登革病毒相關的基因特異性siRNA、包含該siRNA的雙鏈寡RNA分子、和包含它們的用于抑 ...的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及登革病毒特異性的siRNA、包含所述SiRNA的雙鏈寡RNA結構，和包含它 們的用于抑制登革病毒復制的組合物，其中所述雙鏈寡RNA結構包含通過簡單共價鍵或接 頭介導的共價鍵綴合于所述雙鏈RNA(SiRNA)的兩端的親水性化合物和疏水性化合物，從而 有效地遞送入細胞，且可W通過水溶液中雙鏈寡RNA結構之間的疏水相互作用轉化成納米 顆粒。所述雙鏈寡RNA結構中包括的S iRNA優(yōu)選為登革病毒特異性的S iRNA。
[0002] 而且，本發(fā)明設及用于制備雙鏈寡RNA結構的方法，和用于抑制登革病毒復制W及 預防和治療登革病毒感染的藥物組合物，所述藥物組合物包含所述雙鏈寡RNA結構。
【背景技術】
[0003] 登革病毒是屬于黃病毒科(Flaviviridae)的病毒，其具有單鏈RNA和直徑30nm且 顯示正極性的包膜。登革病毒是世界上最常見感染人類的疾病之一。登革熱通過蚊子叮咬 或被感染的人傳播，引起高燒和皮疹伴隨肌肉和關節(jié)疼痛，且在一些病例引起出血。感染登 革出血熱的人處于喪失他們生命的高風險。此外，人雖然對感染他們的登革病毒型有永久 免疫，但對其他的病毒型不受保護。由于該原因，對于在居住在疫區(qū)的人，所有四種類型登 革病毒的感染在他們的整個一生中都有可能發(fā)生。
[0004] 據(jù)世界衛(wèi)生組織估計，登革感染者超過5000萬，全球每年出現(xiàn)超過一百萬的登革 熱感染病人。因此，登革熱被認為是主要的公共健康問題之一，但對登革病毒的預防性疫苗 尚沒有報道。東南亞是登革熱的最大疫區(qū)，其中易發(fā)生幾個血清型登革病毒的再感染。繼發(fā) 登革感染中的登革出血熱（DHF)和登革休克綜合征（DSS)是死亡的主要原因 （Qiu FX等， Bull World HealthOrgan,71:349-359,iggSshssniyom S等，Pediahics,92:111-115, 1993)。在韓國雖然尚未爆發(fā)登革熱，但預計韓國人感染登革病毒的數(shù)量將由于與登革疫區(qū) 的貿(mào)易、出國旅行、海外居住等的擴大而增加。而且，感染機會如越野旅行和重復前往登革 疫區(qū)的增加，能夠增加被登革病毒再感染的可能性，也會增加由繼發(fā)感染而發(fā)生DHF和DSS 的風險。事實上，在韓國國立衛(wèi)生研究所，從2001年至2003年6月期間對從國外回來而顯示 出懷疑為登革熱癥狀的99人進行血清學測試，發(fā)現(xiàn)有33人登革病毒抗體呈陽性。
[0005] 登革病毒具有四個血清型且基因組大小約為1化b。登革病毒基因組翻譯為單個多 蛋白（polyprotein)，然后被宿主病毒蛋白酶切割為功能性蛋白質。在先前的疫苗策略中， 因為用多價疫苗不會引起針對四種相似的血清型的有效保護，因此抑制登革病毒復制有很 大的困難。然而，在病毒基因組的基因工程方法中，對所有4種血清型有效的疫苗的研究在 進步，一些跨國制藥公司正在進行最終的臨床試驗。通常，原發(fā)性感染不致命，但出現(xiàn)不同 血清型的繼發(fā)性感染時，先前形成的抗體不會構成有效的保護，而ADCC(抗體依賴性的細胞 細胞毒性)會增加病毒感染W(wǎng)對生命造成巨大威脅。到目前為止進行的僅有一種主要手段， 即對運樣的病人施用細胞因子。同時，用于抑制基因表達的技術在開發(fā)用于治療疾病的治 療劑和驗證祀標中是重要的工具。在運些技術中，由于發(fā)現(xiàn)了RNA干擾(下文稱"RNAi")的作 用，發(fā)現(xiàn)RNA干擾對多種哺乳動物細胞中的序列特異性的mRNA起作用（Silence of the transc;ripts:RNA interference in medicine.J.Mol.Med. (2005)83:764-773)。