征在檢測(cè)腫瘤復(fù)發(fā)方面具有高靈敏度和特異性。(A)在最后 一次隨訪時(shí)無(wú)復(fù)發(fā)的TURBT患者W及復(fù)發(fā)的TURBT患者的尿沉淀物中，計(jì)算了風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分:-0.37608+0.17095 X S0X1+0.21604 X IRAK3-0.09887 X L1-MET。（B)五倍交叉驗(yàn)證顯示出了 86%的靈敏度和89%的特異性。（C)在單獨(dú)的尿沉淀物樣品中驗(yàn)證了該=標(biāo)志物模型，該樣 品包含來(lái)自在最后一次隨訪前無(wú)復(fù)發(fā)的患者的尿沉淀物(CU)和攜帶腫瘤的患者的尿沉淀 物(TU)，并確定了靈敏度和特異性。高于闊值(紅色虛線）的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分表示正分，低于闊值的 表示負(fù)分。
[0035] 圖3顯示了利用S種DNA甲基化標(biāo)志物的組合得出的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分有助于在尿液中預(yù) 測(cè)膀脫腫瘤的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。(A，B)使用=標(biāo)志物組合的DNA甲基化水平來(lái)計(jì)算兩個(gè)單獨(dú)的患者 的尿沉淀物樣品中的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，所述樣品來(lái)自無(wú)復(fù)發(fā)(A)或復(fù)發(fā)(B)的TURBT患者。V: TURBT手術(shù);R:復(fù)發(fā);風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分= -0.37608+0.17095 X S0X1+0.21604 X IRAK3-0.09887 XLl-MET。紅色虛線表示闊值。澄色箭頭代表復(fù)發(fā)前的正分。
[0036] 圖4顯示了 S種DNA甲基化標(biāo)志物的組合有助于在尿沉淀物中預(yù)測(cè)膀脫腫瘤的復(fù) 發(fā)風(fēng)