當長鏈雙 鏈RNA被遞送入細胞時，遞送的雙鏈RNA轉變?yōu)樾「蓴_RNA(下文稱"siRNA")，所述SiRNA經(jīng)核 酸內(nèi)切酶Dicer加工為21-23個堿基對(bp)，其中所述SiRNA通過反義鏈識別和降解祀mRNA 的過程W序列特異性的方式抑制祀基因的表達(NUCLEIC-ACID T皿RAPEUTICS: BASIC PRINCIPLES AND RECENT AP化ICATI0NS.化ture Reviews Drug Discovery.2002.1,503-514)。
[0006] Bedrand等已報告，與反義寡核巧酸(ASO)相比，針對相同的祀基因，siRNA在體外 和體內(nèi)對mRNA表達有優(yōu)異的抑制作用，并且效果長期持續(xù)（Comparison of antisense oligonucleotides and siRNAs in cell culture and in vivo .Biochem.Biophys .Res .Commun. 2002.296:1000-1004)。此夕h 由于SiRNA互補地與革己 mRNA結合W序列特異性的方式調控祀基因的表達，所W與現(xiàn)有的基于抗體的藥物產(chǎn)品或化 學藥物（小分子藥物)相比，其可有利地用于更寬的應用范圍（Progress Towards in Vivo Use of siRNAs.MOLECULAR T肥RAPY.2006 13(4):664-670)。
[0007] SiRNA具有優(yōu)異效果并可用于寬的應用范圍，但為了將SiRNA開發(fā)為治療劑，需要 提高Si RM的體內(nèi)穩(wěn)定性和細胞內(nèi)遞送效力，從而將SiRM有效遞送入其祀細胞 (Harnessing in vivo siRNA delivery for drug discovery and therapeutic development.Drug Discov Today.2006Jan;11(1-2):67-73)。
[000引為了解決上述問題，已對修飾S iRNA的一些核巧酸或S iRNA的骨架W改進體內(nèi)穩(wěn)定 性從而具有針對核酸酶的抗性，或使用載體如病毒載體、脂質體或納米顆粒的技術主動進 行了一些研究。
[0009] 含有病毒載體如腺病毒或逆轉錄病毒的遞送系統(tǒng)，具有高轉染效率且?guī)в忻庖咴?性和致腫瘤性的風險。然而，非病毒載體包括納米顆粒被評價為與病毒載體相比具有低的 細胞內(nèi)遞送效力，但具有優(yōu)點，包括在體內(nèi)安全性高，祀特異性遞送，RNAi寡核巧酸有效吸 收和內(nèi)化入細胞或組織，和低的細胞毒性和免疫刺激。因此，將運些非病毒載體看作與病毒 遞送系統(tǒng)相比有前途的遞送方法（Nonviral delivery of synthetic siRNAs in vivo.J Clin Invest.2007December 3;117(12):3623-3632)。
[0010] 在非病毒遞送系統(tǒng)中使用納米載體的方法中，使用多種聚合物如脂質體、陽離子 聚合物復合物等形成納米顆粒，并且將iRNA支持于其為納米載體的運些納米顆粒上，并遞 送入細胞。在所述使用納米載體的方法中，主要使用聚合納米顆粒、聚合物膠束、脂質體復 合物等。在運些中，脂質體復合物由陽離子脂質組成并與細胞中核內(nèi)體的陰離子脂質相互 作用W脫穩(wěn)定化核內(nèi)體，由此用于將iRNA遞送進入細胞(Proc. Nat 1. Acad. Sci . 15; 93(21): 11493-8,1996)O
[0011] 此外，已知可通過將化學化合物等綴合于SiRNA的過客(有義)鏈的末端區(qū)從而具 有改進的藥代動力學特征，來提高SiRNA在體內(nèi)的效力（Nature 11:432(7014) :173-8, 2004)。在運種情況下，SiRNA的穩(wěn)定性變化取決于綴合至SiRNA的有義(過客)或反義(前導） 鏈端的化學化合物的性質。例如，與聚合物化合物如聚乙二醇(PEG)綴合的SiRNA,在陽離子 化合物存在下與SiRNA的陰離子憐酸基團相互作用W形成復合體，由此提供具有改善的 SiRNA穩(wěn)定性的載體(J Con化〇1 Release 129(2):107-16,2008)。具體地，由聚合物復合物 制成的膠束具有非常小的尺寸和與其他藥物遞送系統(tǒng)如微球和納米顆粒相比非常均勻的 尺寸分布，且為自發(fā)地形成。因此，運些膠束具有的優(yōu)點在于:制劑的質量容易管理，容易保 證其可再現(xiàn)性。
[001^ 此外，為了改進SiRNA的細胞內(nèi)遞送效力，已開發(fā)了使用SiRNA綴合物確保SiRNA的 穩(wěn)定性和增加 SiRNA的細胞膜通透性的技術，所述SiRNA綴合物通過將親水性化合物(例如 聚乙二醇(PEG),其為生物相容性的聚合物)經(jīng)由簡單共價鍵或接頭介導的共價鍵綴合于 SiRNA而獲得(韓國專利登記號883471)。然而，甚至當所述SiRNA經(jīng)化學修飾的且綴合至聚 乙二醇(PEG)(聚乙二醇化)時，其仍具有低的體內(nèi)穩(wěn)定性和如下缺點:其不容易遞送入祀器 官。為了解決運些缺點，開發(fā)了雙鏈寡核巧酸的RNA結構，其包含與寡核巧酸(尤其是雙鏈寡 RNA如S i RNA)結合的親水性和疏水性化合物。運些結構通過疏水性化合物的疏水性相互作 用形成了自組裝的納米顆粒，稱為SAMiRNA?(自組裝的膠束抑制RNA)的(見韓國專利登記號 1224828)。所述siRNA?技術相對于常規(guī)的遞送技術具有的優(yōu)點在于可W得到尺寸非常小的 同質的納米顆粒。
[OOU]具體而言，在SAMiRNA?技術中，將陽G(聚乙二醇）用作所述親水性化合物。陽G是合 成的聚合物，通常用于增加醫(yī)療藥物特別是蛋白質的溶解度，并控制藥物的藥代動力學特 性。陽G是多分散材料，一批次聚合物(one-batch POIymer ；)由不同數(shù)目的單體構成，并因此 顯示出高斯曲線形式的分子量。此外，材料的同質性W多分散性指數(shù)(Mw/Mn)表示。換句話 說，當PEG具有低分子量（3-5kDa)時，它顯示約1.01的多分散指數(shù)，且當其具有高分子量 (20kDa)時，它顯示約1.2的高多分散指數(shù)，運指示隨著PEG的分子量增加，PEG的同質性降低 (F.M.Veronese.Peptide and protein PEGylation: a review of problems and solutions. Biomaterials(2001 )22:405-417)。因此，當陽G結合到醫(yī)療藥物時存在運樣的 缺點:PEG的多分散特性被反映到綴合物，從而不容易驗證單一材料。由于運個缺點，為了產(chǎn) 生具有低多分散性指數(shù)的材料，已改進了用于合成和純化PEG的過程。然而，當PEG結合到具 有低分子量的化合物時，存在著與化合物的多分散性相關的問題，引起的問題是不容易確 認所述結合是否容易實現(xiàn)（Francesco M. Veronese和Gianfranco Pasut .PEGylation, successful a卵roach to drug delivery.DRUG DISCOV邸Y T0DAY(2005)10(21):1451-1458) O
[0014] 因此，在最近幾年，SAMiRNA?技術（即自組裝的納米顆粒）已經(jīng)改進，即，將（構成 SAMiRANA?的)雙鏈RNA結構的親水性化合物形成基本單元模塊(block),每個包含具有統(tǒng)一 的分子量的1-15個單體，且如果必要時包含接頭W使得能使用適當數(shù)目的模塊，如果需要 的話。因此，已開發(fā)了與常規(guī)的SAMiRNA?相比具有小尺寸且顯著提高分散性的新型遞送系 統(tǒng)技術。
[0015] 如上所述，目前不存在針對登革病毒大多數(shù)血清型具有優(yōu)異的治療效果的治療 劑，而常規(guī)接種疫苗方法有局限性。因此，存在對新型治療劑的治療的迫切需要。基于RNAi 技術的登革病毒感染治療劑具有被用作其替代方案的潛力，但尚未開發(fā)出基于RNAi技術的 有效的治療劑，特別是針對所有登革病毒血清型的具有效果的治療劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0016] 技術問題
[0017] 本發(fā)明人已經(jīng)為解決上述問題做了大量努力，結果發(fā)現(xiàn)了來源于登革病毒的保守 序列的SiRNA候選物W高效力抑制所有登革病毒血清型的復制，由此完成了本發(fā)明。
[0018] 因此，本發(fā)明的一個目的是提供能夠W血清型特異性的方式W非常高的效力抑制 登革病毒血清型1、2、3和4的表達的新siRNA、包含所述新SiRNA的雙鏈寡RNA結構、和制備所 述雙鏈寡RNA結構的方法。
[0019] 本發(fā)明的另一個目的是提供用于抑制登革病毒復制和/或預防和治療登革病毒感 染的藥物組合物，其包含登革病毒特異性SiRNA或包含所述SiRNA的雙鏈寡RNA的結構作為 活性成分。
[0020] 本發(fā)明的又一個目的是提供用于抑制登革病毒復制和/或預防和治療登革病毒感 染的方法，其包括使用所述登革病毒特異性siRNA、或包含所述SiRNA的雙鏈寡RNA結構。
[0021] 技術方案
[0022] 本發(fā)明提供了登革病毒特異性的SiRNA,其包含:第一寡核巧酸和第二寡核巧酸， 所述第一寡核巧酸為具有選自SEQ ID NO: 1至SEQ ID N0:88中的任一序列的有義鏈，所述 第二寡核巧酸為具有與所述有義鏈互補的反義鏈序列。
[0023] 本文中所使用的術語"siRNA"意為涵蓋所有具有一般的RNAURNA干擾)活性的材 料，對于本領域技術人員顯而易見的是，登革病毒特異性SiRNA還包括登革病毒特異性的 ShRNA 等。
[0024] SEQ ID NO: 1至SEQ ID N0:88的每個序列是登革病毒特異性的SiRNA的有義鏈序 列，其祀向于所有登革病毒血清型中存在的保守區(qū)。因此，它具有抑制所有的登革病毒血清 型復制的特性，從而表現(xiàn)出預防和/或治療登革病毒感染的效果。
[00巧]根據(jù)本發(fā)明的SiRNA優(yōu)選包含具有沈Q ID N0S:4至8、13、16、20、22、23、29、32、34、 39至42、44至47、51、52、70至72、76、77和80至82的任一項所示序列的登革病毒特異性31尺酷 有義鏈。更優(yōu)選地，其包含具有SEQ ID ^5:4、16、22、51、52、71和82中任一項所列序列的登 革病毒特異性SiRNA有義鏈。最優(yōu)選地，其包含具有SEQ ID NOS:51、52、71和82中任一項所 列序列的登革病毒特異性SiRNA有義鏈。
[00%]根據(jù)本發(fā)明的SiRNA的有義鏈或反義鏈優(yōu)選由19至31個核巧酸組成，并且根據(jù)本 發(fā)明的SiRNA包含具有選自SEQ ID NO: 1至SEQ ID N0:88的序列任一項的序列的有義鏈，和 與其互補的反義鏈。
[0027] 根據(jù)本發(fā)明的SiRNA的有義鏈或反義鏈可結合至登革病毒的血清型1、2、3和4的序 列。
[0028] 根據(jù)本發(fā)明的登革病毒特異性SiRNA具有核巧酸序列，該核巧酸序列經(jīng)設計使得 其可互補結合至編碼目的基因的mRNA，因此它可有效地抑制目的基因的